王敏，高湘玲

作者單位：濮陽(yáng)市人民醫(yī)院產(chǎn)科，河南 濮陽(yáng) 457000

卵巢癌是女性常見(jiàn)的生殖系統(tǒng)惡性腫瘤之一，發(fā)病率僅次于宮頸癌、位居第二位［1］。卵巢癌早期癥狀不典型、也缺乏特異性的檢測(cè)標(biāo)志物，因此早期診斷率較低，多數(shù)卵巢癌病人確診時(shí)已經(jīng)發(fā)展至晚期并錯(cuò)過(guò)了根治性手術(shù)治療的機(jī)會(huì)，整體預(yù)后較差、5 年生存率較低［2］。目前，卵巢癌的發(fā)病機(jī)制尚不十分清楚，這直接影響了診斷標(biāo)志物、靶向治療藥物的發(fā)現(xiàn)。

微小RNA（miR）是近些年卵巢癌發(fā)病機(jī)制研究的熱點(diǎn)，多種miRs在卵巢癌病人外周血及卵巢癌組織中異常表達(dá)，異常表達(dá)的miRs能夠靶向調(diào)節(jié)癌基因的表達(dá)并參與腫瘤的發(fā)生及發(fā)展［3-5］。微小RNA-92a（miR-92a）是一種具有明確促癌作用的miR，卵巢癌相關(guān)的研究表明，miR-92a在卵巢癌病人血漿外泌體及卵巢癌組織中均存在表達(dá)上調(diào)［6-7］，提示miR-92a可能在卵巢癌的發(fā)生發(fā)展中起到促進(jìn)作用，但目前仍缺乏miR-92a 調(diào)控卵巢癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的直 接 證 據(jù)。Liu 等［8］關(guān) 于miR-92a 的 研 究 表 明，Kru?ppel樣因子2（KLF2）是其靶基因；Wang等［9］的研究則發(fā)現(xiàn)抑制KLF2 的表達(dá)能夠促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的侵襲?；诖颂岢黾僬f(shuō)，miR-92a可能靶向抑制卵巢癌細(xì)胞中KLF2的表達(dá)，進(jìn)而起到促進(jìn)癌細(xì)胞侵襲的作用。為了驗(yàn)證這一假說(shuō)，本研究以卵巢癌細(xì)胞系為對(duì)象進(jìn)行了一系列細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，旨在闡明miR-92a靶向KLF2基因促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞侵襲的作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞2019 年1 月至2020 年3 月進(jìn)行本研究。A2780、SKOV3、OVCAR-3卵巢癌細(xì)胞株以及HOSEp?iC卵巢上皮細(xì)胞株購(gòu)自中科院上海細(xì)胞資源中心。

1.2 試劑miR-92a（序列5’-UAUUGCACUUGU?CCCGGCCUGU-3’）、miR-92a抑制物（序列5’-ACAG?GCCGGGACAAGUGCAAUA-3’）、陰性對(duì)照（NC）（序列5’UAGCUGAUCGCUAGGUAGCUC-3’）均購(gòu)自上海吉瑪公司，空白pcDNA 質(zhì)粒、過(guò)表達(dá)KLF2的pcD?NA 重組質(zhì)粒購(gòu)自上海生工公司，轉(zhuǎn)染試劑Lipo?fectamine3000、結(jié)晶紫均購(gòu)自Thermo 公司，miR 提取、反轉(zhuǎn)錄及熒光定量檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京天根生化公司，細(xì)胞裂解液、蛋白定量檢測(cè)試劑盒、ECL 顯影試劑盒均購(gòu)自上海碧云天公司，KLF2特異性一抗購(gòu)自Abcam 公司，雙熒光素酶報(bào)告基因由上海生工公司合成，雙熒光素酶檢測(cè)系統(tǒng)購(gòu)自Promega公司。

1.3 儀器細(xì)胞培養(yǎng)箱、離心機(jī)均為T(mén)hermo 公司，熒光定量PCR 儀為ABI 公司，電泳系統(tǒng)及凝膠成像系統(tǒng)為上海天能公司。

1.4 方法

1.4.1細(xì)胞培養(yǎng) 卵巢癌及卵巢上皮細(xì)胞株在含有10%胎牛血清的培養(yǎng)基中進(jìn)行貼壁培養(yǎng)，隔天更換培養(yǎng)基、常規(guī)用0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，離心收集細(xì)胞、重懸后按1∶3比例傳代繼續(xù)培養(yǎng)。

1.4.2細(xì)胞分組及轉(zhuǎn)染 SKOV3 細(xì)胞接種在培養(yǎng)板中，分組后用轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作。NC組轉(zhuǎn)染NC 序 列，miR-92a 抑 制 物 組 轉(zhuǎn) 染miR-92a 抑 制 物，miR-92a 組轉(zhuǎn)染miR-92a，pcDNA 組轉(zhuǎn)染空白pcDNA質(zhì)粒，pcDNA+miR-92a組共轉(zhuǎn)染pcDNA 質(zhì)粒及miR-92a，pcDNA-KLF2+miR-92a 組共轉(zhuǎn)染過(guò)表達(dá)KLF2的pcDNA重組質(zhì)粒及miR-92a。

1.4.3miR-92a 表達(dá)的熒光定量PCR 檢測(cè) 取A2780、SKOV3、OVCAR-3、HOSEpiC 細(xì)胞或NC 組、miR-92a抑制物組、miR-92組SKOV3細(xì)胞，用miR提取試劑盒提取細(xì)胞中的miR，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將miR 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA 第一鏈，用熒光定量檢測(cè)試劑盒對(duì)cDNA 進(jìn)行熒光定量PCR 擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)體系按照說(shuō)明書(shū)配置，反應(yīng)程序按照說(shuō)明書(shū)設(shè)置：95 ℃、3 min 后95 ℃、15 s，60 ℃、34 s 循環(huán)40 次。分別對(duì)目的基因miR-92a 和內(nèi)參基因U6 進(jìn)行擴(kuò)增，得到擴(kuò)增的循環(huán)曲線及循環(huán)閾值（Ct），以U6 為內(nèi)參、按照公式2-ΔΔCt計(jì)算miR-92a的表達(dá)水平。

1.4.4細(xì)胞侵襲的Transwell檢測(cè) 取分組轉(zhuǎn)染后的SKOV3 細(xì)胞，在Transwell 的上層小室內(nèi)預(yù)先加入基質(zhì)膠，而后將密度為2×105個(gè)/毫升的細(xì)胞懸液100μL接種在上層小室內(nèi)，同時(shí)在下層小室內(nèi)加入有10%胎牛血清的培養(yǎng)基0.5 mL、用于趨化上層小室內(nèi)的細(xì)胞發(fā)生侵襲。48 h后取出小室，擦去上層小室內(nèi)未發(fā)生侵襲的細(xì)胞，用4%多聚甲醛固定30 min后用結(jié)晶紫室溫染色15 min，最后在顯微鏡下隨機(jī)觀察3個(gè)高倍視野，對(duì)視野內(nèi)的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)、即侵襲細(xì)胞數(shù)目。

1.4.5KLF2表達(dá)的蛋白質(zhì)印跡法（Western blotting）檢測(cè) 取NC 組、miR-92a 抑制物組、miR-92 組、pcD?NA組、pcDNA+miR-92a組、pcDNA-KLF2+miR-92a組SKOV3細(xì)胞，加入裂解液、裂解細(xì)胞、提取蛋白，檢測(cè)蛋白含量后將30μg蛋白用于Western blotting 檢測(cè)，蛋白在聚丙烯酰胺凝膠中電泳、而后電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，將PDVD膜放入5%脫脂牛奶、室溫孵育1 h，而后將PVDF膜放入1∶1 000稀釋的KLF2一抗或1∶5 000稀釋的β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）一抗中，4 ℃孵育過(guò)夜。次日，將PVDF膜放入1∶2 000稀釋的二抗中，室溫孵育1 h，最后采用ECL顯影試劑盒在凝膠成像系統(tǒng)中顯影得到KLF2、β-actin的蛋白條帶，以β-actin條帶灰度值為內(nèi)參、計(jì)算KLF2的蛋白表達(dá)水平。

1.4.6雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn) 構(gòu)建野生型和突變型神經(jīng)鈣黏素（N-cadherin）雙熒光素酶報(bào)告基因，將報(bào)告基因轉(zhuǎn)染進(jìn)入SKOV3 細(xì)胞后分為NC 組和miR-92a 組，分別轉(zhuǎn)染NC 序列和miR-92a 序列。持續(xù)轉(zhuǎn)染48 h 后收集細(xì)胞，采用雙熒光素酶檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)細(xì)胞中螢火蟲(chóng)及海腎的熒光值進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算螢火蟲(chóng)與海腎熒光值的比值，以該比值作為雙熒光素酶報(bào)告基因的熒光活力。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 21.0 軟件錄入數(shù)據(jù)，多組間計(jì)量資料的比較采用方差分析、兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，兩組間計(jì)量資料的比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 卵巢癌細(xì)胞株中miR-92a 表達(dá)的變化與卵巢上皮細(xì)胞株HOSEpiC的0.62±0.09比較，卵巢癌細(xì)胞株A2780、SKOV3、OVCAR-3 中miR-92a 的表達(dá)水平均（0.92±0.15、1.62±0.19、1.21±0.13）明顯增加（F=43.47，P<0.001），且SKOV3 細(xì)胞中miR-92a 的表達(dá)水平高于A2780 及OVCAR-3 細(xì)胞（P<0.05），因此選擇SKOV3細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 miR-92a 調(diào)控SKOV3 細(xì)胞侵襲熒光定量PCR 檢測(cè)顯示，與NC 組比較，miR-92a 抑制物組SKOV3 細(xì)胞中miR-92a 的表達(dá)水平明顯降低、miR-92a 組SKOV3 細(xì)胞中miR-92a 的表達(dá)水平明顯增加（P<0.05）；Transwell 檢測(cè)顯示，與NC 組比較，miR-92a 抑制物組SKOV3 細(xì)胞的侵襲數(shù)目明顯減少、miR-92a 組SKOV3 細(xì)胞的侵襲數(shù)目明顯增加（P<0.05）。見(jiàn)表1，圖1。

表1 微小RNA-92a（miR-92a）對(duì)SKOV3細(xì)胞侵襲的影響/x±s

2.3 miR-92a靶向調(diào)控KLF2表達(dá)Targetscan網(wǎng)站生物信息學(xué)分析顯示，KLF2基因mRNA 3’UTR中含有miR-92a的結(jié)合位點(diǎn)；Western blotting檢測(cè)顯示，與NC組0.42±0.08比較，miR-92a抑制物組SKOV3細(xì)胞中KLF2的表達(dá)水平0.78±0.20明顯增加、miR-92a組SKOV3細(xì)胞中KLF2的表達(dá)水平0.29±0.06明顯降低（F=76.57，P<0.001），見(jiàn)圖2。

圖2 KLF2的蛋白條帶

經(jīng)雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)，miR-92a組SKOV3細(xì)胞中野生型KLF2 報(bào)告基因的熒光活力0.39±0.09低于NC組0.75±0.20（t=3.67，P=0.006），突變型KLF2報(bào)告基因的熒光活力與NC組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.30，P=0.773）。

2.4 miR-92a 通過(guò)KLF2 促進(jìn)SKOV3 細(xì)胞侵襲Western blotting 檢測(cè)顯示，與pcDNA 組比較，pcD?NA+miR-92a 組SKOV3 細(xì)胞中KLF2 的表達(dá)水平明顯降低（P<0.05），與pcDNA+miR-92a 組比較，pcD?NA-KLF2+miR-92a組SKOV3細(xì)胞中KLF2的表達(dá)水平明顯增加（P<0.05），見(jiàn)圖3；Transwell 檢測(cè)顯示，與pcDNA 組 比 較，pcDNA+miR-92a 組SKOV3 細(xì) 胞的侵襲數(shù)目明顯增加（P<0.05），與pcDNA+miR-92a組比較，pcDNA-KLF2+miR-92a 組SKOV3 細(xì)胞的侵襲數(shù)目明顯減少（P<0.05），見(jiàn)圖1，表2。

圖1 卵巢癌細(xì)胞系接種培養(yǎng)后Transwell檢測(cè)侵襲細(xì)胞的染色圖（結(jié)晶紫染色×200）

圖3 KLF2的蛋白條帶

表2 過(guò)表達(dá)KLF2對(duì)miR-92a促進(jìn)SKOV3侵襲的影響/x ± s

3 討論

miR-92a 具有促癌作用，多項(xiàng)惡性腫瘤相關(guān)的研究發(fā)現(xiàn)，卵巢癌［6-7］、肝癌［10］、結(jié)直腸癌［11］、膀胱癌［12］、乳腺癌［13］等惡性腫瘤病灶中或病人外周血中miR-19a的表達(dá)明顯增加，高表達(dá)的miR-19a對(duì)食管癌［14］、結(jié)直腸癌［15］、宮頸癌［16］細(xì)胞的遷移、侵襲等惡性生物學(xué)行為具有調(diào)控作用。

本研究首先通過(guò)細(xì)胞株中miR-92a 表達(dá)的檢測(cè)證實(shí)三種卵巢癌細(xì)胞株中miR-92a 的表達(dá)水平高于正常卵巢上皮細(xì)胞株，與既往臨床研究報(bào)道的卵巢癌中miR-92a 表達(dá)增加的結(jié)果吻合。在三種卵巢癌細(xì)胞株中，SKOV3 細(xì)胞中miR-92a 表達(dá)增加的趨勢(shì)最顯著。

癌細(xì)胞過(guò)度侵襲會(huì)造成卵巢癌病灶的局部浸潤(rùn)、腹腔播散及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，因此越來(lái)越多的基礎(chǔ)研究開(kāi)始關(guān)注卵巢癌細(xì)胞侵襲的調(diào)控機(jī)制。本研究在SKOV3卵巢癌細(xì)胞系中通過(guò)轉(zhuǎn)染miR-92a抑制物或miR-92a的方式來(lái)抑制或增加miR-92a 的表達(dá)，在抑制miR-92a的表達(dá)后、SKOV3細(xì)胞的侵襲數(shù)目明顯減少，而在增加miR-92a 的表達(dá)后、SKOV3 細(xì)胞的侵襲數(shù)目明顯增加，通過(guò)抑制及增加miR-92a 表達(dá)調(diào)控SKOV3細(xì)胞侵襲的實(shí)驗(yàn)表明，miR-92a 對(duì)SKOV3 細(xì)胞的侵襲具有促進(jìn)作用，與既往關(guān)于miR-92a 促進(jìn)食管癌［14］、結(jié)直腸癌［15］、宮頸癌［16］細(xì)胞侵襲的報(bào)道一致。

本研究還探究了介導(dǎo)miR-92a 這一作用的分子機(jī)制。miRs 發(fā)揮生物學(xué)作用的方式是與靶基因mRNA 3’UTR 結(jié)合并抑制靶基因的表達(dá)，Liu 等［8］在內(nèi)皮細(xì)胞中研究了miR-92a 的靶基因并發(fā)現(xiàn)miR-92a 能夠靶向抑制KLF2 基因的表達(dá)。本研究在SKOV3 細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)抑制miR-92a 的表達(dá)后、細(xì)胞中KLF2 的表達(dá)增加，增加miR-92a 的表達(dá)后、細(xì)胞中KLF2的表達(dá)減少；進(jìn)一步經(jīng)雙熒光素酶報(bào)告基因驗(yàn)證，過(guò)表達(dá)miR-92a 能夠使野生型KLF2 雙熒光素酶報(bào)告基因的熒光活力降低，根據(jù)Targetscan 生物信息學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果將KLF2 基因mRNA 3’UTR 中miR-92a 靶向結(jié)合的堿基突變后、miR-92a 不影響突變型KLF2 雙熒光素酶報(bào)告基因的熒光活力。以上結(jié)果表明miR-92a 能夠靶向抑制SKOV3 細(xì)胞中KLF2 基因的表達(dá)，且miR-92a靶向結(jié)合KLF2基因mRNA 3’UTR的位點(diǎn)與Targetscan生物信息學(xué)預(yù)測(cè)一致。

多項(xiàng)研究表明KLF2 能夠抑制肝癌、前列腺癌、肺癌細(xì)胞的侵襲，受到KLF2調(diào)控的分子和通路包括MMP2、Hedgehog 通路、TGF-β1 通路等［17-20］，KLF2 可能通過(guò)抑制相關(guān)通路發(fā)揮抑制癌細(xì)胞侵襲的作用。在SKOV3細(xì)胞中，miR-92a能夠促進(jìn)細(xì)胞侵襲、靶向抑制KLF2 表達(dá)，由此推測(cè)miR-92a 可能通過(guò)抑制KLF2 的表達(dá)、削弱KLF2 的抑癌作用來(lái)達(dá)到促進(jìn)細(xì)胞侵襲的效應(yīng)。為了驗(yàn)證這一推測(cè)，本研究設(shè)計(jì)了過(guò)表達(dá)KLF2的重組質(zhì)粒，在轉(zhuǎn)染miR-92a抑制KLF2表達(dá)、促進(jìn)細(xì)胞侵襲的同時(shí)也轉(zhuǎn)染了過(guò)表達(dá)KLF2的重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒后miR-92a抑制KLF2表達(dá)、促進(jìn)細(xì)胞侵襲的作用均發(fā)生了逆轉(zhuǎn)，表明靶向抑制KLF2表達(dá)是miR-92a促進(jìn)細(xì)胞侵襲的機(jī)制之一。

綜上所述，多種卵巢癌細(xì)胞中miR-92a表達(dá)增加能夠促進(jìn)SKOV3細(xì)胞侵襲并靶向抑制KLF2基因的表達(dá)，是促進(jìn)細(xì)胞侵襲的機(jī)制之一。未來(lái)miR-92a可能成為研究卵巢癌發(fā)病機(jī)制及靶向治療手段的分子靶點(diǎn)。