趙 瑋，趙 利，張建平，齊燕妮，王利民，謝亞萍，李聞娟，黨 照，袁明璐，張艷萍

（1. 甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所, 甘肅 蘭州 730070；2. 甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所, 甘肅 蘭州 730070）

胡麻(Linure usitatissmum)即油用亞麻，屬亞麻科亞麻屬一年生草本植物[1]。胡麻油中含有45%～65%的α-亞麻酸，是ω-3 型不飽和脂肪酸的重要來源[2]。α-亞麻酸具有促進(jìn)智力發(fā)育、強(qiáng)身健腦、降血脂、預(yù)防血栓等作用[3]，且α-亞麻酸及其衍生物二十碳五烯酸(eicosapntemacnioc acid, EPA)和二十二碳六烯酸(docose hexaenoie acid, DHA)具有預(yù)防腫瘤發(fā)生和抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用[4]。中國胡麻收獲面積約35 萬hm2，總產(chǎn)量近40 萬t，均位居世界前列，我國胡麻加工和消費水平在國際上已處于絕對的優(yōu)勢地位[5]。近年來隨著胡麻保健功能食品的飛速發(fā)展，其種植效益逐年提高，市場需求越來越大[5]。全世界鹽漬土面積約10 億hm2，在全球干旱和半干旱地區(qū)約有50%的灌溉土地受到鹽堿化的影響，中國土地鹽漬化面積大約占全球的1/10[6-7]。受到鹽脅迫時，植物因吸收過量鹽離子抑制其吸收部分營養(yǎng)元素而產(chǎn)生鹽害，因此土壤鹽漬化已成為現(xiàn)代農(nóng)業(yè)發(fā)展的重要制約因素之一[8-9]。提高作物的耐鹽性，培育適合在鹽堿地生長的植物品種是有效利用鹽漬化土地的主要方法之一[10]。我國胡麻主要分布在甘肅、內(nèi)蒙古、寧夏、山西等干旱半干旱省區(qū)，灌溉水中一般都含有一定的易溶鹽分，長期灌溉必然使土壤鹽含量增加[11]。目前，胡麻響應(yīng)鹽脅迫的關(guān)鍵基因及分子機(jī)制尚不明確，制約了胡麻的耐鹽高產(chǎn)遺傳改良進(jìn)程，威脅著胡麻產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展[12]。

隨著高通量測序技術(shù)快速發(fā)展，作物育種研究逐漸從常規(guī)育種轉(zhuǎn)為多組學(xué)技術(shù)相結(jié)合的方式，通過對重要農(nóng)藝性狀、遺傳基因的解析和注釋，為作物育種工作提供了更有效的方案[13]。代謝組+轉(zhuǎn)錄組聯(lián)合分析方法，能較為全面地實現(xiàn)從“因”到“果”深入探究作物的抗逆機(jī)理，相互驗證作用更加明顯[14]。本研究通過鹽脅迫處理下的胡麻根部“廣靶代謝組+轉(zhuǎn)錄組”差異表達(dá)基因和積累代謝物的共表達(dá)分析，鎖定調(diào)控不同抗鹽機(jī)制的關(guān)鍵代謝通路，找出關(guān)鍵調(diào)控因子及功能基因[15]。結(jié)合功能基因分析、代謝通路富集和分子互作，探明代謝物與耐鹽調(diào)控機(jī)制之間的關(guān)聯(lián)性，最終實現(xiàn)對胡麻耐鹽代謝通路和調(diào)控機(jī)制的解析，篩選出核心代謝通路、代謝產(chǎn)物和功能基因，為提高胡麻耐鹽性奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料來自甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所篩選的耐鹽材料R40 和敏感材料R24，水培20 d (溫度為25 ℃、濕度75%、光照12 h、光照強(qiáng)度1 500 lx)，待生長出8～10 片葉后用150 mmol·L?1NaCl 溶液進(jìn)行脅迫處理，分別于1、2、4、8、12 h 取材料的根部組成混合樣，以0 h 取樣為對照，采樣設(shè)3 次重復(fù)，每個重復(fù)采樣3 g。采樣材料編碼如表1 所列。

表1 試驗材料編碼Table 1 Code notations used for the experimental materials

1.2 樣品檢測方法

1.2.1 代謝組檢測

樣品提取流程：將真空冷凍干燥保存的生物樣品利用研磨儀(MM 400, Retsch)研磨至粉末狀；稱取100 mg 的粉末溶解于1.0 mL 提取液中，4 ℃冰箱過夜，期間渦旋3 次；10 000 r·min?1離心10 min后，吸取上清液用0.22 μm 微孔濾膜過濾，后用于液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)分析。

色譜質(zhì)譜采集條件：儀器包括超高效液相色譜(UPLC)和串聯(lián)質(zhì)譜(MS/MS)。液相條件包括，1) 色譜柱：Waters, ACQUITY UPLC HSS, T3, C18, 1.8 μm,2.1 mm × 100 mm。2) 流動相：水相為超純水(加入0.04%的乙酸)，有機(jī)相為乙腈(加入0.04%的乙酸)；洗脫梯度：0 min，水/乙腈 (V/V) 為95 ： 5；11.0 min，為 5 ： 95； 12.0 min， 為 5 ： 95； 12.1 min， 為 95 ： 5；15.0 min，為95 ： 5。3) 流速0.4 mL·min?1；柱溫40 ℃；進(jìn)樣量22 μL。質(zhì)譜條件：500 ℃電噴霧離子源(ESI)，5 500 V 質(zhì)譜電壓，簾氣(CUR) 25 psi，碰撞誘導(dǎo)電離(CAD)參數(shù)設(shè)置為高。

試劑和標(biāo)準(zhǔn)品：試驗主要試劑有乙腈(Merck)、乙醇(Merck)、 甲醇(Merck)和標(biāo)準(zhǔn)品(BioBioPha/Sigma-Aldrich)，標(biāo)準(zhǔn)品二甲基亞砜(DMSO)或甲醇作為溶劑溶解后，?20 ℃保存，質(zhì)譜分析前用70%甲醇稀釋成合適濃度。

用fold change 值和OPLS-DA 模型的VIP 值相結(jié)合的方法篩選代謝物。篩選標(biāo)準(zhǔn)：fold change ＞ 2和fold change ＜ 0.5 的代謝物為具有顯著差異。

1.2.2 轉(zhuǎn)錄組檢測

RNA 樣品檢測：瓊脂糖凝膠電泳方法分析RNA的完整性及是否存在DNA 污染；分光光度計(Nano Photometer)檢測RNA 純度(OD260/280和OD260/230)；熒光計(Qubit 2.0)高精確度測量RNA 濃度；生物分析儀(Agilent 2100)精確檢測RNA 完整性。

文庫構(gòu)建：通過磁珠Oligo (dT)與mRNA 的ployA 尾結(jié)合，富集真核生物的mRNA，然后將mRNA隨機(jī)打斷；以片段化的mRNA 為模版，使用6 堿基隨機(jī)引物，在逆轉(zhuǎn)錄酶體系(M-MuLV)中合成cDNA第1 條鏈；隨后用RNaseH 降解RNA 鏈，并在DNA polymeraseⅠ體系下，以dNTPs 為原料合成cDNA 第2條鏈。純化后的雙鏈cDNA 經(jīng)過末端修復(fù)、加A 尾并連接測序接頭；用AMPure XP beads 篩選200 bp左右的cDNA，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增并再次使用AMPure XP beads 純化PCR 產(chǎn)物，最終獲得文庫。

文庫質(zhì)檢：使用熒光計定量(Qubit 2.0)把文庫稀釋至1.5 ng·μL?1后，使用生物分析儀(Agilent 2100)對文庫的插入片段進(jìn)行檢測。將長度符合預(yù)期的插入片段用PCR 實時熒光定量(qRT-PCR)，對文庫有效濃度進(jìn)行準(zhǔn)確定量(文庫有效濃度高于2 nmol·L?1)。庫檢合格后用Illumina HiSeq 平臺進(jìn)行測序。差異基因的篩選條件為|log2Fold Change| ≥1，且錯誤發(fā)現(xiàn)率(false discovery rate, FDR) ＜ 0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 代謝物檢測結(jié)果與分析

通過檢測共篩選到具有顯著差異的代謝物741個，其中下調(diào)409 個，上調(diào)332 個。R40 和R24 兩個樣本不處理條件下(CK1d vs CK2d)檢測出117 個差異代謝物，其中下調(diào)66 個，上調(diào)51 個；處理后(STd vs SSd)檢測出281 個差異代謝物，其中71 個下調(diào)，210 上調(diào)；R40 處理前后(CK1d vs STd)檢測出246個差異代謝物，其中下調(diào)220 個，上調(diào) 26 個；R24 處理前后(CK2d vs SSd)檢測出97 個差異代謝物，其中下調(diào)52 個，上調(diào)45 個。結(jié)果顯示，鹽脅迫處理后兩份樣本間篩選的差異代謝物最多，而且上調(diào)數(shù)是下調(diào)數(shù)的近3 倍，而敏感型材料R24 處理前后篩選的差異代謝物最少，耐鹽型材料R40 處理前后篩選的代謝物數(shù)量是敏感型材料R24 的2.5 倍(表2)。

表2 代謝物檢測結(jié)果Table 2 Metabolite testing results

篩選出差異代謝物排名前十的為有機(jī)酸及衍生物115 個，黃酮93 個，氨基酸及衍生物和核苷酸及衍生物均為80 個，脂質(zhì)75 個，苯丙素74 個，生物堿29 個，黃酮類25 個，維生素及衍生物24 個，黃酮醇19個。除了氨基酸及衍生物和核苷酸及衍生物在R40處理前后(CK1d vs STd)差異數(shù)最高外，其他代謝物均在兩份材料處理后(STd vs SSd)差異數(shù)最多。黃酮數(shù)量最多(STd vs SSd)與最少(CK2d vs SSd)的差距為9.5 倍，脂質(zhì)最多(STd vs SSd)與最少(CK1d vs CK2d)的差距為8.3 倍，黃酮醇最多(STd vs SSd)與最少(CK2d vs SSd)的差距為7 倍(表3)。

表3 排名前十的代謝物結(jié)果分析Table 3 Analysis of metabolite results in the top 10

2.2 轉(zhuǎn)錄組檢測與分析

2.2.1 差異表達(dá)基因篩選與注釋

本研究共篩選到差異基因30 233 個，其中上調(diào)15 827 個，下調(diào)14 406 個。敏感型材料R24 處理前后(CK2z vs SSz)篩選的差異基因最多，達(dá)到13 171個，下調(diào)6 088 個，上調(diào)7 083 個，其次是耐鹽型材料R40 處理前后(CK1z vs STz)，差異基因達(dá)到12 948個，下調(diào)6 334 個，上調(diào)6 614 個；兩份對照材料(CK1z vs CK2z)差異基因數(shù)2 720 個，下調(diào)1 378 個，上調(diào)1 342 個；兩份材料處理后(STz vs SSz)差異基因數(shù)1 394 個，下調(diào)606 個，上調(diào)788 個(表4)。

表4 差異基因數(shù)量統(tǒng)計Table 4 Differentially expressed genes in different samples

本研究共篩選到有注釋結(jié)果的轉(zhuǎn)錄因子有13 015個，其中細(xì)胞生成過程和信號功能5 007 個、信息存儲與處理功能2 567 個以及新陳代謝功能5 441 個。根據(jù)功能注釋結(jié)果，差異基因數(shù)前十依次為：翻譯修復(fù)以及蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)換1 779 個，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制1 545個，碳水化合物的運輸和代謝1 222 個，次生代謝物的生物合成、運輸和分解代謝1 121 個，轉(zhuǎn)錄877個，核糖體結(jié)構(gòu)和生物發(fā)生837 個，氨基酸的運輸和代謝793 個，能源生產(chǎn)與轉(zhuǎn)換685 個，脂質(zhì)運輸和代謝685 個，無機(jī)離子的轉(zhuǎn)運與代謝582 個。差異基因最少的功能分別是細(xì)胞外結(jié)構(gòu)和細(xì)胞核心結(jié)構(gòu)，分別有85 和36 個(表5)。

表5 差異基因數(shù)及功能注釋Table 5 Function annotation and gene dosage of the differentially expression genes

續(xù)表5Table 5 (Continued)

2.2.2 差異表達(dá)基因KEGG 通路

本研究通過差異表達(dá)基因KEGG 通路，篩選出差異基因KO 節(jié)點24 個，其中上調(diào)基因的KO 節(jié)點有9 個，下調(diào)差異基因的KO 節(jié)點有5 個，同時包含上下調(diào)基因的KO 節(jié)點有10 個。結(jié)果顯示，調(diào)控抗鹽代謝途徑的重要基因主要以參與調(diào)控糖類代謝為主，包括蔗糖、葡萄糖、葡聚糖、葡糖苷、纖維二糖、纖維糊精、腺苷二磷酸葡萄糖、尿苷二磷酸葡萄糖、海藻糖、麥芽糖糊精和麥芽糖等。

2.3 代謝組和轉(zhuǎn)錄組聯(lián)合分析

2.3.1 代謝物KEGG 聯(lián)合通路分析

為了明確基因與代謝物之間的關(guān)系，將鹽脅迫下胡麻根部篩選的差異代謝物與轉(zhuǎn)錄組差異基因，同時映射到13 條KEGG 通路圖上并進(jìn)行聯(lián)合分析。主要代謝物包括：生長素(auxin, IAA)、脫落酸(abscisic acid, ABA)、乙烯(ethylene)、菜籽類固醇(brassinosteroid, BR)、茉莉酸(jasmonic acid, JA)、細(xì)胞分裂素(cytokinin, CTK)和異亮氨酸(l-isoleucine,JA-Ile)等。主要代謝通路包括：色氨酸-生長素通路、玉米素生物合成-細(xì)胞分裂素通路、二萜生物合成-赤霉素通路、類胡蘿卜素-脫落酸通路、半胱氨酸和蛋氨酸的代謝-乙烯通路、菜籽類固醇生物合成-菜籽類固醇通路、α-亞麻酸-茉莉酸通路、苯丙氨酸生物合成-水楊酸通路。其中菜籽類固醇和茉莉酸代謝通路上調(diào)，生長素、脫落酸、乙烯等代謝通路下調(diào)。在色氨酸-生長素通路中發(fā)現(xiàn)GH3基因，其在植物生長素信號途徑、光信號途徑以及植物抗逆防衛(wèi)反應(yīng)中起重要作用。

2.3.2 差異代謝物和差異基因KEGG 富集分析

根據(jù)本研究的差異代謝物分析結(jié)果，結(jié)合轉(zhuǎn)錄組差異基因分析結(jié)果，將相同分組的差異基因及差異代謝物同時映射到KEGG 通路圖上，差異基因和差異代謝物的富集P值，用-logP來表示，結(jié)果顯示：差異基因P＜ 0.05 的代謝通路一共有46 條，其中對比組CK2d vs SSd 有20 條，CK1d vs CK2d 有4 條，STd vs SSd 有4 條，CK1d vs STd 有18 條；差異基因P＜ 0.01 的代謝通路24 條，其中對比組CK2d vs SSd 有8 條，CK1d vs CK2d 有3 條，STd vs SSd 有2 條，CK1d vs STd 有11 條。差異代謝物P＜ 0.05 的代謝通路一共有27 條，其中對比組CK2d vs SSd 有22 條，STd vs SSd 有1 條，CK1d vs STd 有4 條；差異代謝物P＜ 0.01 的代謝通路11 條，其中對比組CK2d vs SSd 有9 條，CK1d vs STd 有2 條?；蚋患瘮?shù)量較多的代謝途徑分別有代謝途徑相關(guān)、抗生素生物合成、次生代謝產(chǎn)物的合成、苯丙素的生物合成、淀粉和蔗糖代謝等通路；代謝物富集數(shù)量較多的代謝途徑分別有代謝途徑相關(guān)、次生代謝產(chǎn)物的合成、抗生素生物合成、苯丙素的生物合成、ABC轉(zhuǎn)運蛋白、類黃酮生物合成等通路(表6)。

表6 P ＜ 0.05 水平的代謝物及其關(guān)聯(lián)基因Table 6 Metabolites and their correlated genes at the 0.05 level

續(xù)表6 (1)Table 6 (Continued)

續(xù)表6 (2)Table 6 (Continued)

續(xù)表6 (3)Table 6 (Continued)

圖2 CCA 圖Figure 2 CCA maps

2.3.3 差異基因和代謝物相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)圖

對每組差異分組檢測到的基因和代謝物進(jìn)行相關(guān)性分析，統(tǒng)計皮爾森相關(guān)系數(shù)大于0.8 的基因和代謝物的差異倍數(shù)情況，通過網(wǎng)絡(luò)圖來表示基因和代謝物之間的相關(guān)性(圖1)。

結(jié)果顯示基因與代謝物差異表達(dá)模式呈正相關(guān)的有207 408 對，負(fù)相關(guān)的有430 949 對。從代謝物和基因相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)圖可以看出，Lus_GLEAN_10025781、Lus_GLEAN_10045022、Lus_GLEAN_10038907、Lus_GLEAN_10028484、Lus_GLEAN_10017173、Lus_GLE AN_10022204、Lus_GLEAN_10022072、Lus_GLEAN_10011859共8 個基因，與N-乙酰-L-谷氨酸、煙酸核糖核苷、L-(-)-酪氨酸、7-甲氧基香豆素、L-色氨酸5 個代謝物具有明顯的相關(guān)性，每一個代謝物與一個或多個基因相關(guān)聯(lián)(圖1)。

圖1 代謝物與轉(zhuǎn)錄組相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)圖Figure 1 The network between the metabolites and the transcriptome

2.3.4 差異基因和代謝物CCA 分析

典型相關(guān)性分析(canonical correlation analysis,CCA)，是利用綜合變量對之間的相關(guān)關(guān)系來反映兩組指標(biāo)之間的整體相關(guān)性的多元統(tǒng)計分析方法。對相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)圖中的差異基因及差異代謝物進(jìn)行CCA 分析(圖2)，結(jié)果表明，CCA 圖中以十字區(qū)分出4 個區(qū)域，在同一個區(qū)域內(nèi)，距原點越遠(yuǎn)關(guān)聯(lián)性越高。其中代謝物L(fēng)-谷氨酸與基因Lus_GLEAN_10025781、代謝物2-異丙基蘋果酸與基因Lus_GLEAN_10022072、代謝物L(fēng)-(-)-酪氨酸與基因Lus_GLEAN_10017173存在較高的關(guān)聯(lián)。

3 討論

近年來，轉(zhuǎn)錄組學(xué)和代謝組學(xué)聯(lián)合分析方法在植物逆境脅迫研究中得到了廣泛的應(yīng)用[16-17]，如對鹽脅迫處理的葡萄(Vitis vinifera)葉進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)，差異表達(dá)基因主要富集在碳水化合物代謝、氨基酸代謝、次生代謝產(chǎn)物的合成和脂類代謝等代謝通路[18]。本研究利用代謝組和轉(zhuǎn)錄組對NaCL 脅迫下胡麻耐鹽型材料R40 和敏感型材料R24 根部代謝物含量和基因表達(dá)進(jìn)行分析，結(jié)果表明，胡麻根部的差異代謝物和與之對應(yīng)的功能轉(zhuǎn)錄因子富集性高度一致。富集前十的代謝物幾乎都有相對應(yīng)的功能轉(zhuǎn)錄因子富集，如黃酮和黃酮醇的生物合成、苯丙素的生物合成、氨基糖和核苷酸糖的代謝、花青素生物合成、類黃酮生物合成等均有對應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子參與其中。本研究發(fā)現(xiàn)黃酮代謝物的數(shù)量最多(STd_vs_SSd)與最少(CK2d_vs_SSd)的差距達(dá)到9.5 倍，說明鹽脅迫下胡麻根部黃酮類代謝物的富集較高，而敏感型材料在鹽脅迫下黃酮的代謝積累最少，其主要原因是鹽脅迫導(dǎo)致大量有害的活性氧產(chǎn)生，類黃酮主要功能是增強(qiáng)植物對活性氧的清除能力從而提高其耐鹽性[19]，所以敏感型材料黃酮積累少也是其耐鹽差的原因之一。有研究也同樣證實類黃酮生物合成途徑在高粱(Sorghum bicolor)抗鹽脅迫中起到了重要作用[20]。另外氨基酸等有機(jī)物富集量較大，主要作用是為了增強(qiáng)細(xì)胞的滲透壓，從而有效降低鹽堿環(huán)境對植物的傷害。差異基因前十的功能注釋結(jié)果，從宏觀上認(rèn)識了鹽脅迫下胡麻的基因功能分布特征，即轉(zhuǎn)錄因子功能在鹽脅迫下主要以新陳代謝功能和細(xì)胞生成為主，信息存儲和處理的功能其次；差異基因功能注釋顯示，參與翻譯修復(fù)及蛋白轉(zhuǎn)換、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制以及碳水化合物、次生代謝物的生物合成運輸和代謝的基因較多，而其他功能的基因數(shù)量也相對平衡；差異基因功能注釋最少的兩個分別是細(xì)胞外結(jié)構(gòu)和細(xì)胞核心結(jié)構(gòu)，可見鹽脅迫下基因參與調(diào)控的主要是代謝物的修復(fù)、運輸以及信號傳導(dǎo)等功能，對細(xì)胞結(jié)構(gòu)的調(diào)控相對較少。將差異基因及差異代謝物同時映射到13 條KEGG 通路圖上，結(jié)果顯示，基因與代謝物差異表達(dá)模式負(fù)相關(guān)數(shù)量是正相關(guān)的2 倍，主要原因可能是胡麻根部鹽脅迫下代謝物的敏感性較基因更強(qiáng)，這是因為鹽脅迫首先造成植株代謝通路損害，導(dǎo)致大量的代謝產(chǎn)物不能富集，而細(xì)胞的失活過程相對較慢。

鹽脅迫促進(jìn)胡麻根部菜籽類固醇生物合成-菜籽類固醇通路和α-亞麻酸-茉莉酸通路上調(diào)。油菜素類固醇(brassinosteroids, BR)，在鹽堿等逆境下能夠通過增強(qiáng)作物根系吸水性從而增強(qiáng)植物的抗逆性[21]；茉莉酸及其衍生物的含量顯著增加，參與根的內(nèi)部組織層誘導(dǎo)耐鹽機(jī)制[22]，主要誘導(dǎo)一系列與抗逆有關(guān)的基因表達(dá)，如蛋白酶抑制劑、硫蛋白和苯丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(phenylalanine aminotransferase, PAL)等，提高酯氧合酶活性，從而增強(qiáng)植物的抗性[23]。本研究中鹽脅迫條件下色氨酸-生長素通路、類胡蘿卜素-脫落酸通路、半胱氨酸和蛋氨酸的代謝-乙烯等代謝通路下調(diào)。關(guān)于脫落酸對根系發(fā)育的調(diào)控機(jī)制了解相對較少[24]，有研究認(rèn)為鹽脅迫下脫落酸通過抑制側(cè)根的起始和分生組織的活性來抑制其生長和發(fā)育，但是在逆境條件下參與側(cè)根發(fā)育調(diào)控的信號網(wǎng)絡(luò)還沒有建立起來[25]。脫落酸調(diào)控植物耐鹽性的關(guān)鍵在于SnRK2s 蛋白激酶對多種下游靶標(biāo)基因的激活及轉(zhuǎn)錄調(diào)控，從而調(diào)控植物耐鹽性[26]。生長素是側(cè)根發(fā)育的主要調(diào)節(jié)物質(zhì)，脫落酸可以影響生長素的積累和分布[27]。色氨酸是生長素生物合成的重要前體代謝物，而生長素的生物合成在鹽脅迫下選擇哪條途徑，會因為器官不同而有所不同，但這些途徑可以保證胡麻在鹽脅迫環(huán)境下維持體內(nèi)生長素的正常水平[28]。另外玉米素能促進(jìn)植物細(xì)胞分裂，阻止蛋白質(zhì)和葉綠素降解，讓呼吸作用減慢，增強(qiáng)細(xì)胞活力，延緩衰老，從而達(dá)到抗逆的效果[29]。胡麻根部在鹽脅迫下產(chǎn)生豐富的糖類代謝通路，原因是糖類、脂類、氨基酸三大營養(yǎng)素的代謝通路，又是其代謝聯(lián)絡(luò)與轉(zhuǎn)化的樞紐，即糖類和蛋白質(zhì)在體內(nèi)是可以相互轉(zhuǎn)化的，幾乎所有組成蛋白質(zhì)的天然氨基酸都可以轉(zhuǎn)變成糖類，另外糖類代謝的中間產(chǎn)物可以轉(zhuǎn)化成脂肪，而脂肪分解產(chǎn)生的甘油、脂肪酸又可以轉(zhuǎn)化成糖類而被植物吸收[22]。細(xì)胞分裂素和脫落酸在逆境響應(yīng)過程中可能存在拮抗關(guān)系，但是其調(diào)控的分子機(jī)制并不清楚，同樣乙烯信號在鹽脅迫反應(yīng)中的作用還需要進(jìn)一步研究[24]。

代謝組和轉(zhuǎn)錄組聯(lián)合分析共篩選出8 個候選基因與5 個代謝物具有明顯的相關(guān)性，每一個代謝物與一個或多個基因相關(guān)聯(lián)。在色氨酸-生長素通路發(fā)現(xiàn)了GH3基因(IAA 酰胺合成酶)，主要作用是調(diào)控植物激素的平衡以及響應(yīng)激素變化，在生長素信號途徑和光信號途徑以及植物的抗逆應(yīng)急中發(fā)揮重要功能[30]。有關(guān)代謝物如何誘導(dǎo)相關(guān)基因富集并如何響應(yīng)鹽脅迫的機(jī)制等問題還需要進(jìn)一步驗證。

4 結(jié)論

本研究篩選出具有顯著差異的代謝物741 個，其中下調(diào)409 個，上調(diào)332 個，篩選出差異基因共30 233 個，其中上調(diào)15 827 個，下調(diào)14 406 個，有注釋結(jié)果的轉(zhuǎn)錄因子有13 015 個。將差異基因及差異代謝物同時映射到13 條相關(guān)KEGG 通路上，功能注釋結(jié)果表明：胡麻功能轉(zhuǎn)錄因子主要富集在黃酮和黃酮醇的生物合成、苯丙素的生物合成、氨基糖和核苷酸糖的代謝、次生代謝產(chǎn)物的合成、花青素生物合成、類黃酮生物合成等通路，調(diào)控抗鹽代謝途徑的重要基因主要是以參與調(diào)控糖類代謝為主，增強(qiáng)細(xì)胞的滲透壓，從而有效降低鹽堿環(huán)境的傷害。本研究篩選出8 個候選基因與5 個代謝物具有明顯的相關(guān)性，每一個代謝物與一個或多個基因相關(guān)聯(lián)，其中發(fā)現(xiàn)3 對具有較高的關(guān)聯(lián)度，分別是L-谷氨酸與Lus_GLEAN_10025781, 2-異丙基蘋果酸與Lus_GLEAN_10022072, L-(-)-酪氨酸與Lus_GLEAN_10017173。另外色氨酸-生長素通路發(fā)現(xiàn)抗逆相關(guān)基因GH3，是一種典型的與植物生長素原初反應(yīng)相關(guān)的基因，它在植物的抗逆防衛(wèi)反應(yīng)中起著重要作用，這也為后續(xù)胡麻差異表達(dá)基因的分析研究提供了思路。