何偉丹 李志高

乳腺癌是女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，居女性惡性腫瘤死亡率的首位[1]。近年來(lái)乳腺癌的診治取得了極大進(jìn)步，其死亡率也逐漸降低[2]。早期乳腺癌的治療主要采取外科手術(shù)和化療。但對(duì)于中晚期及復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移型乳腺癌，傳統(tǒng)化療常常誘發(fā)腫瘤耐藥，治療效果并不理想[3]。

目前以基因?yàn)榍腥朦c(diǎn)探究乳腺癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制已成為乳腺癌診療的新趨勢(shì)，對(duì)于提高晚期乳腺癌患者的生存率具有十分重要的意義[4-5]。有研究提出，基因檢測(cè)可作為制定早期乳腺癌治療方案的輔助手段[6]。人表皮生長(zhǎng)因子受體-2(HER2)是迄今為止研究比較透徹的乳腺癌基因之一[7]。纖維鞘相互作用蛋白1(Fibrous sheath interacting protein 1，F(xiàn)SIP1)是一種癌/睪丸抗原基因，在乳腺癌細(xì)胞中高表達(dá)。FSIP1可以與HER2結(jié)合，增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力[8]。然而，F(xiàn)SIP1在乳腺癌中的生物學(xué)作用尚未完全闡明[9]。本研究主要探究FSIP1在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的生物學(xué)作用，從細(xì)胞學(xué)層面為乳腺癌的治療和研究提供一定的理論參考。

1 材料和方法

1.1 乳腺癌組織樣本和病例資料收集

本研究選取2004年1月—2018年12月于哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院確診的404例乳腺癌患者癌組織和癌旁正常乳腺組織，收集的組織樣本包括60例臨床Ⅰ/Ⅱ期(14.85%)、118例Ⅲ期(29.21%)和226例Ⅳ期(55.94%)乳腺癌。病例入選標(biāo)準(zhǔn)如下：(1)女性，通過(guò)手術(shù)切檢或穿刺活檢病理確診為乳腺癌，術(shù)后病理與穿刺病理結(jié)果不一致時(shí)以術(shù)后病理為準(zhǔn)；(2)排除雙側(cè)乳腺癌、有其他腫瘤病史患者及拒絕參與者；(3)所有臨床樣本需經(jīng)3名病理科醫(yī)生獨(dú)立診斷，癌旁組織需距癌組織切緣3 cm以上，鏡下切緣檢測(cè)確保切緣處無(wú)癌細(xì)胞或異型細(xì)胞。收集符合納入標(biāo)準(zhǔn)患者的病例資料。收集的臨床病例資料包括患者姓名、年齡、性別、婚育史、既往史、家族史、激素藥物應(yīng)用史、腫瘤的生長(zhǎng)部位、腫瘤數(shù)目及形態(tài)、區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、臨床病理分期、腫瘤病理診斷、病理類(lèi)型及分級(jí)、各項(xiàng)免疫組化指標(biāo)、手術(shù)方式等情況。采取電話(huà)隨訪結(jié)合門(mén)診復(fù)查病歷資料的方式對(duì)入選患者進(jìn)行隨訪，隨訪日期為2004年1月—2018年12月?；颊咝g(shù)后第一天至其最終死亡時(shí)間或者到隨訪終止時(shí)間記為總生存時(shí)間(OS)。本研究經(jīng)哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院倫理委員會(huì)審批同意，標(biāo)本庫(kù)中存儲(chǔ)的所有標(biāo)本于實(shí)驗(yàn)展開(kāi)前均已獲得患者本人簽署的知情同意書(shū)。

1.2 免疫組織化學(xué)

將石蠟包埋的乳腺癌及癌旁組織切片浸入二甲苯中以除去石蠟，然后用乙醇梯度重新水化。使用3% H2O2阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性，采用檸檬酸鈉法對(duì)組織切片進(jìn)行抗原修復(fù)?？乖迯?fù)后的石蠟切片自然冷卻至室溫。隨后用含有5%山羊血清的封閉液進(jìn)行封閉，然后用抗FSIP1抗體(稀釋比例為1∶200)在濕盒中4℃孵育過(guò)夜。用PBS洗滌后，將切片與HRP偶聯(lián)的二抗(1∶500)在室溫下孵育1 h。隨后滴加DAB工作液進(jìn)行復(fù)染，經(jīng)梯度脫水后光學(xué)顯微鏡下觀察染色結(jié)果。對(duì)染色結(jié)果進(jìn)行評(píng)分，評(píng)分過(guò)程由3名副高職以上的病理科醫(yī)生以盲評(píng)法完成。陽(yáng)性染色細(xì)胞數(shù)<5%記為“陰性”。陽(yáng)性染色細(xì)胞百分比評(píng)分：0分，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)<5%；1分，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)5%～25%；2分，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)26%～50%；3分，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)>50%。細(xì)胞染色強(qiáng)度評(píng)分：0分，陰性；1分，弱染色；2分，中染色；3分，強(qiáng)染色。總分?jǐn)?shù)是由陽(yáng)性比例得分乘以細(xì)胞染色強(qiáng)度得分所得出的最終得分(總分0～9分)?？偡帧?的組織切片為FSIP1高表達(dá)，總分<4的則歸為低表達(dá)[10]。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)和慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)

乳腺癌細(xì)胞系MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-435、SK-BR-3、T-47D及正常乳腺上皮細(xì)胞(HMECs)MCF-10A于含有10% FBS，100 mg/mL鏈霉素和100 IU/mL青霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)。每隔24 h更換培養(yǎng)液。采用CRISPR/CAS9技術(shù)對(duì)FSIP1高表達(dá)乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231和SK-BR-3中的FSIP1基因進(jìn)行敲除，慢病毒的轉(zhuǎn)染參照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。GFP標(biāo)記的CAS9-sgRNA作為陰性對(duì)照。

1.4 Western blot實(shí)驗(yàn)

收集經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)的乳腺癌細(xì)胞系MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-435、SK-BR-3、T-47D和HMECs(MCF-10A)及敲除FSIP1基因的MDA-MB-231和SK-BR-3細(xì)胞系，加入RIPA裂解緩沖液進(jìn)行處理，提取細(xì)胞中總蛋白，采用BCA法測(cè)定蛋白濃度。根據(jù)不同濃度進(jìn)行定量，聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白后采用濕轉(zhuǎn)方法將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5% BSA室溫下封閉1 h。滴加一抗(稀釋比例為1∶1 000)，4℃孵育過(guò)夜。經(jīng)TBST徹底洗去未結(jié)合的一抗后再常溫下孵育二抗(稀釋比例為1∶5 000)1 h，經(jīng)TBST充分洗膜后，加入ECL顯影液完成顯色，化學(xué)發(fā)光儀拍照記錄。采用Image J進(jìn)行蛋白定量分析，以各蛋白的灰度值與內(nèi)參GAPDH的灰度比值進(jìn)行蛋白定量分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

1.5 細(xì)胞遷移和侵襲分析

選取8 μm孔徑的24孔Transwell小室評(píng)估乳腺癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力。預(yù)先在Transwell小室的底部加入200 μL Matrigel與無(wú)血清培養(yǎng)液的混合物并平鋪于小室上層(按照1∶4稀釋)，置于37℃孵箱孵育1 h以使其充分凝固。將敲除FSIP1的MDA-MB-231和SK-BR-3細(xì)胞系及對(duì)應(yīng)的陰性對(duì)照組細(xì)胞消化后離心棄去培養(yǎng)液，使用無(wú)血清培養(yǎng)基重懸，并調(diào)整細(xì)胞密度至1×105/mL。頂部小室加入200 μL細(xì)胞懸液，在小室下槽加入600 μL含有10%血清的培養(yǎng)基，于37℃下孵育24 h 后，擦除小室上層未穿過(guò)膜的細(xì)胞，將底部小室中的細(xì)胞用甲醇固定、結(jié)晶紫染色，并用顯微鏡進(jìn)行定量分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

使用GraphPad Prism 7軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，數(shù)據(jù)滿(mǎn)足正態(tài)分布，且方差齊，組間比較使用配對(duì)t檢驗(yàn)及單因素方差分析；FSIP表達(dá)與各臨床病理參數(shù)的關(guān)系使用卡方檢驗(yàn)進(jìn)行分析；生存曲線用Kaplan-Meier方法繪制，生存曲線的比較通過(guò)Log-rank檢驗(yàn)進(jìn)行；OS的影響因素分析采用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 FSIP1在乳腺癌細(xì)胞系和乳腺癌組織中的表達(dá)情況

與HMECs(MCF-10A)相比，各乳腺癌細(xì)胞系中FSIP1蛋白的表達(dá)水平均顯著升高(P<0.01)(圖1A，B)。此外，采用免疫組化法對(duì)6對(duì)乳腺癌組織及其癌旁組織中FSIP1的表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明乳腺癌組織中FSIP1的表達(dá)水平明顯高于癌旁正常組織(P<0.01)(圖1C，D)。

圖1 FSIP1在乳腺癌細(xì)胞系和癌旁正常組織中的表達(dá)情況Figure 1 The over-expression of FSIP1 protein in breast tumor tissues and breast cancer cell linesNote：A-B.The expression of FSIP1 in breast cancer cell lines and normal cell line was detected by Western blot；C-D.The expression of FSIP1 in 6 pairs of breast cancer and adjacent non-cancerous tissues was detected by IHC.**P<0.01，compared with the HMECs or paratumor tissue.

2.2 FSIP1過(guò)表達(dá)與患者OS的關(guān)系

與FSIP1低表達(dá)乳腺癌患者相比，F(xiàn)SIP1高表達(dá)乳腺癌患者OS顯著縮短(中位OS：73個(gè)月vs.82個(gè)月，P<0.001)(圖2)。通過(guò)多因素Cox回歸將FSIP1與患者年齡、TNM分期納入回歸分析中，結(jié)果顯示FSIP1高表達(dá)可作為OS的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(HR=2.39，95%CI：1.88～3.05，P<0.001)。

圖2 在乳腺癌患者中FSIP1高表達(dá)與腫瘤惡性程度和較短的總生存期有關(guān)Figure 2 The high expression of FSIP1 protein was correlated with shorter overall survival of breast cancer patients

分析乳腺癌患者腫瘤組織中FSIP1表達(dá)水平是否與患者臨床疾病分期的有關(guān)，結(jié)果顯示FSIP1高表達(dá)與乳腺癌患者臨床分期較高有關(guān)(表1)(P<0.001)，同時(shí)FSIP1高表達(dá)與細(xì)胞增殖標(biāo)記物Ki-67高表達(dá)有關(guān)(P<0.001)(表1)。

表1 乳腺癌患者FSIP1表達(dá)與臨床特征的關(guān)系[n(%)]Table 1 Basic information scale for patients[n(%)]

2.3 FSIP1對(duì)乳腺癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響

為了進(jìn)一步闡明FSIP1的致癌功能，Western blot結(jié)果顯示敲除FSIP1基因后乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231和SK-BR-3中FSIP1蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.01)(圖3A)。

細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，敲除FSIP1基因后乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231和SK-BR-3的遷移和侵襲能力顯著降低(P<0.01)(圖3B-3D)。

圖3 敲除FSIP1基因?qū)θ橄侔┘?xì)胞遷移和侵襲能力的影響Figure 3 The FSIP1 gene knockout attenuated capabilities of migration and invasion in cancer cellsNote：A.The FSIP1 gene knockout was confirmed in MDA-MB-231 cells and SKBR3 cells by Western blot；B.The results of cell migration and invasion in MDA-MB-231 cells and SKBR3 cells；C and D.The results of statistical analysis for cell migration and invasion in MDA-MB-231 cells and SKBR3 cells.*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001(n=3).

3 討論

目前對(duì)于中晚期以及復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移型乳腺癌仍然缺乏有效的治療手段[11]，深入探究乳腺癌的致病機(jī)理以及對(duì)應(yīng)的分子生物學(xué)機(jī)制，對(duì)于提高晚期乳腺癌患者的生存率至關(guān)重要[12-13]。FSIP1是最初在酵母雙雜交篩選中發(fā)現(xiàn)并鑒定的一種腫瘤睪丸抗原，其表達(dá)傾向于睪丸組織并在腫瘤細(xì)胞中重新激活并賦予細(xì)胞有絲分裂穩(wěn)健性[14]。研究表明，F(xiàn)SIP1在乳腺癌細(xì)胞中高表達(dá)，并且能夠調(diào)節(jié)乳腺癌細(xì)胞自噬[15]，通過(guò)促進(jìn)自噬增強(qiáng)了對(duì)多西他賽等化療藥物的敏感性[16]。FSIP1可直接結(jié)合HER2胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域以促進(jìn)乳腺癌進(jìn)展[8]。然而，目前對(duì)于FSIP1在乳腺癌中的作用機(jī)制仍不完全清楚，其在乳腺癌中的生物學(xué)作用及影響仍有待進(jìn)一步的研究與探討。

在本研究中，通過(guò)免疫組化及Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)乳腺癌組織及細(xì)胞中的FSIP1顯著高表達(dá)。為探究FSIP1高、低表達(dá)是否與乳腺癌患者臨床病理特征有關(guān)，對(duì)404例既往就診于我院的乳腺癌患者組織切片中FSIP1的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)并回顧性分析患者的病例資料，結(jié)果顯示晚期乳腺癌患者的FSIP1表達(dá)水平明顯較高，并且高表達(dá)FSIP1的乳腺癌患者常伴隨較短的OS。同時(shí)也驗(yàn)證了FSIP1高表達(dá)與細(xì)胞增殖標(biāo)志物Ki-67的陽(yáng)性率相關(guān)。以上結(jié)果表明，F(xiàn)SIP1在乳腺癌組織及細(xì)胞中高表達(dá)，并且與乳腺癌患者的不良預(yù)后密切相關(guān)。

細(xì)胞的癌變及惡性轉(zhuǎn)化是一個(gè)多步驟的過(guò)程。乳腺癌干細(xì)胞驅(qū)動(dòng)乳腺癌的原始致癌性、局部侵襲和遷移傾向，并且具有自我更新、多向分化和增殖潛能[17]。乳腺癌細(xì)胞需要重新編程能量代謝，對(duì)生長(zhǎng)抑制信號(hào)不敏感，不受限制的生長(zhǎng)信號(hào)，無(wú)限的復(fù)制潛能，細(xì)胞凋亡，逃避免疫檢測(cè)，組織侵襲和轉(zhuǎn)移以及持續(xù)的血管生成，共同促進(jìn)了細(xì)胞的癌變及進(jìn)展過(guò)程[18-20]。為進(jìn)一步探究FSIP1在乳腺癌中的生物學(xué)功能，本研究采用基于CRISPR/CAS9的慢病毒技術(shù)敲除兩個(gè)具有高內(nèi)源性FSIP1表達(dá)的乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231和SK-BR-3細(xì)胞中的FSIP1基因，并通過(guò)Western blot實(shí)驗(yàn)對(duì)敲除結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。通過(guò)遷移實(shí)驗(yàn)和侵襲實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)，敲除FSIP1的乳腺癌細(xì)胞其遷移和侵襲能力明顯低于對(duì)照組。這些實(shí)驗(yàn)充分說(shuō)明了敲除FSIP1基因能夠顯著降低乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力，從而證明FSIP1基因在促進(jìn)乳腺癌的發(fā)生發(fā)展中起到關(guān)鍵作用。

綜上所述，本研究通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)了FSIP1是乳腺癌潛在的促癌基因，其在乳腺癌組織中表達(dá)顯著高于癌旁組織，并且與乳腺癌患者惡性程度相關(guān)，導(dǎo)致患者不良預(yù)后。有望成為評(píng)估乳腺癌患者預(yù)后的獨(dú)立生物標(biāo)志物以及乳腺癌治療中潛在的分子靶點(diǎn)。乳腺癌的治療任重而道遠(yuǎn)，我們需要更為深入地探究乳腺癌發(fā)生發(fā)展的生物學(xué)機(jī)制并為開(kāi)展針對(duì)乳腺癌靶向治療的新藥研究奠定理論基礎(chǔ)，從而為乳腺癌的治療提供新策略。