唐小卿， 張盼盼， 魏海軍

(1.南華大學衡陽醫(yī)學院神經科學研究所，湖南省衡陽市 421001；2.湖南環(huán)境生物職業(yè)技術學院生理教研室，湖南省衡陽市 421005)

同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)是蛋氨酸代謝為半胱氨酸過程中形成的一種含硫氨基酸。在神經退行性疾病阿爾茲海默癥(Alzheimer’s disease,AD)[1]和帕金森(Parkinson’s disease,PD)[2]患者血清中均檢測到高水平Hcy。研究表明Hcy可誘導神經細胞發(fā)生神經退行性病變[3]，但其機制尚未完全闡明。高水平Hcy可導致神經炎癥產生[4]，而神經炎癥是誘發(fā)神經退行性疾病的重要危險因素。細胞焦亡作為一種促炎性程序性細胞死亡方式，能夠促進神經炎癥的發(fā)生[5]。琥珀酸脫氫酶(succinate dehydrogenase,SDH)是一種線粒體復合酶，參與了琥珀酸氧化為延胡索酸和線粒體電子傳遞鏈中電子傳遞等過程。有研究顯示，SDH活性升高后可增強琥珀酸氧化并促進炎癥因子白細胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)的表達[6]。琥珀酸脫氫酶亞基A(SDH subunit A,SDHA)是SDH催化琥珀酸代謝反應的主要活性亞基，其表達水平升高可促進炎癥因子的產生[7]。本文在小鼠海馬神經元HT22細胞上，觀察Hcy對細胞焦亡、SDHA蛋白表達及神經炎癥反應的影響，以明確Hcy引起的神經炎癥反應與其促進細胞焦亡、上調SDHA表達是否有關，為闡明Hcy誘導神經退行性疾病的機制提供新認識。

1 材料和方法

1.1 細胞株及主要試劑

HT22細胞(舜冉生物科技有限公司提供)；DMEM培養(yǎng)基、Hcy(美國Sigma公司)；胎牛血清(Excell公司)；胰蛋白酶消化液(Trypsin-EDTA)(美國Gibco公司)；青霉素-鏈霉素溶液(廣州賽國生物科技有限公司)；GAPDH抗體、FITC標記羊抗兔IgG(美國Proteintech公司)；細胞核苷酸結合寡聚化結構樣受體蛋白3(NLRP3)抗體、Caspase-1抗體、凋亡相關斑點樣蛋白(ASC)抗體、IL-18試劑盒(美國Abcam公司)；焦亡相關蛋白消皮素(GSDMD)抗體(美國Affinity Biosciences公司)；SDHA(SDHA)抗體(CST賽信通公司)；IL-1β試劑盒(美國R&D Systems公司)；Dil(DilC18(3))細胞膜橙紅色熒光探針(翌圣生物科技股份有限公司)；CCK-8試劑盒(日本Dojindo公司)。

1.2 細胞培養(yǎng)及分組

HT22細胞采用DMEM、10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素培養(yǎng)，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔2天進行一次傳代培養(yǎng)。分別設置對照組(Hcy,0 mmol/L)、低Hcy組(Hcy,1.25 mmol/L)、中Hcy組(Hcy,2.50 mmol/L)和高Hcy組(Hcy,5.00 mmol/L)，根據(jù)分組給與不同濃度Hcy作用細胞24 h。

1.3 CCK-8檢測細胞活性

取對數(shù)生長期細胞接種于96孔板培養(yǎng)，每個組設置6個復孔，加入不同濃度Hcy(0、1.25、2.50、5.00 mmol/L)DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)結束后棄去上清，將DMEM培養(yǎng)基與CCK-8溶液按照10∶1比例配置，每個實驗孔加入100 μL并設置6個空白對照孔，放置在培養(yǎng)箱中反應1.5 h后在酶標儀波長450 nm處測定光密度值(OD)。細胞存活率(%)=(實驗孔OD值-空白孔OD值)/(對照孔OD值-空白孔OD值)×100%。

1.4 免疫熒光法檢測細胞形態(tài)及GSDMD膜表達水平

根據(jù)不同實驗分組將細胞接種于細胞爬片，首先使用Dil(DilC18(3))細胞膜橙紅色熒光探針染液孵育細胞20 min，吸干染液后,用培養(yǎng)基清洗爬片2～3次，每次用預溫的培養(yǎng)基覆蓋所有細胞，孵育5～10 min，吸干培養(yǎng)基；隨后用多聚甲醛固定細胞30 min，PBS沖洗3次后用含0.1% Triton100和10%血清的PBS避光封閉1 h，不清洗直接加入配置好的GSDMD(1∶200)抗體于4 ℃避光孵育過夜，孵育結束后PBS沖洗3次；加入FITC標記羊抗兔IgG(Green,1∶100)室溫避光孵育1 h，PBS沖洗3次；用DAPI避光染色10 min，PBS沖洗3次后將細胞爬片轉移至載玻片上,甘油(甘油∶PBS=3∶2)封片，用熒光顯微鏡觀察。

1.5 Western blotting檢測蛋白表達

細胞傳代后接種在培養(yǎng)皿中，根據(jù)不同分組培養(yǎng)HT22細胞后，棄去上清，用預冷PBS清洗細胞2次，將培養(yǎng)皿中的PBS完全吸干后，每個皿里加入150 μL RIPA細胞裂解液，用細胞刮刀將細胞從培養(yǎng)皿中刮下，放置在冰上裂解30 min后4 ℃ 12 000 r/min離心10 min，BCA法測定蛋白水平。10%SDS-PAGE分離膠電泳，250 mA 60 min濕轉后轉至PVDF膜，用5%脫脂牛奶封閉2 h后加入對應目的蛋白一抗(1∶1 000)4 ℃條件下孵育過夜；回收一抗后TBST洗滌PVDF膜3次，每次10 min，加入相應的二抗(1∶5 000)孵育2 h，再次用TBST洗滌PVDF膜2次，每次10 min；最后用ECL顯色液顯色，Image J軟件分析蛋白條帶灰度值。

1.6 ELISA檢測炎癥因子

根據(jù)不同分組培養(yǎng)HT22細胞，根據(jù)酶聯(lián)免疫吸附試劑盒說明書操作測定IL-1β和IL-18水平，反應結束后在酶標儀450 nm波長處測定OD值后計算IL-1β和IL-18水平。

1.7 統(tǒng)計分析

2 結 果

2.1 Hcy對HT22細胞活力的影響

與對照組比較，1.25、2.50、5.00 mmol/L Hcy處理的HT22細胞活力顯著降低，并呈劑量依賴性(P<0.05；表1)，表明Hcy可引起神經細胞退行性病變。

2.2 Hcy對HT22細胞炎癥因子的影響

炎癥因子IL-1β和IL-18的水平在2.50、5.00 mmol/L Hcy處理后顯著升高，且高、中Hcy組高于低劑量組(P<0.05；表1)，表明Hcy可誘導HT22細胞產生神經炎癥反應。

表1 Hcy對HT22細胞活力和炎癥因子IL-1β、IL-18水平的影響(n=5)

2.3 Hcy對HT22細胞形態(tài)和焦亡相關蛋白GSDMD與細胞膜共定位情況的影響

經1.25、2.50、5.00 mmol/L Hcy處理后發(fā)現(xiàn)，HT22細胞突觸受到損傷，GSDMD與細胞膜共定位增強(顯示為黃色熒光增強)，且隨著Hcy濃度升高，細胞膜發(fā)生破裂(圖1)。以上結果表明，Hcy處理后導致GSDMD在細胞膜上積累，并進一步導致細胞膜破裂，提示Hcy可誘導HT22細胞發(fā)生焦亡。

圖1 Hcy對HT22細胞形態(tài)和焦亡相關蛋白GSDMD與細胞膜共定位情況的影響(免疫熒光法，900×)綠色熒光標記GSDMD，橙紅色熒光探針標記細胞膜，藍色熒光標記細胞核，黃色熒光強度表示GSDMD與細胞膜的共定位水平。

2.4 Hcy對HT22細胞焦亡相關蛋白表達的影響

與對照組比較，2.50、5.00 mmol/L Hcy可顯著上調HT22細胞NLRP3(圖2A)、ASC(圖2B)、cleaved-Caspase-1和pro-Caspase-1(圖2C)及GSDMD-N和GSDMD(圖2D)等蛋白的表達水平，且高Hcy組高于低Hcy組(P<0.05)，表明Hcy可誘導HT22細胞焦亡。

圖2 Hcy對HT22細胞焦亡相關蛋白NLRP3(A)、ASC(B)、pro-Caspase-1和cleaved-Caspase-1(C)、GSDMD和GSDMD-N(D)表達水平的影響1為對照組；2為低Hcy組；3為中Hcy組；4為高Hcy組。a為P<0.05，與對照組比較；b為P<0.05，與低Hcy組比較。

2.5 Hcy對HT22細胞SDHA蛋白表達的影響

1.25、2.50、5.00 mmol/L Hcy顯著上調HT22細胞SDHA蛋白的表達水平(P<0.05,圖3)，表明Hcy誘導的神經炎癥反應與其上調SDHA的表達有關。

圖3 Hcy對HT22細胞SDHA蛋白表達的影響1為對照組；2為低Hcy組；3為中Hcy組；4為高Hcy組。a為P<0.05，與對照組比較。

3 討 論

Hcy已經被證明是神經退行性疾病的高危險因素。有研究發(fā)現(xiàn)Hcy可通過誘導腦內Aβ沉積促進AD發(fā)生發(fā)展[8]。高水平Hcy不僅可誘導小鼠腦內tau蛋白磷酸化，還可導致記憶功能損傷[9]。因此，深入闡明Hcy誘導神經退行性病變的機制，可為神經退行性疾病防治提供新靶點和新思路。本研究實驗發(fā)現(xiàn)Hcy處理后，HT22細胞活力顯著降低，表明Hcy對神經細胞具有毒性作用。HT22細胞是小鼠海馬神經元細胞系，是目前研究神經退行性疾病的常用細胞系，因此，本研究結果驗證了Hcy的促神經退行性病變作用。為此，本文將深入探討Hcy促進HT22細胞損傷的機制，以闡明Hcy誘導神經退行性病變的機制。

有研究表明，高水平Hcy可導致炎癥的產生[10]。基于神經炎癥在神經退行性病變中具有重要地位[11]，本研究首先觀察Hcy是否可使HT22細胞產生神經炎癥反應。本研究結果顯示，Hcy處理HT22細胞后，炎癥因子IL-1β和IL-18水平顯著升高，表明Hcy可使HT22細胞產生神經炎癥反應。因此，深入探討Hcy誘導HT22細胞產生神經炎癥反應的機制，將有助于更好地理解Hcy誘導神經退行性病變的機制。

細胞焦亡是一種由炎癥小體介導且依賴于Caspase-1激活的促炎性程序性細胞死亡方式。Caspase-1前體與NLRP3通過接頭蛋白ASC形成炎癥小體，前體Caspase-1被激活后通過切割GSDMD形成GSDMD-N端游離肽段，游離肽段形成PFD聚集在細胞膜上形成大的孔道，導致細胞腫脹和膜破裂；同時，Caspase-1激活還進一步切割pro-IL-1β與pro-IL-18形成成熟的IL-1β和IL-18引發(fā)炎癥反應[12-13]。本研究結果顯示，在Hcy處理的HT22細胞中，HT22細胞突觸受到損傷，且GSDMD在細胞膜上的表達水平顯著升高，細胞膜完整性丟失，焦亡相關蛋白NLRP3、ASC、pro-Caspase-1、cleaved-Caspase-1、GSDMD和GSDMD-N的表達均顯著上調，炎癥因子IL-1β和IL-18水平升高，表明Hcy可誘導HT22細胞焦亡，并引發(fā)炎癥反應。這些結果拓展了對Hcy和細胞焦亡、Hcy和神經炎癥之間關系的理解，即Hcy可通過誘導神經細胞焦亡而引發(fā)神經炎癥反應。NLRP3炎癥小體介導的焦亡在AD中具有重要作用，通過抑制NLRP3/Caspase-1信號通路可以改善AD小鼠的認知功能障礙[14]。通過抑制GSDMD剪切和炎癥因子IL-1β與IL-18的生成能有效改善PD的運動障礙[15]。這些研究證明，通過抑制神經細胞焦亡繼而減輕神經炎癥可改善神經退行性疾病?；贖cy在神經退行性疾病發(fā)病中的重要作用，抑制Hcy誘導的細胞焦亡極有可能通過減輕神經炎癥反應改善神經退行性疾病。

SDHA是復合物酶SDH活性的關鍵結構亞基[16]。SDHA表達水平升高能夠促發(fā)細胞內炎癥基因轉錄[7]。有研究證明，抑制SDH的活性可以有效降低神經炎癥的發(fā)生[17]。本研究結果顯示，Hcy處理可顯著升高HT22細胞SDHA蛋白的表達水平，表明SDHA上調與Hcy促進神經炎癥的發(fā)生密切相關。有研究報道，SDHA可誘導ROS生成增強細胞的氧化應激水平[18]。實際上，ROS水平升高能夠通過激活炎癥小體NLRP3進一步誘導細胞發(fā)生焦亡[19]。結合本研究結果推測，Hcy上調SDHA表達后可通過升高ROS水平而誘導神經細胞發(fā)生焦亡。

綜上所述，本研究認為Hcy導致的神經毒性與其誘導神經細胞發(fā)生焦亡、上調SDHA表達密切相關?；谏窠浖毎雇鰧ι窠浹装Y和神經退行性疾病的調節(jié)作用，本研究提示，抑制神經細胞焦亡可能是治療Hcy誘導的神經炎癥和改善神經退行性疾病的有效作用途徑。本研究還提示SDHA可能是直接導致Hcy誘導神經細胞焦亡和神經炎癥的重要機制。因此，抑制SDHA也有望成為防治Hcy誘導神經細胞焦亡引發(fā)神經炎癥和神經退行性疾病的新方法。本研究為防治Hcy誘導的神經退行性疾病提供了新思路。