孫 瑩， 李 松， 胡國斌??

(1. 中國海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院， 山東 青島 266003； 2. 中國海洋大學(xué)海洋生物多樣性與進(jìn)化研究所， 山東 青島 266003)

先天免疫系統(tǒng)是抵御微生物入侵的古老宿主防御系統(tǒng)。模式識別受體(Pattern recognition receptors，PRRs)是先天性免疫系統(tǒng)的重要組成部分，負(fù)責(zé)識別病原體的病原相關(guān)分子模式(Pathogen associated molecular pattern，PAMPs)，激活宿主免疫反應(yīng)[1-2]。Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)屬于Ⅰ型跨膜蛋白，是一類最早被鑒定出來的PRRs，含有 3 個(gè)保守的結(jié)構(gòu)域：胞外富含亮氨酸的重復(fù)結(jié)構(gòu)域(Leucine-rich repeat，LRR)、跨膜結(jié)構(gòu)域和胞內(nèi)胞內(nèi) Toll/白細(xì)胞介素-1受體結(jié)構(gòu)域(Toll/interleukin-1 receptor，TIR)[3]。LRR結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)識別PAMPs，并通過序列變化和LRR的數(shù)量決定著TLR的特異性[4-5]。TIR結(jié)構(gòu)域通過MyD88依賴或非依賴信號通路傳遞信號[6]。在脊椎動物中，已發(fā)現(xiàn)20多個(gè)TLR，并將其分為6個(gè)亞家族：TLR1(TLR1、TLR2、TLR6、TLR10、TLR14、TLR15、TLR16、TLR18、TLR25、TLR27和TLR28)、TLR3、TLR4、TLR5(TLR5和可溶類型TLR5S)、TLR7(TLR7、TLR8和TLR9)和TLR11(TLR11、TLR12、TLR13、TLR19、TLR20、TLR21、TLR22、TLR23、TLR24和TLR26)亞家族[7]。

TLR14是非哺乳動物受體，是TLR1家族的新成員。目前，已在河豚(Takifugurubripes)[8]、非洲爪蟾(Xenopustropicalis)[9]、七鰓鰻(Lampetrajaponica)[10]、牙鲆(Paralichthysolivaceus)[11]、斜帶石斑魚(Epinepheluscoioides)[12]、鮸魚(Miichthysmiiuy)[13]、大刺鰍(Mastacembelusarmatus)[14]、金鯧魚(Trachinotusovatus)[15]、黃姑魚[16](Nibeaalbiflora)和鱖魚(Sinipercachuatsi)[17]中被鑒定出來。研究表明，硬骨魚TLR14在用愛德華氏菌(Edwardsiellatarda)或刺激隱核蟲(Cryptocaryonirritans)刺激后轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)[11-12]，可以識別細(xì)菌組分，觸發(fā)宿主的炎癥反應(yīng)[18]。在哺乳動物中，TLR2可以與TLR1、TLR6、TLR10形成同二聚體或異二聚體，來識別病原體[19]。TLR2在硬骨魚和哺乳動物之間具有功能保守性[20]，但在硬骨魚中，TLR1家族中沒有TLR6和TLR10的直系同源物。因此，TLR14可能是哺乳動物TLR6和TLR10的功能替代品[11]。然而，還沒有研究表明TLR14特異性識別的配體有哪些。

大菱鲆(Scophthalmusmaximus)是中國北方重要的海水養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)魚類。隨著海水養(yǎng)殖業(yè)的迅速發(fā)展，由細(xì)菌和病毒引起的疾病已使大菱鲆養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)產(chǎn)生了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，因此，如何預(yù)防和控制大菱鲆疾病仍然是一個(gè)養(yǎng)殖難題。之前，本研究團(tuán)隊(duì)已經(jīng)從大菱鲆中鑒定了TLR2、TLR3、TLR5M，TLR21和TLR22基因并研究了它們的免疫應(yīng)答表達(dá)模式[20-24]。在本研究中，我們從大菱鲆中克隆并鑒定了TLR14基因，通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR對其在正常組織和被脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)、肽聚糖(Peptidoglycan，PGN)感染的組織中表達(dá)模式進(jìn)行了研究。將SmTLR14的編碼序列(Coding sequence，CDS)連接到綠色熒光蛋白載體中，使用共聚焦顯微鏡確定其亞細(xì)胞定位。分析了SmTLR14過表達(dá)對下游免疫相關(guān)因子TNF-α，IL-1β，IL-8，IFN-1，IRF-1和IRF-3表達(dá)的影響。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料及處理

大菱鲆幼魚(平均體質(zhì)量(54.7±3.1) g，n=140)購自青島市臺東南山市場，采購的大菱鲆在實(shí)驗(yàn)室50 L的水族箱中暫養(yǎng)一周，每個(gè)水族箱養(yǎng)10條，水族箱中的水不斷循環(huán)、充氣，水溫維持在18 ℃。

LPS (L2880,Escherichiacoli055:B5) 購自美國Sigma公司，PGN (S11184,Staphylococcusaureus) 購自上海源葉生物技術(shù)有限公司。2個(gè)實(shí)驗(yàn)組的大菱鲆分別從腹膜內(nèi)注射LPS(10 mg/mL，每條魚100 μL)或PGN(0.4 mg/mL，每條魚100 μL)，對照組的大菱鲆注射相同體積的PBS。分別在注射后0 h，3 h，6 h，12 h，1 d，2 d，3 d，5 d時(shí)，從2個(gè)實(shí)驗(yàn)組及對照組中各選3條魚，用0.1%(w/v)的MS-222麻醉，解剖取出鰓、頭腎、脾臟和肌肉，于-80 ℃儲存，直至用于基因表達(dá)分析。

從3條未處理的健康魚中取出腦、鰓、胃、腸、心臟、頭腎、體腎、脾臟、肝、性腺、肌肉和皮膚，于-80 ℃儲存，直至用于組織分布研究。

所有動物實(shí)驗(yàn)均已獲得中國疾病預(yù)防控制中心實(shí)驗(yàn)動物護(hù)理倫理委員會的批準(zhǔn)(實(shí)驗(yàn)批準(zhǔn)號：120；批準(zhǔn)日期：2011-09-03)。

1.2 提取RNA及基因組DNA

使用Isogen試劑(Nippon Gene, 日本)提取各組織總RNA。使用Turbo DNA-free Kit(Ambion, 美國)處理RNA樣品以去除基因組DNA污染。使用NanoDrop 2000分光光度計(jì)(Thermo Scientific，美國)在260 nm處測量吸光度來確定RNA濃度，樣品合格標(biāo)準(zhǔn)是A260/A280在1.8～2.0之間且A260/A230>2.0。使用1.2%甲醛變性的瓊脂糖凝膠電泳來檢測RNA樣品的完整性。使用苯酚-氯仿提取方法從肌肉中提取基因組DNA。

1.3 SmTLR14 cDNA和基因的克隆

從大菱鲆頭腎中提取1 μg總RNA，使用SMART cDNA Library Construction Kit(Clontech, 美國)轉(zhuǎn)錄出雙鏈cDNA文庫。根據(jù)已知魚類TLR14的保守序列，設(shè)計(jì)簡并引物(見表1)，通過同源克隆得到SmTLR14的1 517 bp核心cDNA序列，通過Genome Walking Kit (TaKaRa，大連)和3′-RACE法得到5′-和3′-末端片段。使用Genetyx 6.0軟件編輯以上3個(gè)序列，將其拼接為連續(xù)編碼序列。設(shè)計(jì)基因特異性引物TLR14-gF1，TLR14-gR1和TLR14-gF2，TLR14-gR2(見表1)，以基因組DNA為模板，通過PCR反應(yīng)擴(kuò)增出對應(yīng)于已知cDNA區(qū)域的兩個(gè)部分基因組序列。轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(Transcriptional start site，TSS)由Neural Network Promoter Prediction program (www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html)預(yù)測。隨后，通過PCR擴(kuò)增cDNA庫來鑒定5′-末端片段中包含的cDNA序列。然后編輯cDNA和基因序列。使用Genetyx 6.0軟件比對cDNA與基因組序列，確定外顯子和內(nèi)含子的結(jié)構(gòu)。

1.4 序列分析

使用NCBI BLAST程序(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)，將SmTLR14的測序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比較。使用ExPASy 網(wǎng)站中的Translate工具(http://web.expasy.org/translate/)將核苷酸序列翻譯為蛋白質(zhì)序列。使用SignalP 4.1服務(wù)器(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP)預(yù)測信號肽序列。根據(jù)Matsushima等描述的方法鑒定LRR[25]。使用SMART軟件 (http://smart.embl-heidelberg.de/)預(yù)測TM結(jié)構(gòu)域和TIR結(jié)構(gòu)域。使用Clustal Omega(https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/)進(jìn)行蛋白質(zhì)序列的多重排列。在MEGA X中，利用鄰接(Neighbor-joining，NJ)法和1 000次自舉測試構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Quantitative real-time PCR)研究SmTLR14mRNA的組織分布，研究在LPS或PGN刺激的情況下該基因在免疫器官(鰓、頭腎和脾臟)和非免疫器官(肌肉)中的表達(dá)情況。使用Superscript First Strand Synthesis System (Invitrogen,美國)將每個(gè)組織的1.0 μg總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。反應(yīng)體系：10 μL熒光染料，0.2 μmol/L引物(正向/反向)，1.0 μL cDNA模板(10 ng/μL)，ddH2O補(bǔ)至20 μL。反應(yīng)程序：95 ℃、10 min；95 ℃、10 s，60 ℃、30 s，72 ℃、25 s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。在40個(gè)循環(huán)結(jié)束后進(jìn)行熔解曲線分析，以確定PCR產(chǎn)物的特異性。所有樣品均設(shè)置3個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn)。在組織分布分析中，將RPSD基因作為內(nèi)參基因，在基因表達(dá)分析中，將ACTB基因作為內(nèi)參基因，根據(jù)2-ΔΔCT方法計(jì)算出相對于對照組中表達(dá)水平的倍數(shù)變化[26-27]。

表1 本研究中所用的引物序列

1.6 pEGFP-C1-SmTLR14真核重組表達(dá)質(zhì)粒及pcDNA3.1-SmTLR14重組過表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

設(shè)計(jì)含有BamHⅠ(Takara，大連)和HindⅢ(Takara，大連)限制性酶切位點(diǎn)的引物(見表1)，通過PCR擴(kuò)增SmTLR14的開放閱讀框(Open reading frame，ORF)。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收純化，將PCR產(chǎn)物及pEGFP-C1載體(豐暉生物，長沙)用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和HindⅢ進(jìn)行雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳檢測并回收。隨后將帶有酶切位點(diǎn)的SmTLR14序列用T4連接酶連接到pEGFP-C1載體上，轉(zhuǎn)化后，用菌落PCR及雙酶切驗(yàn)證，送出測序，最終得到pEGFP-C1-SmTLR14真核重組表達(dá)質(zhì)粒。過表達(dá)質(zhì)粒是pcDNA3.1(+)(豐暉生物，長沙)，酶切位點(diǎn)選的也是BamHⅠ和HindⅢ，所以用上述同樣的方法構(gòu)建出pcDNA3.1-SmTLR14重組過表達(dá)質(zhì)粒。

1.7 TK細(xì)胞的培養(yǎng)

大菱鲆腎(Turbot kindey，TK)細(xì)胞由中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所陳松林研究員贈送，細(xì)胞培養(yǎng)在含20%的胎牛血清(Gibco，美國)、1%的雙抗(Solarbio，北京)及5 ng/mL的堿性成纖維細(xì)胞生長因子(STEMCELL，加拿大)的L-15培養(yǎng)基(Solarbio，北京)中，在24 ℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染時(shí)，將細(xì)胞培養(yǎng)在24 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中。

1.8 共聚焦實(shí)驗(yàn)

在24孔板中放入爬片，將TK細(xì)胞按照每孔(2～3)×105個(gè)的標(biāo)準(zhǔn)接種在24孔培養(yǎng)板中。待細(xì)胞密度長到80%～90%時(shí)，用Lipofectamine 2000(Invitrogen，美國)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，實(shí)驗(yàn)組轉(zhuǎn)染0.5 μg pEGFP-C1-SmTLR14質(zhì)粒，對照組轉(zhuǎn)染0.5 μg pEGFP-C1空質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染24 h后，將細(xì)胞用PBS漂洗兩次，在室溫下用4%多聚甲醛固定15～20 min，再用PBS漂洗2次。將爬片取出倒扣在滴有抗熒光淬滅封片液的載玻片上，封片后，用Leica SP8共聚焦顯微鏡觀察。

1.9 SmTLR14過表達(dá)對下游免疫相關(guān)基因表達(dá)的影響

提前一天將TK細(xì)胞按照每孔(1～2)×106個(gè)的標(biāo)準(zhǔn)接種在6孔培養(yǎng)板中，待細(xì)胞密度達(dá)到80%時(shí)轉(zhuǎn)染，實(shí)驗(yàn)組轉(zhuǎn)染2.5 μg pcDNA3.1-SmTLR14質(zhì)粒，對照組轉(zhuǎn)染2.5 μg pcDNA3.1空質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染6 h后，用終濃度為50 μg/mL的LPS刺激細(xì)胞。刺激24 h后，參照1.2及1.3的方法提取RNA，合成cDNA。選取ACTB作為內(nèi)參基因，并使用基因特異性引物(見表1)對SmTLR14及其下游TNF-α、IL-1β、IL-8、IFN-1、IRF-1和IRF-3進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析(方法參照1.5)。

2 結(jié)果

2.1 SmTLR14基因序列分析

SmTLR14cDNA(GenBank登錄號：MH396410)長3 364 bp，包括165 bp的5′-非翻譯區(qū)(UTR)，ORF全長2 634 bp，編碼877個(gè)氨基酸(Amino acid，aa)，3′-UTR為565 bp，具有2個(gè)聚腺苷酸加尾序列(ATTAAA)。SmTLR14基因(GenBank登錄號：MH396409)長12 708 bp，由4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子組成(見圖1(a))。TLR14和TLR18是同一分子，在低等真骨魚中，TLR14通常稱為TLR18。SmTLR14的基因結(jié)構(gòu)與亞馬遜帆魚(Poeciliaformosa)和新月魚(Xiphophorusmaculatu)的TLR18相同，與牙鲆和河豚的TLR14相同(見圖2)。推導(dǎo)的SmTLR14蛋白具有一個(gè)信號肽，長度為17 aa(1～17 aa)，其后是細(xì)胞外LRR域(34～606 aa)、TM域(610～632 aa)和細(xì)胞內(nèi)TIR域(665～810 aa)(見圖1(a)和(b))。在LRR域中，有23個(gè)LRR基序，其中有5個(gè)是典型的LRR(LRR-TYP)。LRR域的N端和C端分別含有一個(gè)LRRNT和LRRCT。TIR域含有3個(gè)保守的基序：box 1(YxxFxSY)，box 2(LC-RD-PG)和box 3(FWxxL)(見圖3)。序列比對顯示，SmTLR14與其它魚類的相似性(見圖3)如下：牙鲆為84.2%，金鯧魚為83.6%，斜帶石斑魚為83.5%，花鱸(Lateolabraxmaculatus)為83.2%，日本銀魚(Argyrosomusjaponicus)為82.1%，中國鱚(Sillagosinica)為82.0%，鮸魚為81.7%。

2.2 SmTLR14的系統(tǒng)進(jìn)化分析

TLR14和TLR18是同一分子，采用 MEGA X軟件構(gòu)建了不同物種TLR14/TLR18系統(tǒng)進(jìn)化樹(見圖4)，結(jié)果顯示SmTLR14蛋白與牙鲆、金鯧魚、鮸魚、日本銀魚及花鱸聚為一支，它們之間的同源性較高，其中和牙鲆的同源性最高。

2.3 SmTLR14的組織表達(dá)分析

通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測了SmTLR14mRNA的組織特異性，選取RPSD作為內(nèi)參基因，因?yàn)樗钦Ｉ項(xiàng)l件下跨組織類型最穩(wěn)定的基因[26]。 如圖5所示，SmTLR14在被檢測的12種組織中都有表達(dá)，在脾臟中的表達(dá)量最高，在腸、頭腎和皮膚中含量中等，在性腺和胃中含量較低。

(外顯子用大寫字母表示，內(nèi)含子用小寫字母表示。點(diǎn)表示省略的序列。預(yù)測的信號肽(殘基1～17)用粗體下劃線表示。細(xì)胞外LRR域(殘基34～606)中的LRR基序用灰色底色表示,N端和C端LRR基序中的保守半胱氨酸用單個(gè)方框表示。LRR域的N端和C端的保守半胱氨酸用方框表示?？缒?TM)區(qū)(殘基610～632)用虛下劃線表示。TIR域(殘基665～810)用方框表示，其中三個(gè)保守的基序用灰色底色表示。兩個(gè)多聚腺苷酸化信號(ATTAAA)用下劃波浪線表示。LRR通過Matsushima等描述的方法預(yù)測[25]，TM域和TIR域由SMART程序預(yù)測。Exons are shown in uppercase, while introns in lowercase. Dots represent omitted sequences. The predicted signal peptide (residues 1～17) is shown with a bold underline. The LRR motifs in the extracellular LRR domain (residues 34～606) are indicated by a gray base color and the conservative cysteines at the N- and C- terminal LRR motiffs indicated by a single box.The transmembrane (TM) region (residues 610～632) is shown with a dashed underline. The TIR domain (residues 665～810) is boxed, in which three conserved motifs are noted with gray underlay. Two polyadenylation signals (ATTAAA) are underlined with wavy lines. The LRRs are predicted by the method described by Matsushima et al. [25], while the TM region and TIR domain by SMART program.)

(外顯子用方框表示，內(nèi)含子用直線或折線表示，數(shù)字表示外顯子和內(nèi)含子的長度，單位為bp。登錄號：亞馬遜帆魚，ENSPFOG00000018309；新月魚，ENSXMAG00000013367；河豚，AC156431.1；牙鲆，AB576806.1。Exons are indicated with boxes and introns with straight or concave lines. Numbers indicate the lengths of exons and introns in bp. Accession numbers: Poecilia formosa, ENSPFOG00000018309; Xiphophorus maculatus, ENSXMAG00000013367; Takifugu rubripes, AC156431.1; Paralichthys olivaceus, AB576806.1.)

2.4 LPS及PGN刺激大菱鲆后SmTLR14在不同組織的表達(dá)

為了探究SmTLR14在大菱鲆機(jī)體免疫方面發(fā)揮的作用，用LPS及PGN刺激大菱鲆，用實(shí)時(shí)熒光定量PCR研究了SmTLR14在3個(gè)免疫器官(鰓、頭腎和脾臟)和1個(gè)非免疫器官(肌肉)中不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)。如圖6(a)所示，在受到LPS刺激后，鰓中SmTLR14mRNA的表達(dá)在3 h(7.7倍)、6 h(8.3倍)和2 d(7.7倍)被顯著上調(diào)。在頭腎和脾臟中，分別在6 h(3.8倍)和12 h(2.7倍)處檢測到最顯著的誘導(dǎo)作用。在肌肉中，SmTLR14在3 h(3.7倍)和6 h(3.0倍)被顯著誘導(dǎo)。大多數(shù)被檢測的器官中，LPS在后期(3～5 d)下調(diào)了SmTLR14的表達(dá)。在PGN刺激的情況下(見圖6(b))，在實(shí)驗(yàn)的早期階段(3和6 h)觀察到鰓和脾臟中SmTLR14的表達(dá)下調(diào)，在1 d檢測到脾臟中的第一個(gè)誘導(dǎo)表達(dá)峰(1.6倍)，在鰓、頭腎和肌肉中分別在2 d(1.3倍)、3 d(2.5倍)和5 d(1.9倍)檢測到最高的表達(dá)。

2.5 SmTLR14的亞細(xì)胞定位

為確定SmTLR14的定位，將pEGFP-C1-SmTLR14表達(dá)載體和pEGFP-C1空載體分別轉(zhuǎn)染到TK細(xì)胞中，結(jié)果如圖7所示，SmTLR14蛋白分布在細(xì)胞質(zhì)中。

2.6 SmTLR14過表達(dá)對下游免疫相關(guān)基因表達(dá)的影響

為了探究大菱鲆TLR14基因在免疫途徑中的功能，將pcDNA3.1-SmTLR14過表達(dá)質(zhì)粒及pcDNA3.1空質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染TK細(xì)胞。用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測SmTLR14過表達(dá)對下游免疫相關(guān)基因的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)SmTLR14后，其表達(dá)水平與對照組相比顯著上調(diào)了13倍(見圖8(a))。與對照組相比，炎性因子TNF-α(見圖8(b))、IL-1β(見圖8(c))和IL-8(見圖8(d))分別顯著上調(diào)了16、176和407倍?？共《疽蜃覫FN-1(見圖8(e))、IRF-1(見圖8(f))和IRF-3(見圖8(g))分別輕微上調(diào)了1.3、1.5和1.2倍，遠(yuǎn)低于炎癥因子的上調(diào)水平。

3 討論

TLR14是非哺乳動物受體，是TLR1家族的成員。本研究克隆了大菱鲆TLR14基因：SmTLR14cDNA(GenBank登錄號：MH396410)長3 364 bp，ORF全長2 634 bp，編碼877個(gè)氨基酸。SmTLR14蛋白結(jié)構(gòu)包括胞外LRR域、TM域和細(xì)胞內(nèi)TIR域。LRR可以形成馬蹄狀，在識別PAMPs時(shí)起關(guān)鍵作用[28]。不同TLRs胞外區(qū)LRRs數(shù)量不同，識別的PAMP也不同。SmTLR14胞外含有23個(gè)LRR，通過α螺旋和β折疊形成馬蹄形，負(fù)責(zé)識別PAMPs。LRR和LRR-TYP基序的高度保守片段(Highly conserved sequence，HCS)分別是“LxxLxLxxNxL”和“LxxLxLxxNxLxxLxxxxF/LxxLxx”[25]。與其他TLR1家族成員相同，SmTLR14還顯示LRR結(jié)構(gòu)域的中心部分具有更不規(guī)則的LRR，其HCS 9位上的天冬酰胺被疏水殘基替代(見圖3)[25]。保守的天冬酰胺對于維持胞外域的整體形狀很重要，因此缺乏天冬酰胺可能會導(dǎo)致LRR域中間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變[29]。先前對TLR1-TLR2-脂肽復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)的研究表明，LRR結(jié)構(gòu)域的中間結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變形成疏水口袋，這是TLR1-TLR2異二聚體的主要配體結(jié)合區(qū)[30-31]。因此，SmTLR14 LRR域的中間部分可能在該功能中起關(guān)鍵作用。另外，位于N端和C端的LRRNT和LRRCT也含有保守的半胱氨酸基序，分別為Cx10C和CxCx25Cx20C(見圖1和3)[25]。胞內(nèi)TIR結(jié)構(gòu)域?qū)τ谛盘杺鲗?dǎo)至關(guān)重要，SmTLR14含有3個(gè)保守的基序，分別標(biāo)記為box 1(YxxFxSY)、box 2(LC-RD-PG)和box 3(FWxxL)。box 1、box 2涉及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，而box 3與受體的定位有關(guān)[32]。系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示SmTLR14和牙鲆TLR14進(jìn)化關(guān)系最近。在哺乳動物中，TLR2可以與TLR1、TLR6、TLR10形成異源二聚體以識別病原體[33]。但是，在魚類中未發(fā)現(xiàn)TLR6和TLR10基因[8]，因此TLR14可能與TLR2結(jié)合，發(fā)揮哺乳動物TLR6和TLR10的類似功能。但是，要全面了解TLR14的功能，還需要進(jìn)一步研究。

(信號肽、LRRNT、21個(gè)LRR基序、LRRCT、TM域和TIR域用上劃線標(biāo)出。box結(jié)構(gòu)用框標(biāo)出。整個(gè)序列中完全保守的(100%)氨基酸殘基用星號()表示，半保守的殘基用雙點(diǎn)(：)和點(diǎn)(.)表示。序列的登錄號見表2。The signal peptide, LRRNT, 21 LRR motifs, LRRCT, TM region and TIR domain are shown by overbars. Box structure is marked with a box. Completely conserved (100%) amino acid residues throughout sequences are depicted by asterisks (), and semi-conserved residues are denoted by semicolons (:) and dots (.). The accession numbers of the sequences are shown inTable 2.)

(SmTLR14用黑色三角形表示。序列登錄號見表2。The SmTLR14 is highlighted with black triangle. The accession numbers of the sequences are shown inTable 2.)

(RPSD基因作為內(nèi)參基因。值是平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差(n=3)。不同小寫字母標(biāo)記表示差異顯著(P<0.05)。RPSD gene as an internal reference gene. Values are means±S.E. (n=3). Values marked by different lowercase letters are significantly different from each other (P<0.05).)

表2 本研究中所用到的蛋白登錄號

(每個(gè)時(shí)間點(diǎn)表示為三個(gè)重復(fù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差，n=3。與對照組相比，顯著增加用(P<0.05)和(P<0.01)表示，顯著減少用#(P<0.05)表示。Each time point is expressed as the mean of three replicates± standard error, n=3. The significant increase in expression level compared to the control is expressed by (P<0.05) or (P<0.01)while the significant decrease in expression level compared to the control is expressed by #(P<0.05).)

(pEGFP-C1是空載體陰性對照，pEGFP-C1-SmTLR14是目的基因融合蛋白。DAPI是染色細(xì)胞核(藍(lán)色熒光)，EGFP是標(biāo)記蛋白(綠色熒光)，Merge是二色合并。pEGFP-C1 is an empty vector negative control， pEGFP-C1-SmTLR14 is the target gene fusion protein， DAPI stains the nucleus (blue fluorescence)， EGFP labeled protein (green fluorescence)， Merge stands for two-color merge.)

(pcDNA3.1表示空載體組，pcDNA3.1-SmTLR14表示過表達(dá)組。(a) SmTLR14；(b) TNF-α；(c) IL-1β；(d) IL-8；(e) IFN-1；(f) IRF-1；(g) IRF-3。ACTB作為內(nèi)參基因，空載體組(對照組)的表達(dá)水平設(shè)為1。每個(gè)基因的值表示為3個(gè)重復(fù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差，n=3。(p<0.01)表示實(shí)驗(yàn)組與對照組的差異顯著。 pcDNA3.1 represents the empty vector group. pcDNA3.1-SmTLR14 represents the overexpression group. (a) SmTLR14; (b) TNF-α; (c) IL-1β; (d) IL-8; (e) IFN-1; (f) IRF-1; (g) IRF-3. ACTB is used as an internal reference gene, the expression level of the empty vector group (control group) is set to 1. The value of each gene is expressed as the mean of three replicates ± standard error, n=3. (P<0.01)was used to indicate significant differences between the experimental group and the control group.)

SmTLR14的組織分布呈現(xiàn)泛在性表達(dá)的特點(diǎn)，在脾臟中的表達(dá)量最高，因?yàn)槠⑴K是富含淋巴樣細(xì)胞的主要免疫組織之一，所以SmTLR14可能在脾臟中發(fā)揮特定功能。細(xì)菌是魚類疾病的病原體之一，TLR在抗菌宿主防御中起重要作用[34]。在本研究中，使用LPS和PGN刺激大菱鲆模仿革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌的感染。在LPS刺激3和6 h后，大菱鲆鰓中SmTLR14出現(xiàn)顯著上調(diào)。在斜帶石斑魚TLR14的研究中發(fā)現(xiàn)，在受到白點(diǎn)蟲(Ichthyophthiriusmultifiliis)感染1 d后，斜帶石斑魚鰓中TLR14mRNA的表達(dá)也出現(xiàn)了顯著增加(約10倍)[12]。鰓是硬骨魚的主要黏膜組織，TLR14在鰓中的快速高表達(dá)，表明其在LPS和寄生蟲感染的免疫反應(yīng)中起著重要的作用。從時(shí)間上看，在LPS刺激之后的早期，SmTLR14會出現(xiàn)顯著上調(diào)，到了后期則不變或受到抑制。TLR14受到抑制的原因有很多。研究表明，在受到鰻弧菌感染的鮸魚體內(nèi)， miRNA-122可以下調(diào)TLR14mRNA的表達(dá)[13]。在PGN刺激后，在早期SmTLR14并沒有出現(xiàn)顯著上調(diào)，而是保持不變或受到抑制。先前的研究還顯示，在牙鲆中，與其他病原體感染相比，TLR14在針對革蘭氏陰性細(xì)菌感染的免疫反應(yīng)中參與得更多[11]，這與本文結(jié)果一致。由此可以得出，SmTLR14可能識別LPS，并且在革蘭氏陰性菌感染的免疫反應(yīng)中發(fā)揮著重要的功能。

本研究發(fā)現(xiàn)，SmTLR14定位在細(xì)胞質(zhì)中。在硬骨魚中，TLR14和TLR25都是TLR1亞家族的成員。研究發(fā)現(xiàn)尼羅羅非魚(Oreochromisniloticus)中的TLR25也位于細(xì)胞質(zhì)中[35]。研究表明，TLR的亞細(xì)胞定位會在刺激后發(fā)生變化，例如TLR5在人的腸細(xì)胞系 HT-29中定位在細(xì)胞質(zhì)，但在大腸桿菌(Escherichiacoli)感染后，TLR5則定位在細(xì)胞表面，這說明在大腸桿菌的刺激下，TLR5的定位會發(fā)生變化[36]。據(jù)報(bào)道，魚類的TLR14可以識別細(xì)菌的成分，介導(dǎo)魚類機(jī)體的免疫反應(yīng)[11,13,15]。在細(xì)菌感染下，SmTLR14的定位會不會發(fā)生改變需要進(jìn)一步探究。

TNF-α、IL-1β、IL-8和TNF-α是在炎癥反應(yīng)過程中最早出現(xiàn)發(fā)揮作用的炎性因子，它們能激活免疫細(xì)胞使其發(fā)揮功能，增加血管內(nèi)皮細(xì)胞的通透性，并調(diào)節(jié)其他組織的生化過程，從而促進(jìn)活性因子的產(chǎn)生和釋放。在IL-1家族中，最關(guān)鍵的前體因子是IL-1β，而IL-1有強(qiáng)大的促炎作用[37]。IL-8在消除中性粒細(xì)胞中存活的細(xì)菌上發(fā)揮著重要的作用[38]。IFN-1、IRF-1和IRF-3是抗病毒因子。IFN-1是干擾素家族中第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的，它具有廣泛的功能，例如抗病毒活性、調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的成熟和分化以及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[39]。IRF的主要功能是在機(jī)體受到病毒侵襲時(shí)刺激干擾素的產(chǎn)生[40]。IRF-3可以誘導(dǎo)IFN-1，IRF-1可以與IRF-3、IRF-7細(xì)胞因子相互作用來參與抗病毒反應(yīng)[39，41]。在LPS刺激后，TK細(xì)胞中SmTLR14的過表達(dá)顯著上調(diào)TNF-α、IL-1β和IL-8，但對IFN-1、IRF-1和IRF-3的誘導(dǎo)不明顯，表明大菱鲆TLR14可能通過識別細(xì)菌組分，從而激活相關(guān)的免疫通路來誘導(dǎo)炎癥相關(guān)因子的表達(dá)，介導(dǎo)機(jī)體的抗細(xì)菌天然反應(yīng)，但具體機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。

4 結(jié)語

本研究克隆了大菱鲆TLR14基因的全長序列。組織表達(dá)分析表明，SmTLR14在組織中呈現(xiàn)泛在性表達(dá)，并在脂多糖感染后出現(xiàn)顯著誘導(dǎo)；亞細(xì)胞定位表明，SmTLR14定位大菱鲆腎細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)；過表達(dá)實(shí)驗(yàn)表明，SmTLR14在抗菌免疫中起著重要作用。