劉 永， 徐建忠， 蔣 敏， 倪玲娜， 凌 揚(yáng)

(蘇州大學(xué)附屬常州腫瘤醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，江蘇省常州市213032)

結(jié)直腸癌是消化系統(tǒng)高死亡疾病之一，其診斷多見于中晚期且轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)較高，其5年存活率不足55%[1]，故結(jié)直腸癌診斷指標(biāo)及治療靶點(diǎn)成為目前研究的熱點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)，叉頭框C1(fork head boxC1，F(xiàn)OXC1)轉(zhuǎn)錄因子基因參與肝細(xì)胞癌、口腔鱗狀細(xì)胞癌、乳腺癌多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展，且FOXC1表達(dá)水平與腫瘤的不良預(yù)后息息相關(guān)[2-3]。位于FOXC1基因啟動(dòng)子上游的長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)轉(zhuǎn)錄體，簡(jiǎn)稱為FOXCUT，為新發(fā)現(xiàn)的lncRNA，其與相鄰的FOXC1蛋白編碼基因相互作用，以一種“l(fā)ncRNA-mRNA”基因在腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用[4]。本研究重點(diǎn)探析lncRNA FOXCUT和FOXC1在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及其相關(guān)性，為結(jié)直腸癌研究提供新的線索及靶點(diǎn)。

1 資料和方法

1.1 一般資料

收集本院2013年1月—2017年12月75例結(jié)直腸癌原發(fā)病灶組織標(biāo)本及配對(duì)癌旁正常組織標(biāo)本，術(shù)前未開展放射或化學(xué)治療，樣本新鮮取材置于-80 ℃環(huán)境凍存。本研究樣本使用均遵循倫理學(xué)規(guī)范，報(bào)醫(yī)院醫(yī)學(xué)理論委員會(huì)批準(zhǔn)，患者知情同意，臨床資料齊全，病理學(xué)確診符合結(jié)直腸癌診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]，均為腺癌(管狀腺癌68例，黏液腺癌7例)。

1.2 免疫組織化學(xué)法

樣本組織石蠟包埋，經(jīng)切片脫蠟水化；消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性，3次PBS沖洗，采用EDTA(pH9.0)，微波抗原修復(fù)，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，常規(guī)脫水、透明、干燥、封片。PBS緩沖液代替一抗作陰性對(duì)照，以在預(yù)實(shí)驗(yàn)中已反復(fù)證實(shí)的FOXC1棕黃色顆粒顯色作陽(yáng)性對(duì)照，Image Pro Plus圖像分析。

1.3 Western blot

取組織細(xì)胞總蛋白SDS-PAGE電泳，100 V冰浴轉(zhuǎn)膜50 min，將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，TBST緩沖液配制的封閉液中封閉，TBST洗滌，ECL曝光、定影，Quantity one軟件顯色分析。

1.4 Real Time PCR

Trizol法進(jìn)行總RNA提取，根據(jù)TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說(shuō)明，將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，F(xiàn)OXC1引物設(shè)計(jì)：Forward 5′-GGCGAGCAGAGCTACTACC-3′，Reverse 5′-TGCGAGTACACGCTCATGG-3′；FOXCUT引物設(shè)計(jì)：Forward 5′-GTCGCACCGATGACTAACG-3′，Reverse 5′-GCCCTGAAAGCCGAACTG-3′，PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增熒光定量檢測(cè)，PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)孵育60 s、95 ℃擴(kuò)增10 s,45個(gè)循環(huán)，60 ℃ 30 s，65 ℃溶解曲線，基于β-actin內(nèi)參，以2-△△Ct法計(jì)算mRNA表達(dá)量。

1.5 siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞后的RNAi實(shí)驗(yàn)

選用X-Tregen介導(dǎo)siRNA的轉(zhuǎn)染，按照X-Tregen轉(zhuǎn)染試劑盒說(shuō)明操作siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞，F(xiàn)OXC1 siRNA序列：Forward 5′-RCRCRARGRARURARARCRARCR GRURARARGRURURURCRURURCTT-3′，Reverse 5′-TGCGAGTACACGCTCATGG-3′；FOXCUT引物設(shè)計(jì)：Forward 5′-RARARGRARARGRARARARCRURURARCR GRURGRURURARURCRURGRGRARG-3′；FOXCUT siRNA序列：Forward 5′-RGRARARURGRGRARGRARA RCRURARARGRARCRARARURURARUCT-3′，Reverse 5′-RARGRARURARARURURGRURCRURURARGRU RURCRURCRCRARURURCRGRG-3′。37 ℃、5%CO2環(huán)境，10 mL DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，備制FOXCUT、FOXC1細(xì)胞懸液，SW480細(xì)胞傳代生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期時(shí)PBS沖洗、消化、重懸細(xì)胞至5×104個(gè)/mL，接種于6孔板(20 μL/孔)，并在6孔板中加入3 mL DMEM底液，每組重復(fù)2孔。待細(xì)胞融合達(dá)70%，轉(zhuǎn)染24 h后取NC siRNA、FOXCUT siRNA、FOXC1 siRNA組SW480細(xì)胞，采用移液槍頭(1 mm直徑)進(jìn)行劃痕觀察，并分別采集24 h與48 h圖像。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 兩組lncRNA FOXCUT表達(dá)水平的比較

lncRNA FOXCUT高表達(dá)率結(jié)直腸癌組織為82.67%(62/75)，癌旁正常組織為14.67%(11/75)，結(jié)直腸癌組織高于癌旁正常組織(P<0.05)。

2.2 lncRNA FOXCUT表達(dá)與結(jié)直腸癌患者病理特征的關(guān)系

lncRNA FOXCUT表達(dá)與結(jié)直腸癌患者TNM分期、AJCC分期、分化程度、遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等病理特征相關(guān)(P<0.05；表1)。

表1 lncRNA FOXCUT表達(dá)與結(jié)直腸癌患者病理特征的關(guān)系 單位：例(%)

2.3 兩組FOXC1、FOXCUT表達(dá)水平的比較

結(jié)直腸癌組織FOXC1蛋白表達(dá)水平高于癌旁正常組織(P<0.05；圖1)。siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸癌組織FOXCUT siRNA和FOXC1 siRNA表達(dá)水平均明顯低于癌旁正常組織；結(jié)直腸癌組織FOXC1 mRNA、FOXCUT mRNA表達(dá)水平高于癌旁正常組織(P<0.05；表2)。

圖1 兩組FOXC1蛋白表達(dá)水平的比較

表2 siRNA轉(zhuǎn)染檢測(cè)結(jié)直腸癌組織FOXC1、FOXCUT mRNA的表達(dá)水平(n=75)

2.4 FOXC1與FOXCUT mRNA表達(dá)相關(guān)性分析

經(jīng)相關(guān)性分析，結(jié)直腸癌組織FOXC1 mRNA表達(dá)與FOXCUT mRNA表達(dá)呈正相關(guān)(圖2)。

圖2 FOXC1 mRNA與FOXCUT mRNA表達(dá)的相關(guān)性

3 討 論

結(jié)直腸癌屬臨床常見消化道惡性腫瘤，且為消化道癌癥致死第二位[6]。近年來(lái)臨床對(duì)于結(jié)直腸癌的治療技術(shù)與策略不斷革新，但結(jié)直腸癌5年存活率并無(wú)明顯改善，依舊有30.5%～61.7%患者發(fā)生轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)[7-8]。因此積極探尋結(jié)直腸癌診治的靶向分子標(biāo)志物，研究結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制成為業(yè)界關(guān)注熱點(diǎn)。

有研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXC1表達(dá)異常與惡性腫瘤發(fā)生及病情進(jìn)展密切相關(guān)，如上調(diào)FOXC1表達(dá)可造成卵巢癌細(xì)胞增殖活性反應(yīng)，而FOXC1表達(dá)降低可預(yù)測(cè)前列腺癌侵襲進(jìn)展及不良預(yù)后[9]。本研究結(jié)果表明，結(jié)直腸癌組織FOXC1表達(dá)高于癌旁正常組織，表明FOXC1參與結(jié)直腸癌腫瘤浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移發(fā)展。推測(cè)FOXC1通過(guò)上皮間質(zhì)化(EMT)、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，促進(jìn)腫瘤血管生成途徑等影響腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖而參與到各種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程，與馮晉等[10]研究一致。

近年對(duì)lncRNA的研究不斷深入，lncRNA在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著促癌及抑癌作用，參與了細(xì)胞凋亡、侵襲與轉(zhuǎn)移等過(guò)程，在轉(zhuǎn)錄調(diào)控、轉(zhuǎn)錄后調(diào)控及表觀遺傳學(xué)調(diào)控層面發(fā)揮著重要的作用[11-12]。本研究結(jié)果中，結(jié)直腸癌組織lncRNA FOXCUT高表達(dá)率為82.67%，高于癌旁正常組織，且lncRNA FOXCUT高表達(dá)與患者TNM分期、AJCC分期、高分化等病理特征明顯相關(guān)(P<0.05)，提示lncRNA FOXCUT高表達(dá)的結(jié)直腸癌細(xì)胞具有較強(qiáng)的細(xì)胞增殖功能，同時(shí)遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率較高，推測(cè)lncRNA FOXCUT高表達(dá)可促進(jìn)癌細(xì)胞侵襲功能，增加遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)，表明lncRNA FOXCUT在結(jié)直腸癌腫瘤發(fā)生發(fā)展中有促癌基因的效應(yīng)。

lncRNA復(fù)雜多樣，但是其對(duì)基因的調(diào)控方式卻很相似，有規(guī)律可循，在表達(dá)或功能調(diào)節(jié)上，lncRNA之間及其與臨近的mRNA之間存在著某種關(guān)聯(lián)，很大比例的lncRNA與相鄰的mRNA基因相互作用[13]，“l(fā)ncRNA-mRNA”基因是調(diào)控疾病的表觀遺傳學(xué)中一種新的模式。本研究通過(guò)相關(guān)性分析可知，結(jié)直腸癌組織FOXC1 mRNA與FOXCUT mRNA表達(dá)呈正相關(guān)，推測(cè)FOXC1為FOXCUT靶基因，可基于“l(fā)ncRNA-mRNA”基因遺傳學(xué)相關(guān)原則促進(jìn)結(jié)直腸癌腫瘤進(jìn)展，能夠以FOXCUT-FOXC1基因模式調(diào)控腫瘤進(jìn)程。

綜上所述，F(xiàn)OXC1與FOXCUT在結(jié)直腸癌細(xì)胞中呈高表達(dá)，且FOXC1 mRNA與FOXCUT mRNA表達(dá)呈正相關(guān)性，存在相互作用調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖及侵襲的作用。