周 芬，孫雨晴，孫 攀，張楚天，楊 娟，林燕萍

福建中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結(jié)合研究院，福建福州350122

成骨細胞是骨形成的主要功能細胞，具有合成、分泌骨基質(zhì)，并促使其礦化的功能，是維持骨形成和骨吸收動態(tài)平衡的關(guān)鍵因素［4］。研究顯示：骨形態(tài)發(fā)生蛋白2（bone morphogenetic protein 2，BMP2）是誘導成骨細胞分化的主要信號蛋白之一［5］，BMP2/Smad1/Runx2/Osterix 信號通路和成骨細胞的分化密切相關(guān)［6-8］。

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)健骨顆粒能夠促進成骨細胞分化，促進骨形成，發(fā)揮防治絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的作用［9-12］。為進一步闡釋健骨顆粒復方的作用機制，本文基于前期研究基礎(chǔ)，對健骨顆粒整方進行氯仿萃取，獲得中藥有效部分干預原代成骨細胞，從BMP2/Smad1/Runx2/Osterix 信號通路角度，探討健骨顆粒氯仿萃取部位對成骨細胞分化的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗藥物 健骨顆粒主要藥物組成：煅狗骨、淫羊藿、山茱萸、黨參、淮山藥等，均從福建省醫(yī)藥公司采購，委托福建中醫(yī)藥研究院加工制備成含原生藥2.9 g的粉末。

1.1.2 實驗動物 BALB/c 小鼠8 只，年齡＜3 d，購自上海斯萊克實驗動物有限公司，實驗動物許可證號：SCXK（滬）2017-0005，用于原代成骨細胞的提取。

1.1.3 主要實驗試劑 胰蛋白酶、DMEM 高糖培養(yǎng)基（新西蘭Hyclone 公司）；堿性磷酸酶染色試劑盒（南京建成生物科技有限公司）；Noggin（美國Med‐Chemexpress生物科技公司）；氯仿（國藥集團化學試劑有限公司）；DMSO 和Ⅰ型膠原酶（日本Sigma 公司）；RIPA 蛋白裂解液、PMSF、BCA 蛋白濃度測定試劑盒、SDS-PAGE 凝膠配制試劑盒、彩色預染蛋白maker（碧云天生物技術(shù)研究所）；BMP2、Smad1、Runx2、Osterix、ALP、Collagen Ⅰ以及β-actin 蛋白抗體（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司）；MTT 試劑盒（南京凱基生物科技公司）；Trizol（美國invitrogen 公司）；YBR Premix Ex TaqTMPCR Kit（日本TaKaRa 公司）；BMP2、Smad1、Runx2、Osterix、ALP 與CollagenⅠPCR 引物（上海生物工程技術(shù)有限公司）；胎牛血清（美國Gibco公司）。

1.1.4 主要實驗儀器 倒置相差顯微鏡（日本奧林巴斯株式會社）；LX-800 酶標儀（美國THERMO FISHER 公司）；GEL DOC 2000 凝膠成像系統(tǒng)（美國PE 公司）；實時熒光定量PCR 儀（美國Life technolo‐gies公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 健骨顆粒氯仿萃取部位的提取 將健骨顆粒粉末和蒸餾水等比例配成藥液混合物，加入1/3混合物體積的氯仿混勻，靜置分層后析出氯仿部位［13］。重復以上操作4次后，上層溶液較少，較難再萃取，故取前5 次所得的氯仿萃取部位。將氯仿萃取部位溶液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后，先水浴制成浸膏，再真空干燥成固體狀，最大程度上減少殘留在藥物內(nèi)的萃取劑。將制成的固體中藥，按照每30 mg 中藥1 mL DMSO配成母液，-20 ℃保存。

1.2.2 成骨細胞的提取及培養(yǎng) 采用無菌技術(shù)分離出乳鼠的顱蓋骨，用預冷的PBS洗凈，去除多余組織后移入含5 mL Ⅰ型膠原酶的培養(yǎng)皿中，將骨片剪碎，消化2 h，用移液槍吸取上清液裝入離心管，離心后去上清，加入完全培養(yǎng)液，吹打均勻，按需接種于培養(yǎng)瓶，置入溫度為37 ℃、CO2含量為5%的培養(yǎng)箱培養(yǎng)［14］。原代成骨細胞培養(yǎng)時，48 h 換液1 次，當細胞密度約為80%時進行傳代，置入溫度為37 ℃、CO2含量為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每日觀察細胞生長情況。

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1.2.3 堿性磷酸酶染色法鑒定成骨細胞 取生長狀態(tài)較好的第2 代細胞，收集后接種于24 孔板，密度以每孔1×105為標準。次日ALP固定液固定3 min棄液，PBS 清洗干凈，ALP 孵育液避光濕孵1 h，PBS洗凈，蘇木素復染3 min，觀察結(jié)果［15］。

1.2.4 MTT 法篩選最佳給藥濃度 取生長狀態(tài)較好的第2 代細胞，種入96 孔板，加入2、4、8、16、32、64 ng/mL 這6 個濃度的健骨顆粒氯仿萃取部位（每組設(shè)6 個副孔）進行干預，干預時間設(shè)置為1、2、3、4、5 d，干預結(jié)束后按量加入MTT，細胞培養(yǎng)箱孵育4 h，測OD值，并繪制相應(yīng)的生長曲線。

1.2.5 細胞分組與干預 取生長狀態(tài)良好的第2代細胞鋪板，將細胞分為空白組、藥物組、抑制劑組和抑制劑加藥物組4組。用含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，細胞長至80%時棄液，饑餓培養(yǎng)24 h后，空白組更換新的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，藥物組、抑制劑組分別用含健骨顆粒氯仿萃取部位（最佳藥物濃度的完全培養(yǎng)基和含BMP抑制劑Noggin 150 ng/mL）的完全培養(yǎng)基干預，而抑制劑加藥物組先用含Noggin的完全培養(yǎng)基預處理2 h，再加入健骨顆粒氯仿萃取部位的完全培養(yǎng)基共干預，各組均培養(yǎng)48 h 后進行后續(xù)實驗。

1.3 相關(guān)指標檢測

1.3.1 RT-PCR 檢測BMP2、Smad1、Runx2、Osterix及ALP、Collagen ⅠmRNA 的表達情況 細胞分組與干預如“1.2.5”所述，干預結(jié)束后棄培養(yǎng)基，PBS清洗2 遍，Trizol 法提取細胞總RNA，Nano Drop2000 檢測提取物濃度，純度需要維持在1.8～2.0 范圍內(nèi)。反轉(zhuǎn)錄方法根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書步驟依次進行，采用兩步法中的實時熒光定量，SYBRTMGreen PCR 法擴增后，得到溶解曲線和擴增曲線，并將各組的相對mRNA 的含量進行比較，引物序列見表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.3.2 Western blot 檢測BMP2、Smad1、Runx2、Os‐terix、ALP、Collagen Ⅰ的蛋白表達情況 細胞分組與干預同RT-PCR，干預結(jié)束后提取成骨細胞總蛋白并用BCA 定量法測定具體蛋白濃度，把蛋白樣品依次加入相應(yīng)的凝膠泳道內(nèi)進行電泳，電泳結(jié)束后，用濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜。封閉2 h，TBST 洗滌后加入一抗4 ℃過夜。次日TBST 搖洗后二抗孵育2 h，再次洗滌后顯影，用ImageLab 4.0 軟件處理分析各組蛋白條帶。

1.4 統(tǒng)計學方法

選用SPSS 21.0版軟件分析處理所有實驗數(shù)據(jù)，并用（）的格式表示具體結(jié)果；當符合正態(tài)分布時，選用單因素方差分析；當不符合時選用Kruskal-Wallis 秩和檢驗分析。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 成骨細胞分離培養(yǎng)及鑒定

2.1.1 觀察成骨細胞形態(tài) 第1代成骨細胞接種于培養(yǎng)瓶貼壁后，由均一的小球形變成菱形、多角形、梭形等多種形態(tài)，當細胞密度達80%時進行傳代。觀察發(fā)現(xiàn)第3 代細胞狀態(tài)最好，故本實驗選用第3代細胞作為實驗對象，見圖1。

圖1 第1～3代成骨細胞貼壁生長形態(tài)Figure 1 Adherent growth morphology of osteoblasts in the 1-3 generation

2.1.2 成骨細胞鑒定 堿性磷酸酶染色結(jié)果提示所提取原代細胞陽性率＞90%，經(jīng)鑒定確認所培養(yǎng)細胞為成骨細胞，見圖2。

圖2 原代成骨細胞堿性磷酸酶染色（×200）Figure 2 Alkaline phosphatase staining of primary osteoblasts(×200)

2.2 最佳給藥濃度選擇

經(jīng)MTT 法檢測成骨細胞增殖，結(jié)果顯示：與空白組對比，6個實驗藥物濃度（分別是2、4、8、16、32、64 ng/mL）在干預后第1～2 天均可促進成骨細胞增殖，當藥物濃度為32 ng/mL，干預時間為2 d 時，成骨細胞的增殖速度最快，故選擇32 ng/mL 干預2 d作為健骨顆粒氯仿萃取部位的最佳干預條件，干預原代成骨細胞并進行后續(xù)實驗，見圖3。

圖3 不同濃度藥物干預后細胞生長曲線Figure 3 Cell growth curve after drug intervention at different concentrations

實驗還發(fā)現(xiàn)，當藥物濃度為0～2 ng/mL 時，細胞生長高峰在3～4 d；當藥物濃度為4～64 ng/mL時，第2天就已到達生長高峰。由此可見，適當濃度的健骨顆粒能使成骨細胞生長高峰期提前，見圖4。

圖4 不同干預時間各藥物濃度組成骨細胞增殖情況Figure 4 Osteocyte proliferation at different drug concentrations at different intervention time

2.3 4 組成骨細胞BMP2、Smad1、Runx2、Osterix、ALP和Collagen Ⅰ基因表達水平比較

BMP2、Smad1、Runx2、Osterix、ALP、Collagen Ⅰ的基因表達檢測結(jié)果顯示：與空白組比較，抑制劑組以上6個指標基因表達量均顯著降低（P＜0.05或P＜0.01），藥物組以上6 個指標基因表達量均顯著升高（P＜0.05 或P＜0.01）。與抑制劑組比較，抑制劑加藥物組以上6 個指標基因表達量均較高（P＜0.05或P＜0.01），見圖5。

圖5 4組BMP2、Smad1、Runx2、Osterix、ALP、Collagen ⅠmRNA表達水平比較Figure 5 Comparison of mRNA expression of BMP2,SMAD1,Runx2,Osterix and Collagen Ⅰin four groups

2.4 4 組成骨細胞BMP2、Smad1、Runx2、Osterix、ALP和Collagen Ⅰ蛋白表達水平比較

與空白組比較，抑制劑組以上6 個蛋白表達量均顯著降低（P＜0.05 或P＜0.01），藥物組以上6 個蛋白表達量均顯著升高（P＜0.05 或P＜0.01）。與抑制劑組比較，抑制劑加藥物組以上6 個蛋白表達量均較高（P＜0.05或P＜0.01）。見圖6～7。

圖7 Western blot檢測4組成骨細胞蛋白表達水平Figure 7 Protein expression of osteoblasts in four groups detected by Western blot

3 討論

絕經(jīng)后雌激素水平下降導致成骨分化減少，骨吸收大于骨形成，骨穩(wěn)態(tài)失衡是絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的重要病因之一［16-17］。成骨細胞分化作為骨形成的關(guān)鍵環(huán)節(jié)對骨質(zhì)疏松癥的防治十分重要，因此，促進成骨細胞分化可以作為闡釋中藥防治PMOP的切入點［18］。中藥臨床治療多以復方為主，復方藥物種類多，成分復雜，直接水提干預體外細胞，復方的藥效會受到干擾和限制［19］。為了使實驗更加科學和嚴謹，本實驗采用中藥有效部位提取技術(shù)，使用有機溶劑氯仿將健骨顆粒整方萃取，得到效應(yīng)成分更為富集的化學物質(zhì)，進行體外細胞實驗。既往研究發(fā)現(xiàn)氯仿從中藥中萃取的木脂素成分屬于植物雌激素，在體內(nèi)的分解產(chǎn)物與雌激素的結(jié)構(gòu)類似，能夠促進成骨細胞分化［20］。本實驗研究發(fā)現(xiàn)，適當濃度的健骨顆粒氯仿萃取部位不僅可以提高成骨細胞增殖速率，同時還能使成骨細胞生長高峰期提前。當成骨細胞增殖速度加快，數(shù)量增多形成多層細胞，并合成、分泌Ⅰ型骨膠原蛋白時，能夠為最終礦化形成骨結(jié)節(jié)提供條件。細胞增殖到一定程度后開始分化，分化早期主要合成分泌ALP，從而促進骨基質(zhì)的礦化。本實驗研究結(jié)果表明，藥物組Col‐lagenⅠ、ALP 基因和蛋白的表達量比空白組明顯升高，說明健骨顆粒氯仿萃取部位能夠有效促進成骨細胞分化。

BMP2 信號通路是成骨分化的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑［21］。BMP2 與其受體結(jié)合，誘導Smad1/5/9 的磷酸化，激活的Smads 轉(zhuǎn)移到細胞核中可以調(diào)節(jié)目標基因，如Runx2 和Osterix。Runx2 是成骨細胞分化所必需的主轉(zhuǎn)錄因子，可協(xié)同其下游的Osterix 調(diào)節(jié)成骨細胞特異性基因（如ALP、CollagenⅠ）的表達［22-23］，從而影響成骨細胞分化。本研究結(jié)果顯示，與空白組相比，藥物組BMP2、Smad1、Runx2、Osterix 基因和蛋白的表達量都有明顯升高趨勢，且ALP、CollagenⅠ的基因和蛋白表達量隨BMP2 升高而同步上升，提示健骨顆粒氯仿萃取部位可能通過上調(diào)BMP2 促進成骨細胞分化。

Noggin 是一種分泌型糖蛋白，由205 個氨基酸組成，是骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMPs）的拮抗劑。Noggin可與BMP2 特異性結(jié)合，阻斷后者的受體結(jié)合位點，從而抑制BMP2 的信號轉(zhuǎn)導作用［23-24］。為了明確健骨顆粒氯仿萃取部位是否通過調(diào)控BMP2/Smad1/Runx2/Osterix 信號通路達到促進成骨細胞分化的作用，實驗使用BMP2 抑制劑（即Noggin）抑制成骨細胞內(nèi)BMP2信號轉(zhuǎn)導作用，Noggin 作為BMP2的抑制劑能夠明顯抑制其下游的Smad1、Runx2、Osterix基因和蛋白的表達，且ALP 與Collagen Ⅰ基因和蛋白的表達量則隨著BMP2 信號通路相關(guān)蛋白和基因表達下降而下降［25］。同時，設(shè)置抑制劑加藥物組（Noggin和健骨顆粒氯仿萃取部位共干預）同藥物組進行反向?qū)Ρ?，藥物組BMP2、Smad1、Runx2、Osterix的基因和蛋白的表達量均明顯升高，且成骨細胞分化指標ALP 與CollagenⅠ基因和蛋白表達量同步升高。此外，實驗結(jié)果顯示抑制劑加藥物組BMP2、Smad1、Runx2、Osterix 的基因和蛋白的表達量對比抑制劑組仍然有著明顯的提升，說明健骨顆粒氯仿萃取部位有效干擾了Noggin 的抑制作用，其機制可能是藥物干擾Noggin 與BMP2 的結(jié)合，減弱了Nog‐gin的抑制作用，但其詳盡機制尚有待進一步深入探討。本實驗結(jié)果提示，健骨顆粒氯仿萃取部位能通過調(diào)控BMP2/Smad1/Runx2/Osterix 通路促進成骨細胞分化，增加骨形成，從而達到防治絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的作用。