倪鳴岳 劉源立 涂珍珍 郭立鈺 臧丹丹 周海勝,*

(1.安徽醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，合肥 230032；2. 安徽醫(yī)科大學(xué)科研實(shí)驗(yàn)中心，合肥 230032)

果蠅頭狀因子(grainyhead-like,GRHL) 基因家族成員序列具有高度保守的特點(diǎn)，所編碼的蛋白質(zhì)作為細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子在胚胎發(fā)育過程中發(fā)揮關(guān)鍵的調(diào)控作用[1-5]。果蠅頭狀因子3(GRHL3)作為GRHL家族成員，在表皮的形成、傷口愈合和屏障功能等方面發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。GRHL3通過激活鳥嘌呤核苷酸交換因子，促進(jìn)肌動蛋白細(xì)胞骨架重組，調(diào)節(jié)細(xì)胞附著和運(yùn)動，有助于傷口愈合過程中角質(zhì)形成細(xì)胞的定向遷移[5]。GRHL3也可以通過結(jié)合谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶1基因的啟動子，調(diào)控谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶1表達(dá)進(jìn)而影響交聯(lián)蛋白和脂質(zhì)作用形成表皮角化層[6]。研究[7-8]證實(shí)在腫瘤發(fā)生過程中，GRHL3與miR-21存在相互拮抗的作用，miR-21抑制了GRHL3的表達(dá)，從而抑制了下游的PTEN的生成，并激活PI3K/AKT/mTOR信號通路促進(jìn)了腫瘤的發(fā)生。GRHL3可以作為阻遏物，與靶基因調(diào)控區(qū)的保守序列5′-AACC(A)GGTT-3′或5′-AACCTGTT-3′特異性結(jié)合，從而抑制靶基因表達(dá)[9-10]。

G蛋白偶聯(lián)受體(G protein-coupled receptor,GPCR)是與三聚體G蛋白偶聯(lián)的細(xì)胞表面受體，含有7個穿膜區(qū)，是迄今發(fā)現(xiàn)的最大的受體超家族。 G蛋白偶聯(lián)受體108(G protein-coupled receptor 108,GPR108)屬于GPCR超家族成員之一，尚未發(fā)現(xiàn)天然配體故屬于孤兒受體。研究[11]證實(shí)GPR108主要分布在細(xì)胞高爾基器膜及細(xì)胞膜，是一種核因子κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)激活劑，可以負(fù)向調(diào)節(jié)Toll樣受體信號通路。研究[12-13]顯示GPR108在腺相關(guān)病毒感染的細(xì)胞免疫應(yīng)答中具有重要的作用，因?yàn)镚PR108可以作為腺相關(guān)病毒的受體，通過與胞殼蛋白VP1結(jié)合，介導(dǎo)腺相關(guān)病毒在靶細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用。但是，有關(guān)GPR108基因表達(dá)調(diào)控及其分子機(jī)制目前不清楚。前期筆者分析人GPR108基因結(jié)構(gòu)時，發(fā)現(xiàn)其啟動子序列中存在一保守序列5′-AACCGGTG-3′，推測可能是潛在的GRHL3結(jié)合基序。本研究旨在證實(shí)GRHL3的負(fù)調(diào)控GPR108表達(dá)并探討其調(diào)控機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系、菌種與載體

人胚胎腎細(xì)胞系(293T)、人永生化表皮細(xì)胞系(HaCaT)、人皮膚鱗癌細(xì)胞系(A-431)，人肝癌細(xì)胞系(Hep G2)等細(xì)胞系均為本實(shí)驗(yàn)室保存；人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株(SH-SY5Y)為山東大學(xué)藥理教研室惠贈；感受態(tài)大腸桿菌TOP10(TSC-C12)購自北京擎科生物科技有限公司；真核細(xì)胞表達(dá)載體pCMV-2B(L5620)，用于檢測啟動子活性的熒光素酶報(bào)告基因載體pGL3-basic(E1751)、pGL3-promoter(E1761)、海腎螢光素酶報(bào)告基因載體pRL-TK載體(E2241)購自美國Promega公司；克隆載體pMD18-T(6011)購自日本TaKaRa公司；過量表達(dá)GRHL3的表達(dá)載體pCMV-2B-GRHL3由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建。

1.2 主要試劑

DMEM高糖培養(yǎng)基(SH30022.01B)購自美國Hyclone公司；胎牛血清(10099-141)購自美國Gibco公司；質(zhì)粒提取試劑盒(D6943-02)購自美國Omega公司；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒(E1910)購自美國Promega公司；Ex Taq酶(RR53A)購自日本TaKaRa公司；轉(zhuǎn)染試劑(IMA202001S)購自北京IMAGEN公司；兔源抗Flag抗體(14793s)、ChIP試劑盒(9002S)購自美國Cell Signaling Technologies公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Q204)購自新貝生物有限公司；突變試劑盒(SMK-101)購自日本TOYOBO公司；SYBR?Green試劑盒(AG11701)購自艾科瑞生物有限公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成

在UCSC網(wǎng)站(http://genome.ucsc.edu/)中，獲得GPR108序列，設(shè)計(jì)并獲得GPR108啟動子序列，在NCBI網(wǎng)站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中，利用Primer-BLAST在線軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，在正向和反向引物的5′端分別添加NheⅠ和Hind Ⅲ酶切位點(diǎn)；在NCBI網(wǎng)站中獲得GRHL3和GPR108的CDS序列，以此為模板分別設(shè)計(jì)反轉(zhuǎn)錄定量聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription quantitative polymerase chain reaction, RT-qPCR)檢測GRHL3和GPR108的引物；定點(diǎn)突變GPR108啟動子引物以GPR108啟動子序列為模板，根據(jù)突變試劑盒說明書設(shè)計(jì)刪除突變引物；以GPR108啟動子序列為模板，根據(jù)染色質(zhì)免疫共沉淀(chromatin immunoprecipitation assay, ChIP)試劑盒說明書設(shè)計(jì)驗(yàn)證GPR108啟動子的PCR引物和qPCR引物序列。所有引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物序列見表1。

表1 引物序列Tab.1 Primers sequence

1.4 GPR108啟動子克隆和pGL3-GPR108-promoter表達(dá)載體構(gòu)建

以人HaCat細(xì)胞基因組DNA為模板，通過PCR克隆獲得野生型的GPR108啟動子DNA片段，作為人GPR108基因的候選啟動子DNA，片段為992 bp。將PCR產(chǎn)物連接在pMD-18T質(zhì)粒構(gòu)建pMD-18T-GPR108-promoter重組載體，NheⅠ和Hind Ⅲ進(jìn)行雙酶切鑒定和測序鑒定。用NheⅠ和Hind Ⅲ雙酶切后獲得目的DNA與pGL3-basic載體連接，構(gòu)建含有GPR108啟動子的重組表達(dá)載體pGL3-GPR108-promoter。

將含有野生型GPR108基因啟動子的表達(dá)載體pGL3-GPR108-promoter和含有突變的GPR108基因啟動子表達(dá)載體pGL3-Mut-GPR108-promoter分別轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，并同時轉(zhuǎn)染過量表達(dá)GRHL3的pCMV-2B-GRHL3表達(dá)載體或?qū)φ蛰d體pCMV-2B，通過檢測熒光素酶活性以驗(yàn)證GRHL3與GPR108啟動子的結(jié)合位點(diǎn)及其對啟動子調(diào)控作用。

1.5 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測

按照轉(zhuǎn)染試劑說明書，將陽性對照pGL3-promoter、陰性對照pGL3-basic、pGL3-GPR108-promoter、pCMV-2B-GRHL3重組表達(dá)載體以及pCMV-2B空載體分別與pRL-TK共同轉(zhuǎn)染239T細(xì)胞；24 h后收集樣品，根據(jù)熒光素酶試劑盒說明書進(jìn)行熒光素酶活性測定。各組5個復(fù)孔。

1.6 定點(diǎn)突變構(gòu)建pGL3-Mut-GPR108-promoter表達(dá)載體

以pGL3-GPR108-promoter質(zhì)粒DNA為模板，利用突變引物進(jìn)行常規(guī)PCR反應(yīng)。PCR結(jié)束后在PCR產(chǎn)物中用2 μL Dpn I，37 ℃作用1 h以消化環(huán)形質(zhì)粒DNA。加T4連接酶將PCR產(chǎn)物進(jìn)行自身環(huán)化。環(huán)化DNA轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌TOP10，提取單克隆的質(zhì)粒DNA進(jìn)行測序鑒定突變克隆。

1.7 ChIP與RT-qPCR

將帶有Flag標(biāo)簽的pCMV-2B-GRHL3過表達(dá)載體轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，放置于37 ℃并含5%(體積分?jǐn)?shù)) CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，去培養(yǎng)基后，用16%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))多聚甲醛固定細(xì)胞。按照ChIP試劑盒說明書操作，利用Flag抗體捕獲GRHL3結(jié)合的DNA。通過PCR驗(yàn)證捕獲GPR108基因啟動子DNA，同時利用實(shí)時熒光定量PCR(ChIP qPCR)進(jìn)行定量分析，使用Input樣品百分?jǐn)?shù)方法，計(jì)算免疫沉淀(immunoprecipitation,IP)效率。

利用Trizol試劑快速提取法提取細(xì)胞總RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作合成cDNA。按照SYBR?Green試劑盒說明書添加反應(yīng)體系進(jìn)行PCR。ChIP實(shí)驗(yàn)的實(shí)時熒光定量PCR(qPCR)，運(yùn)行程序：95 ℃、3 min；95 ℃、15 s，60 ℃、1 min，40個循環(huán)。

1.8 生物信息學(xué)分析與統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

在CCLE數(shù)據(jù)庫(https://portals.broadinstitute.org/ccle/about)中獲得了32種組織癌癥的腫瘤細(xì)胞系基因表達(dá)矩陣，使用R軟件對原始數(shù)據(jù)集進(jìn)行數(shù)據(jù)的可視化，分析GRHL3和GPR108的原始數(shù)據(jù)集在各種組織腫瘤細(xì)胞系中的表達(dá)。通過公共數(shù)據(jù)腫瘤細(xì)胞系測序分析，檢測GRHL3和GPR108的表達(dá)水平，篩選差異明顯腫瘤細(xì)胞系及其疾病以上分析通過R v4.0.3軟件包ggplot2(v3.3.3)構(gòu)建。

2 結(jié)果

2.1 GPR108基因啟動子結(jié)構(gòu)分析

在數(shù)據(jù)庫中找到人GPR108在染色體上的位置，分析并確定GPR108啟動子位置。通過對啟動子序列分析發(fā)現(xiàn)，近端啟動子調(diào)控區(qū)域的一段序列5′-AACCGGTG-3′，GRHL3可能負(fù)調(diào)控GPR108基因的表達(dá)(圖1)。

圖1 GPR108基因位置及GRHL3調(diào)控GPR108示意圖Fig.1 Schematic diagram of GPR108 gene location and GRHL3 regulationGRHL3：grainyhead-like；GPR108：G protein-coupled receptor 108.

2.2 GRHL3與GPR108在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)譜

首先利用CCLE數(shù)據(jù)庫，對32種人腫瘤組織來源的1 000多種腫瘤細(xì)胞系的GRHL3和GPR108表達(dá)水平進(jìn)行可視化分析。這些組織來源的腫瘤包括：脂肪肉瘤、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、腎上腺癌、白血病、骨癌、肝癌、皮膚癌、甲狀腺癌、腦癌、肉瘤、淋巴瘤、腎癌、骨髓瘤、工程化組織、眼癌、肺癌、畸胎瘤、橫紋肌樣瘤、胚胎癌、子宮內(nèi)膜/子宮癌、卵巢癌、胃癌、宮頸癌、膽囊癌、膽管癌、胰腺癌、膀胱癌、前列腺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、食管癌、頭頸癌。結(jié)果顯示這些組織來源的腫瘤細(xì)胞系中GRHL3表達(dá)水平較低，而GPR108具有較高的表達(dá)水平(圖2)。

圖2 腫瘤細(xì)胞的GRHL3和GPR108表達(dá)譜Fig.2 Expression profile of GRHL3 and GPR108 in tumor cells

根據(jù)腫瘤細(xì)胞系的表達(dá)水平，進(jìn)一步篩選出GRHL3和GPR108基因表達(dá)差異明顯的腫瘤細(xì)胞系及其對應(yīng)的疾病，篩選出16種癌癥疾病，這些疾病為：彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤(diffuse large B-cell lymphoma, DLBC)、多發(fā)性骨髓瘤(multiple myeloma, MM)、急性髓系白血病(acute myeloid leukemia, LAML)、皮膚黑色素瘤(skin cutaneous melanoma, SKCM)、肝細(xì)胞癌(liver hepatocellular carcinoma, LIHC)、惡性胸膜間皮瘤(mesothelioma, MESO)、多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(glioblastoma, GBM)、神經(jīng)母細(xì)胞瘤(neuroblastoma, NB)、腎透明細(xì)胞癌(kidney renal clear cell carcinoma, KIRC)、急性淋巴細(xì)胞白血病(acute lymphoblastic leukemia, ALL)、 腦低級別膠質(zhì)瘤(brain lower grade glioma, LGG)、甲狀腺癌(thyroid carcinoma, THCA)、髓母細(xì)胞瘤(medulloblastoma, MB)、前列腺癌(prostate adenocarcinoma, PRAD)、尤文肉瘤(ewing’s sarcoma)、慢性淋巴細(xì)胞白血病(chronic lymphocytic Leukemia, CLL)。并在腫瘤細(xì)胞系測序數(shù)據(jù)中分析GRHL3和GPR108的基因表達(dá)分布見圖2。在數(shù)據(jù)庫提供的多種腫瘤細(xì)胞系中GRHL3與GPR108表達(dá)譜顯示二者具有明顯的對立表達(dá)方式。

2.3 RT-qPCR驗(yàn)證

為了進(jìn)一步驗(yàn)證生物信息學(xué)分析的數(shù)據(jù)，從中任意選取了A-431、Hep G2以及SH-SY5Y共3種腫瘤細(xì)胞系，利用RT-qPCR以檢測GRHL3和GPR108的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，在A-431、Hep G2以及SH-SY5Y等細(xì)胞中，GRHL3的表達(dá)水平均較低；3種細(xì)胞中GPR108具有較高的表達(dá)水平(圖3)。

圖3 RT-qPCR檢測腫瘤細(xì)胞中GRHL3和GPR108表達(dá)Fig.3 RT-qPCR detection of GRHL3 and GPR108 expression in tumor cells

2.4 pGL3-GPR108-promoter表達(dá)載體構(gòu)建和GPR108基因啟動子活性鑒定

為了驗(yàn)證GRHL3對GPR108的表達(dá)可能存在負(fù)調(diào)控作用，本研究以人HaCaT細(xì)胞基因組DNA為模板，通過PCR獲得人GPR108啟動子。候選的人GPR108基因啟動子DNA片段為 992 bp，連接到克隆載體pMD18-T上并將其菌液進(jìn)行PCR鑒定。PCR結(jié)果顯示，提取的單克隆中為陽性重組載體。將單克隆進(jìn)行擴(kuò)增、提取質(zhì)粒DNA并進(jìn)行NheI和Hind III 雙酶切鑒定，瓊脂糖凝膠電泳顯示條帶位置與目的片段一致的DNA。將此目的DNA亞克隆到pGL3-basic載體并進(jìn)行雙酶切鑒定，獲得992 bp的目的DNA。將重組載體進(jìn)行DNA測序，測序結(jié)果與原序列進(jìn)行比對證實(shí)目的基因無突變。這些結(jié)果證實(shí)成功構(gòu)建了pGL3-GPR108-promoter表達(dá)載體。

為驗(yàn)證克隆的DNA是否具有啟動子活性，將pGL3-GPR108-promoter表達(dá)載體轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，進(jìn)行雙熒光素酶報(bào)告基因檢測系統(tǒng)，以檢測GPR108啟動子活性，結(jié)果證實(shí)，GPR108基因啟動子能夠驅(qū)動下游熒光素酶報(bào)告基因的表達(dá)，提示具有啟動子功能，并且pGL3-basic、pCMV-2B與pCMV-2B-GRHL3均無熒光活性(圖4)。

圖4 pGL3-GPR108-promoter 表達(dá)載體構(gòu)建Fig.4 Construction of pGL3-GPR108-promoter expression vector

2.5 GRHL3與GPR108基因啟動子調(diào)控關(guān)系及作用位點(diǎn)鑒定

獲得GPR108基因啟動子并找到潛在結(jié)合位點(diǎn)。通過同源比對檢測，在GPR108近端啟動子區(qū)域中發(fā)現(xiàn)了一個高度保守的GRHL結(jié)合位點(diǎn)，比對同源物種分別為：人類、東北虎、中華菊頭蝠、花豹、家貓以及獵豹。設(shè)計(jì)特異引物，利用PCR方法將pGL3-GPR108-promoter中與GRHL3相結(jié)合的潛在位點(diǎn)5′-AACCGGTG-3′進(jìn)行刪除突變，將突變后的表達(dá)載體再進(jìn)行DNA測序驗(yàn)證。

測序結(jié)果顯示GPR108基因啟動子GRHL3潛在位點(diǎn)已被成功刪除，從而獲得突變啟動子的表達(dá)載體pGL3-Mut-GPR108-promoter(圖5)。

在過量表達(dá)GRHL3的情況下，突變的GPR108基因啟動子表達(dá)載體的熒光素酶活性較野生型啟動子明顯增加，GRHL3結(jié)合位點(diǎn)突變后，GRHL3與GPR108基因啟動子結(jié)合能力減弱，負(fù)調(diào)控作用減弱；同時發(fā)現(xiàn)在沒有GRHL3過量表達(dá)情況下，突變的GPR108基因啟動子表達(dá)載體的熒光素酶活性比過量表達(dá)GRHL3時明顯增高，GPR108基因啟動子可能還存在其他GRHL3的結(jié)合位點(diǎn)。在兩組空載體對照組中，野生型GPR108基因啟動子的活性低于突變型GPR108基因啟動子，其原因可能與293T細(xì)胞內(nèi)源的GRHL3抑制作用有關(guān)。

根據(jù)GPR108基因啟動子的基序5′-AACCGGTG-3′上游和下游設(shè)計(jì)引物分別進(jìn)行PCR(擴(kuò)增產(chǎn)物192 bp)和qPCR(擴(kuò)增產(chǎn)物99 bp)。PCR擴(kuò)增后的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，獲得擴(kuò)增的DNA片段與預(yù)期一致；同時qPCR結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)錄因子GRHL3可以結(jié)合GPR108啟動子，并且可以與后者的特定序列相結(jié)合(圖5F)。

圖5 轉(zhuǎn)錄因子GRHL3調(diào)控GPR108啟動子Fig.5 Transcription factor GRHL3 regulates GPR108 promoter

3 討論

GRHL家族成成員其主要功能是作為核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子，參與調(diào)控多種靶基因的表達(dá)[14-22]。例如，GRHL通過多巴脫羧酶(DOPA decarboxylase，Ddc)基因的反式激活來維持角質(zhì)層的完整性[5,23]；Grhl1和Grhl3通過協(xié)同調(diào)控轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(transglutaminase，TGMs)維持小鼠表皮通透性屏障[1,24]；GRHL2調(diào)控口腔鱗狀細(xì)胞癌(oral squamous cell carcinoma，OSCC)細(xì)胞中人類端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶(htelomerase reverse transcriptase，hTERT)基因的表達(dá)，提示在細(xì)胞永生過程中端粒酶的激活起作用[21]。在果蠅和小鼠中，Grhl3調(diào)節(jié)許多類型的終端分化基因，這些基因是表皮屏障形成所需的[25]。GRHL3作為一種促進(jìn)分化和遷移的轉(zhuǎn)錄因子，在角化細(xì)胞分化過程中，它優(yōu)先結(jié)合到超增強(qiáng)子，而在遷移過程中，它優(yōu)先結(jié)合到啟動子，抑制遷移抑制劑的表達(dá)[26]。GRHL3也可直接或間接結(jié)合到近端E-cadherin啟動子中的E-boxes，抑制E-cadherin基因表達(dá)，從而導(dǎo)致細(xì)胞的遷移和侵襲能力顯著增加[27]。這些研究表明，GRHL3可以結(jié)合基因的啟動子并進(jìn)行調(diào)控。

GPR108作為G蛋白偶聯(lián)受體家族成員，其表達(dá)規(guī)律及調(diào)控機(jī)制均不清楚。利用公開數(shù)據(jù)庫，本研究分析了GRHL3與GPR108在許多不同腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)規(guī)律，結(jié)果顯示二者的表達(dá)譜存在負(fù)調(diào)控的特點(diǎn)；隨機(jī)選取的3種腫瘤細(xì)胞系進(jìn)行RT-qPCR驗(yàn)證GRHL3與GPR108的表達(dá)水平，結(jié)果與數(shù)據(jù)庫表達(dá)譜一致。因此，GRHL3可能在腫瘤發(fā)生過程中發(fā)揮抑制作用，而GPR108在腫瘤發(fā)生過程中具有促進(jìn)作用。

研究[27]發(fā)現(xiàn)，Grainyhead轉(zhuǎn)錄因子及GRHL3在參與調(diào)控靶基因表達(dá)時，靶基因的啟動子等調(diào)控區(qū)存在其結(jié)合的到特定保守序列。其中常見的保守結(jié)合序列為5′-AACCGGTT-3′或5′-AACCTGTT-3′，當(dāng)GRHL3結(jié)合后顯著抑制靶基因的表達(dá)。目前有關(guān)GPR108的表達(dá)調(diào)控機(jī)制未見報(bào)道。通過對GPR108基因啟動子序列分析，發(fā)現(xiàn)GPR108基因上游調(diào)控區(qū)的基因啟動子區(qū)域，在第一個外顯子上游的-992 bp位點(diǎn)，存在GRHL3的結(jié)合保守序列5′-AACCGGTG-3′，提示GRHL3通過結(jié)合該序列對GPR108的表達(dá)存在負(fù)調(diào)控作用。這也是大多數(shù)真核細(xì)胞轉(zhuǎn)錄調(diào)控的主要方式之一。在本研究中，通過基因克隆技術(shù)成功克隆GPR108基因外顯子上游992 bp的DNA，利用熒光素酶分析證實(shí)其具有啟動子功能；當(dāng)與GRHL3過量表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染時，GPR108啟動子活性被有效抑制。從而證實(shí)GPR108的表達(dá)受到GRHL3的負(fù)調(diào)控。

生物學(xué)信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)GPR108基因中的啟動子區(qū)域高度保守序列5′-AACCGGTG-3′，可能是GRHL3潛在結(jié)合位點(diǎn)，其位于轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游-171 bp。為進(jìn)一步驗(yàn)證其結(jié)合GRHL3的調(diào)控作用，對該保守序列進(jìn)行定點(diǎn)刪除突變和熒光素酶活性分析，結(jié)果證實(shí)GRHL3抑制GPR108表達(dá)是與該序列密切相關(guān)；ChIP結(jié)果也證實(shí)GPR108基因的5′-AACCGGTG-3′是GRHL3的特異結(jié)合位點(diǎn)；GRHL3抑制GPR108表達(dá)的主要機(jī)制是GRHL3與GPR108啟動子的5′-AACCGGTG-3′發(fā)生了相互作用。同時，本研究結(jié)果顯示對該保守序列進(jìn)行定點(diǎn)突變的啟動子，在GRHL3存在情況下，GPR108基因啟動子活性仍然有一定的抑制作用，提示GPR108基因啟動子區(qū)域除存在保守結(jié)合序列外，可能存在多個GRHL3結(jié)合位點(diǎn)，這將在后續(xù)研究中進(jìn)一步進(jìn)行驗(yàn)證。

本研究利用分子生物學(xué)方法成功克隆人GPR108基因上游調(diào)控區(qū)DNA，并證實(shí)其具有啟動子功能；該啟動子存在轉(zhuǎn)錄因子GRHL3特異性結(jié)合的保守序列5′-AACCGGTG-3′，GRHL3可以通過結(jié)合該保守序列DNA，對GPR108基因表達(dá)發(fā)揮明顯的抑制作用。這為后續(xù)研究GPR108的表達(dá)規(guī)律、揭示其生理功能及其在炎性反應(yīng)中作用奠定重要基礎(chǔ)。