劉嘉銘 崔逸峰 陸朝陽

肝細胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)是指起源于肝臟上皮細胞的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，是原發(fā)性肝癌中最常見的病理類型，也簡稱肝癌。據2020全球癌癥統(tǒng)計數(shù)據顯示，肝細胞癌是第七大常見惡性腫瘤，同時是癌癥相關死亡的第二大原因[1]。目前肝癌的治療措施主要包括手術、介入、靶向、免疫治療等，但面臨有效率低、藥物耐藥和腫瘤復發(fā)等問題[2]，探索新的治療方法成為肝癌研究的重點?；倍巧L在槐木上的一種菌，屬于槐栓菌，是一種傳統(tǒng)中醫(yī)藥材，具有扶正固本、活血消癥的作用[3]。其主要活性成分為多糖蛋白，是由6種單糖組成的雜多糖結合18種氨基酸構成的蛋白質。槐耳顆粒目前已列入醫(yī)學本科教材以及肝癌診療指南中，是治療肝細胞癌的有效藥物[4]。

目前，中藥靶向肝病已引起了人們的廣泛關注?；倍甯啵谴袒钡囊环N提取物，具有較強的自由基清除和免疫調節(jié)作用，本文對槐耳清膏治療肝癌進行基礎研究，證明通過槐耳清膏治療后，可以抑制肝癌細胞增殖和轉移，并探尋其潛在機制。

1 資料與方法

1.1 細胞和試劑

肝癌細胞系HCCLM3購自中國科學院上海生命科學院細胞凍存中心；聚合酶鏈反應所用引物購自上海吉凱基因公司；SYBR購自ROCHL公司；DMEM培養(yǎng)液和胎牛血清購自Gibco公司；TFAM蛋白、Akt蛋白、磷酸化Akt蛋白一抗購自美國Abcam公司；蛋白印跡用二抗購自中杉金喬公司；CCK-8試劑盒購自東仁化學科技有限公司；槐耳清膏由蓋天力藥業(yè)提供。

1.2 細胞和槐耳清膏

人肝癌細胞系HCCLM3用含有10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)孵箱環(huán)境設置為37℃，含有5% CO2。每日觀察細胞生長狀態(tài)以及培養(yǎng)基顏色。當細胞生長到70%密度時，去除舊培養(yǎng)基，用PBS清洗細胞2～3次，用胰蛋白酶充分消化細胞后，收集消化完全的細胞，以1 000 r/min離心3 min，去除多余的胰酶，用完全培養(yǎng)液重新懸浮細胞后進行細胞的傳代。

槐耳清膏為棕褐色帶有中藥香氣的膏狀物體，將槐耳清膏溶解于無菌的蒸餾水中，使其最終濃度達到100 mg/mL。充分溶解后放入離心機內，以3 000 r/min的速度離心10 min，將上清用0.22 μm濾器過濾除菌，放入4℃冰箱內備用。

實驗均以重復三次作為標準。正常培養(yǎng)的細胞作為對照組(Con組)，加入3 mg/mL槐耳清膏培養(yǎng)的細胞作為槐耳清膏 3 mg/mL組，加入6 mg/mL槐耳清膏培養(yǎng)的細胞作為槐耳清膏 6 mg/mL組。

1.3 CCK-8實驗

將細胞按照1 000個/孔，接種在96孔板中，放入37℃，含有5%CO2的孵箱中孵育過夜，令細胞貼壁；將CCK-8液與DMEM培養(yǎng)液按照1∶9的比例配制成CCK-8反應液，將CCK-8反應液加入含有細胞的96孔板中，孵箱內避光孵育2 h，用酶標儀測定450 nm處的吸光度，連續(xù)測量5天，將所得數(shù)據繪制成折線圖。

1.4 克隆形成實驗

將處于對數(shù)生長期的細胞，按照2 000個/板，接種到6 cm培養(yǎng)皿內，加入足量的DMEM完全培養(yǎng)基，十字法充分搖勻后平穩(wěn)地放入37℃，含有5% CO2的孵箱內，每隔3天進行觀察，觀察培養(yǎng)液顏色、細胞是否污染，細胞克隆團的大小，至14天，將培養(yǎng)液去掉后用PBS清洗細胞2～3次，室溫下用4%甲醇固定細胞30 min，1%結晶紫染色液對細胞進行染色20 min，全程避光。最后用流水將多余的結晶紫洗凈并晾干，數(shù)碼相機拍照，記錄克隆數(shù)目。

1.5 Transwell實驗

應用Transwell小室進行細胞轉移實驗。將對數(shù)生長期的細胞，按照3×104個/孔接種到Transwell小室，小室放入Transwell專用24孔板中，小室上室內加入500 μL不含血清的培養(yǎng)基，下室中加入1 mL含有趨化因子或20%胎牛血清的培養(yǎng)基。放入37℃，含有5% CO2的孵箱內孵育24 h，隨后室溫下用4%甲醇固定細胞30 min，1%結晶紫染色液對細胞進行染色20 min，全程避光。用水將多余的結晶紫洗凈并晾干，上室內的細胞用濕棉簽擦去。最后樹膠封片，顯微鏡下觀察穿過膜孔的細胞并計數(shù)。

1.6 編碼基因微陣列分析

使用微陣列分析V4.0(Illumina，CA，USA)檢測對照組和槐耳清膏(3 mg/mL)組之間HCCLM3的mRNA表達差異。利用第四代測序技術，可以檢測到近24 306個mRNA。此外，微陣列雜交過程遵循制造商的標準技術程序(Illumina，CA，USA)。該過程包括RNA樣本提取、RNA樣本純化、RNA轉錄、cDNA標記和cDNA標記到mRNA微陣列V4.0(芯片規(guī)格：4×180 K，每個mRNA≥2個探針)。將芯片中包含的所有mRNA的靶向序列進行比較，并與權威數(shù)據庫ENSEMBL、NCBI進行合并。采用層次聚類分析芯片測序數(shù)據，篩選差異表達mRNA應符合以下原則：差異表達的閾值絕對值>2，同時，t檢驗所得P<0.05。

1.7 蛋白質免疫印跡實驗(Western blot)

將5×107個細胞用胰蛋白酶消化下來后，加入蛋白裂解液，充分裂解后，在4℃環(huán)境下放入離心機內，以12 000 r/min的速度離心15 min，收集上清蛋白與上樣緩沖液混合后，以每孔40 mg蛋白樣品進行上樣電泳、電轉至硝酸纖維素膜(NC)上后用脫脂牛奶封閉。TFAM蛋白一抗按照1∶1 000稀釋，4℃過夜孵育一抗；次日加入二抗(按照1∶1 000稀釋)孵育后進行顯影。以GAPDH作為內參。實驗均以重復三次作為標準。

1.8 聚合酶鏈反應

提取細胞樣本的總RNA，提取完RNA之后進行濃度和純度的測定并記錄，隨后用逆轉錄試劑盒將RNA逆轉錄成cDNA；RNA放入-80℃冰箱內保存，cDNA放入-20℃冰箱內備用。將SYBR、引物、cDNA以及無酶RNA級別的水按照一定比例混合，配置20 μL的體系，放進Real-time PCR擴增儀系統(tǒng)(ABI公司，7500型)，根據每個樣本的CT值計算2-△△CT，進行比較，以GAPDH作為內參。實驗均以重復三次作為標準

1.9 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 槐耳清膏對肝細胞癌細胞系HCCLM3增殖的抑制作用

CCK-8法檢測結果表明，從第三天開始槐耳清膏能夠抑制細胞活力，這種作用隨著濃度的增加，抑制能力明顯加強(P<0.05)(圖1A)。此外，克隆形成實驗進一步驗證了槐耳清膏對細胞增殖的抑制作用(圖1B、圖1C)。

圖1 槐耳清膏能夠抑制HCCLM3細胞的增殖能力Figure 1 Aqueous Huaier extract inhibited the proliferation of HCCLM3 cellsNote：A.Cell viability of HCCLM3 cells by CCK-8 assay；B.The colony formation of HCCLM3 cells(up)；The statistical results of the colony formation(down).*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001.

2.2 槐耳清膏對肝細胞癌轉移的抑制作用

Transwell實驗顯示槐耳清膏對肝癌細胞轉移能力的抑制也隨著藥物濃度的提高而增強(P<0.01)(圖2)。

圖2 槐耳清膏能夠抑制HCCLM3的轉移能力Figure 2 Aqueous Huaier extract inhibited the metastasis of HCCLM3 cellsNote：A.The metastasis of HCCLM3 cells；B.The statistical results of the metastasis in HCCLM3 cells.**P<0.05；***P<0.001.

2.3 槐耳清膏對TFAM表達的抑制作用

選用三組實驗組2的HCCLM3細胞和三組對照組的HCCLM3細胞，高通量測序結果發(fā)現(xiàn)486個差異表達基因，其中有317個基因在實驗組表達上調，115個基因表達下調(圖3A)，其中表達改變最明顯的是TFAM。PCR實驗以及Western blot實驗再次驗證，證實槐耳清膏可以明顯降低肝癌細胞中TFAM的表達(P<0.01)(圖3B、3C)。

圖3 槐耳清膏下調TFAM的表達Figure 3 Aqueous Huaier extract down-regulated TFAM expression in HCCLM3 cellsNote：A.Heat map of mRNA in HCCLM3 cells treated with or without Huaier；B.The expression of TFAM mRNA in HCCLM3 cells after Huaier treatment；C.The expression of TFAM protein in HCCLM3 cells after Huaier treatment.**P<0.01.

2.4 槐耳清膏對肝癌細胞系HCCLM3中Akt信號通路激活的抑制作用

因此我們通過Western blot實驗結果發(fā)現(xiàn)通過槐耳清膏刺激HCCLM3細胞后，與對照組HCCLM3細胞相比，p-Akt的蛋白表達含量要明顯降低，而總Akt的含量沒有改變(圖4)。

圖4 槐耳清膏抑制Akt通路的激活Figure 4 Aqueous Huaier extract inhibited the activation of Akt pathways in HCCLM3 cellsNote：The expression of Akt and p-Akt protein after Huaier treatment in HCCLM3 cells.

3 討論

肝細胞癌是世界上最常見的癌癥之一，也是惡性腫瘤相關死亡的主要原因。我國肝癌患者約占全球的一半，主要因為我國乙肝病毒感染的患者居多[7]。近年來，多個基礎研究顯示，槐耳可以通過多途徑發(fā)揮抗肝癌作用，如抑制癌細胞增殖、促進癌細胞凋亡、抗腫瘤血管生成、調節(jié)免疫等。

本研究通過CCK-8實驗、克隆形成實驗以及Transwell實驗證實槐耳清膏可以通過藥物濃度依賴性來抑制肝細胞癌的增殖和轉移；高通量測序發(fā)現(xiàn)槐耳清膏刺激HCCLM3細胞后，可以使多個編碼基因的表達發(fā)生變化，其中TFMA的表達改變尤為顯著；先前有研究表明，在肺癌中，槐耳清膏藥可以通過Akt信號通路抑制肺癌的增殖和轉移[6]。但是，在肝細胞癌中，其是否通過Akt信號通路干擾肝細胞癌的增殖和轉移仍不清楚。同時也有研究表明TFAM與Akt通路有一定的聯(lián)系[7]。更重要的是，本研究通過Western blot實驗檢測蛋白表達發(fā)現(xiàn)槐耳清膏刺激的HCCLM3細胞中p-Akt蛋白的含量，較對照組HCCLM3細胞中的含量明顯降低，說明槐耳清膏可能是通過抑制TFMA的表達進而抑制Akt通路的激活來抑制肝癌細胞的增殖和轉移。

TFAM是由核基因編碼分子量約為25 kDa大小的蛋白，屬于HMG-box蛋白家族的成員之一，它通過與線粒體基因上的D-環(huán)結構結合來激活線粒體DNA的轉錄，TFAM是調控線粒體DNA轉錄及維持線粒體DNA正?？截悢?shù)的重要調控因子[8-10]。TFAM的缺失可導致線粒體DNA拷貝數(shù)的減少及嚴重的呼吸鏈缺陷，從而引起線粒體功能障礙及一系列相關疾病。眾所周知，受損的線粒體在細胞內產生過量的線粒體活性氧(ROS)進而導致細胞器損傷和線粒體硫醇氧化導致ATP產量下降。受損的線粒體通透性增加，釋放細胞毒素和促炎物質，如細胞色素C，mtDNA，啟動促凋亡級聯(lián)反應。mtDNA拷貝數(shù)減少已在乳腺癌[11]、腎盂癌[12]以及肝細胞癌[13]中報道。由于mtDNA的轉錄和復制需要核DNA編碼的蛋白質，其中TFAM被認為也有助于腫瘤的發(fā)生。槐耳則消除了活性氧(ROS)超載，恢復了氧化還原穩(wěn)態(tài)，保護細胞免受凋亡[14]。

Akt信號通路在調節(jié)細胞過程中扮演著重要的角色，并且在惡性腫瘤中經常功能失調，這是癌癥常有的特征[15]。此外，在人類惡性腫瘤中經常檢測到激活這些酶的突變，從而導致腫瘤增殖。PI3K在質膜上將PIP2轉化為PIP3，隨后磷酸化并激活Akt[16]。Akt活化后磷酸化幾個下游效應器，進而調節(jié)不同類型癌癥的多種生物過程。而過度激活會導致細胞周期進程異常、增殖、轉移、黏附和運動性改變，抑制細胞凋亡，誘導血管生成等[17]。一些研究已經證明PI3K/Akt信號通路參與多種惡性腫瘤的發(fā)生，包括肝細胞癌[18]。

綜上所述，本研究我們發(fā)現(xiàn)槐耳清膏可能通過TFAM/Akt通路維持線粒體的正常功能，發(fā)揮其細胞保護作用。為進一步闡明槐耳顆粒在抗肝細胞癌發(fā)生發(fā)展中的機制提供了一個新的理論依據，然而槐耳清膏具體是如何通過TFAM/Akt通路抑制肝細胞癌的增殖和轉移，其詳細機制有待于進一步的研究加以驗證。因此，本研究的初步結果說明，槐耳清膏可能是一種很有前途的治療肝癌的補充療法，其詳細機制可能是通過抑制TFAM/Akt信號通路來實現(xiàn)的。