王 爽 潘 陽 徐新民 栗雅杰 周 淳 張 悅 王雅杰*

(1.首都醫(yī)科大學附屬北京地壇醫(yī)院檢驗科，北京 100015； 2. 北京市疾病預(yù)防控制中心傳染病地方病控制所，北京 100013)

隨著新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)疫情的爆發(fā)和流行，新型冠狀病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2)核酸檢測已經(jīng)成為各臨床實驗室不可缺少的檢測項目。大規(guī)模爆發(fā)和聚集性疫情的產(chǎn)生使得實驗室的檢測壓力出現(xiàn)前所未有的增加[1-2]。面對檢測任務(wù)的增加，實驗室正常運行是最重要的保障，其中避免實驗室污染以及實驗室一旦發(fā)生核酸污染后的消除也是實驗室負責人必須重視的一項內(nèi)容。

假陽性主要來源于實驗室環(huán)境污染、標本污染、非特異性擴增等[2-3]。個別假陽性情況能通過復(fù)查核酸或重新提取后糾正過來。如出現(xiàn)一些特殊情況，如一個96孔板中有很多陽性，或重復(fù)測試仍為陽性，但這種檢測結(jié)果和流行病學或臨床不符，就必須考慮是實驗室本身的問題。篩查為主的核酸檢測機構(gòu)出現(xiàn)檢測假陽性主要是陽性質(zhì)控品造成的，包括含待測基因的質(zhì)?；蚣俨《?。對于收治確診患者的定點醫(yī)療機構(gòu)或接觸入境陽性人員的實驗室，如實驗操作不當?shù)仍?，陽性樣本發(fā)生溢撒或產(chǎn)生大量氣溶膠，可使周圍環(huán)境被病毒污染[4-6]。實驗室一旦發(fā)生核酸污染，檢測工作必須緊急停止，直到確定消除污染后才能重新開始檢測。發(fā)生核酸污染后需要第一時間查找污染源和污染原因，明確原因后才能采取有效的去污染措施。本文的目的是建立實驗室內(nèi)部的污染鑒別方法，當實驗室出現(xiàn)污染后，能及時鑒定出污染類型，從而縮小并明確造成污染的原因，使得檢測工作盡快恢復(fù)。

1 材料與方法

1.1 樣本

A組DNA質(zhì)粒型陽性質(zhì)控品：含N基因、ORF1ab基因片段；B組RNA假病毒陽性質(zhì)控品：含N基因、ORF1ab基因片段的假病毒和RNP基因的假病毒混合物；實驗當日5例確診患者弱陽性核酸樣本，編號為S101、S102、S103、S104和S110。本研究獲得首都醫(yī)科大學附屬北京地壇醫(yī)院倫理委員會批準(倫理編號：2020-060)。所有研究對象均簽署了知情同意書。

1.2 儀器與試劑

天隆Gentier 96E型實時熒光定量PCR儀購自西安天隆科技有限公司；核酸提取試劑(QIAamp Viral RNA Mini Kit，批號：166020025)購自德國QIAGEN公司；達安新型冠狀病毒2019-nCoV核酸檢測試劑盒(批號:2021056)購自中山大學達安基因股份有限公司；DNase為TURBO DNA-freeTM試劑盒(Invitrogen，批號：01049921)購自美國賽默飛世爾科技公司。

1.3 方法

1.3.1 樣本的處理

由污染引起的擴增都在較高循環(huán)閾值cycle threshold (Ct)水平，使用無RNA酶水將A組DNA質(zhì)粒型陽性質(zhì)控品進行4個稀釋度(5、25、125和625倍)的稀釋。B組假病毒已知濃度為1×104拷貝/mL，無須稀釋。選取的5例確診患者核酸樣本ORF1ab基因和N基因PCR檢測的原始Ct值在33～40之間，無須稀釋。

1.3.2 DNase的使用

吸取15 μL樣本到0.5 mL EP管中，加入2 μL 10×TURBO DNase 緩沖液和1 μL TURBO DNase。對照組為15 μL樣本加入2 μL 10×TURBO DNase 緩沖液和1 μL H2O，金屬浴37 ℃反應(yīng)30 min。在反應(yīng)后的各管中加入2 μL DNase 滅活劑，室溫放置5 min，離心2 min，吸取上清作為下一步模板。

1.3.3 PCR反應(yīng)程序

根據(jù)達安新型冠狀病毒2019-nCoV核酸檢測試劑盒說明書中的程序進行PCR反應(yīng)，反應(yīng)程序詳見表1，在進行RNA組分鑒別時，去掉步驟1的反轉(zhuǎn)錄過程，只保留步驟2和步驟3進行擴增。檢測通道為：VIC通道(ORF1ab基因)、FAM通道(N基因)和CY5通道(內(nèi)標RNP基因)。由于不同廠家的檢測試劑差異，對于A組和B組陽性質(zhì)控品，達安新型冠狀病毒2019-nCoV核酸檢測試劑盒只能擴增出N基因，不能擴增出ORF1ab基因。

表1 PCR反應(yīng)程序Tab.1 PCR setup

1.4 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 DNase對不同模板濃度(稀釋度)的抑制情況比較

使用DNase進行DNA類型污染的鑒別，由于實際工作中DNase的使用是按照說明書進行的，對于模板的濃度含量是否產(chǎn)生不同的結(jié)果需要實驗來驗證。將A組DNA質(zhì)粒型陽性質(zhì)控品的4種稀釋水平使用DNase處理前后的N基因擴增檢測情況，結(jié)果如圖1所示，A圖顯示對照組在4種稀釋水平均可以正常擴增出N基因的擴增曲線，B圖顯示的DNA型陽性質(zhì)控品在經(jīng)DNase處理后均無法擴增出目標片段，表明DNase對各稀釋度的DNA模板都可以清除降解。

圖1 比較DNase處理與否對DNA質(zhì)粒型陽性質(zhì)控品的擴增情況影響Fig.1 Comparison of the amplification of DNA plasmid positive quality control samples with or without DNase treatment

A：theNgene amplification curves of four positive quality control samples with different dilutions;B：no amplification curve in four DNase treatment groups;RFU: relative fluorescence units.

2.2 DNase不同處理時間的擴增結(jié)果比較

為探討DNase處理時間對擴增結(jié)果的影響，使用DNase處理2.1中4種稀釋度的DNA質(zhì)粒質(zhì)控品，反應(yīng)時間分別設(shè)定為15、30和60 min。將酶消化后的DNA質(zhì)控品作為擴增模板進行靶基因(N基因)的擴增，Ct值結(jié)果如表2所示，將4個稀釋度下對照組3個時間點的N基因Ct值進行比較，數(shù)據(jù)顯示3組之間的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。4個稀釋度下DNase處理15、30和60 min后檢測N基因均無曲線擴增，說明DNase處理時間在15 min以上均可起到清除DNA模板的作用。

表2 A組DNA質(zhì)粒型陽性質(zhì)控品在對照和DNase不同作用時間下N基因檢測Ct值比較Tab.2 Comparison of Ct value of N gene of DNA plasmid positive quality control samples at 3 different DNase treatment time

2.3 DNase對RNA成分擴增的影響

為探索DNase對RNA擴增的影響，使用DNase處理RNA型假病毒的陽性質(zhì)控品。從圖2中可以看出，RNA型假病毒的陽性質(zhì)控品經(jīng)DNase處理前(圖2A)、后(圖2B)，ORF1ab和N基因的擴增曲線并沒有發(fā)生變化。而從陽性患者標本的擴增曲線看(圖2C、D)，經(jīng)DNase處理后的曲線會發(fā)生后移，Ct值相應(yīng)增大(圖3，表3)。值得注意的是，當檢測 Ct 值過高的核酸樣本時，DNase處理后會使核酸濃度有所降低，可能會導(dǎo)致高Ct值(灰區(qū)附近)的檢測結(jié)果呈現(xiàn)陰性(表3)。

圖2 DNase處理不影響RNA組分的擴增。Fig.2 The amplification of RNA components was not affected with DNase treatment

表3 5例患者核酸經(jīng)DNase處理后ORF1ab和N基因的Ct值檢測結(jié)果變化Tab.3 Comparison of Ct values of ORF1ab and N genes after DNase treatment in 5 confirmed patients

2.4 RNA類污染的鑒別

A組DNA質(zhì)粒型陽性質(zhì)控品、B組RNA類型假病毒，按試劑盒說明書設(shè)置反應(yīng)條件，將步驟1反轉(zhuǎn)錄(50 ℃,15 min)去除后，開始擴增檢測。從圖3A、B兩圖可以看出，完整反應(yīng)條件下可以擴增出RNA類型假病毒的N基因和RNP內(nèi)標基因，去除這一步驟則不能擴增出目的片段；質(zhì)粒型陽性質(zhì)控品為DNA成分，去掉反轉(zhuǎn)錄后(圖3D)仍然能和完整反應(yīng)條件下一樣(圖3C)正常擴增，且Ct值接近原始核酸檢測Ct值，提示DNA成分沒有反轉(zhuǎn)錄過程也可以正常擴增。

圖3 去除反轉(zhuǎn)錄步驟的擴增可以對比驗證RNA類型的污染情況Fig.3 The amplification without reverse transcription in RT-PCR could be used to identify and verify the contamination of RNA type

2.5 核酸污染類型鑒別

由于實時熒光RT-PCR方法通常無法區(qū)分所檢測核酸片段的類型，通過結(jié)合去除反轉(zhuǎn)錄步驟以及使用DNase兩種處理方式比較前后結(jié)果的變化來鑒別核酸污染類型。①去除反轉(zhuǎn)錄步驟結(jié)果無變化，DNase處理后結(jié)果陰性，可鑒定為DNA類型污染；②去除反轉(zhuǎn)錄步驟結(jié)果陰性，DNase處理后無變化，可鑒定為RNA類型污染；③去除反轉(zhuǎn)錄步驟結(jié)果陰性，DNase處理后Ct值增高或結(jié)果為陰性，可鑒定為RNA類型污染(模板被DNase稀釋所致)；④單獨通過去除反轉(zhuǎn)錄步驟、DNase處理步驟后結(jié)果為陽性，說明存在DNA和RNA兩種類型共同污染(表4)。

表4 核酸污染類型鑒定策略總結(jié)Tab.4 Summary of identification strategy

3 討論

核酸檢測具有靈敏度高、特異性好的特點，但對于核酸檢測結(jié)果的準確性，需要從多方面因素來保證。由于核酸檢測陽性結(jié)果被視為SARS-CoV-2感染診斷的金標準[2,7-8]，陽性結(jié)果的報告直接決定相關(guān)疫情的后續(xù)處理，因樣本在實驗室受污染而導(dǎo)致“陽性”的情況在很多實驗室都出現(xiàn)過，而假陽性情況則會造成人員恐慌以及流行病學調(diào)查和防控措施過度等問題[9-10]。除了考慮實驗室生物安全、風險評估等措施[11-12]，根據(jù)SARS-CoV-2核酸檢測的基本原理和條件，從檢測樣本采集、運輸、保存的方式，試劑盒的質(zhì)量，以及臨床實驗室的管理等多方面，鑒定出污染類型的工作也是應(yīng)對實驗室檢測“假陽性”的重要工作之一。

這里筆者分別結(jié)合DNA型陽性質(zhì)控品、RNA型陽性質(zhì)控品和陽性患者核酸標本使用實驗室內(nèi)的試劑來進行污染類型的鑒別并總結(jié)。使用商品化DNase處理鑒定DNA類型的污染已經(jīng)在實驗中得到了證實。對于Ct值高至29(1∶5稀釋)的陽性質(zhì)控品，將反應(yīng)時間減少至15 min都可以通過DNase清除抑制，從而鑒定出DNA污染類型[13-14]。本結(jié)果也顯示，鑒定低載量(較高Ct值)樣本核酸時，DNA酶處理后可能會使RNA濃度進一步降低，導(dǎo)致檢測結(jié)果為陰性。實際上，很多污染現(xiàn)象都是以小翹尾的形式出現(xiàn)的，應(yīng)使用另外一到兩種擴增不同區(qū)域的高靈敏檢測試劑進行驗證。RNA類的污染可見于滅活疫苗的污染，含有靶基因的假病毒污染，陽性樣本的污染等。一些操作失誤如加樣器深入陽性樣本采樣管時沾染，表面活性劑在管口產(chǎn)生氣泡或液體滴撒操作臺面等均可能導(dǎo)致核酸污染。同時，有證據(jù)[6]顯示SARS-CoV-2的氣溶膠傳播，在這些患者產(chǎn)生的氣溶膠濃度達到105拷貝/mL。對于RNA類型的鑒別，最直接有效的方法即將完整的實時熒光定量PCR步驟去除反轉(zhuǎn)錄過程，使得RNA成分無法反轉(zhuǎn)錄，進而中斷目標基因的擴增。這一方法的優(yōu)勢是簡單快速，不需要額外的試劑，唯一的不足是痕量DNA的污染也會影響最后的污染類型推斷。

各個實驗室都有應(yīng)對污染的有力措施。首先是實驗室的設(shè)施保障，比較理想的結(jié)構(gòu)是在獨立的PCR實驗室進行核酸提取和加樣，然后將加完樣的反應(yīng)體系轉(zhuǎn)運至擴增室進行擴增。這樣既可以避免擴增產(chǎn)物對樣本制備過程的污染，也可以避免樣本制備區(qū)泄漏的生物安全風險。對于常出現(xiàn)的擴增區(qū)產(chǎn)物污染，很多好習慣是簡單易行的，如對完成的PCR反應(yīng)管蓋嚴后迅速放入密閉的醫(yī)療垃圾桶并及時處理；加強擴增區(qū)的消毒(消毒劑擦地、紫外燈照射)和通風。無論是怎樣的實驗室設(shè)置，盡可能實施空氣通風來消除SARS-CoV-2氣溶膠是預(yù)防污染的最佳手段[6]。引起實驗室假陽性的原因多種多樣，涉及實驗活動的方方面面，尋找準確原因不是件容易的事。但是，可以通過先鑒別出污染的類型來縮小懷疑的范圍，以便逐一排查，最后準確定位。另一方面，準確地了解污染情況對開展預(yù)防工作也是十分重要的提示，很有可能鑒定出的污染情況是以前沒有關(guān)注過的實驗習慣和手法，對生物安全意識和更正操作步驟都很有意義。后期筆者會將這一方法應(yīng)用到實際工作中，如出現(xiàn)實驗室環(huán)境、確診患者病區(qū)及與流行病學不符的人員標本等檢測出現(xiàn)結(jié)果陽性的情況，通過本方法來鑒別出所測標本陽性的類型，并確定與實際結(jié)果不符的原因，為方艙實驗室新型冠狀病毒核酸檢測積累更多經(jīng)驗。