趙娜，殷莉，秦曉楠

作者單位：河南省直第三人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科，河南 鄭州 450000

慢性阻塞性肺疾?。╟hronic obstructive pulmo?nary disease，COPD）病因是氣流受限不完全可逆并逐漸發(fā)展，與肺部對外界有害環(huán)境的異常炎癥反應(yīng)有關(guān)，其嚴重時會引起全身（或肺外）的不良效應(yīng)［1］。由炎性細胞浸潤表層上皮、黏液分泌腺增大和杯狀細胞增多而導(dǎo)致的氣管黏液高分泌是COPD 重要病理生理特征之一，與COPD 的發(fā)生、發(fā)展、臨床結(jié)果密 切 相 關(guān)［2-3］。其 中，黏 蛋 白5AC（Mucin5AC，MUC5AC）是氣管中最主要的分泌型黏蛋白，其表達水平代表著氣管黏液分泌的強度。此外，有報道顯示，細胞因子白細胞介素-13（IL-13）及其介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子6（STAT6）信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與哮喘病人氣管的黏液高分泌密切相關(guān)，可以顯著誘導(dǎo)氣管上皮杯狀細胞的化生和MUC5AC 的表達［4］。甘草具有補脾益氣、潤肺止咳、緩急止痛的功效，而甘草酸二銨是中藥甘草中的有效成分，具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤及免疫調(diào)節(jié)的作用。研究顯示，服用甘草酸二銨的COPD 病人肺功能明顯加強，肺部炎性水平明顯降低［5］。但其作用機制研究較少，因此，2019年6月至2020年2月，本研究主要通過觀察甘草酸二銨對香煙煙熏聯(lián)合脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的COPD 大鼠模型氣管黏液高分泌的影響以及可能作用機制，以期為臨床用藥提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料健康雄性SD大鼠100只，清潔級，8周齡體質(zhì)量為（240±20）g，由珠海百試通生物科技有限公司提供，許可證號：SCXK（粵）2020-0051。本研究符合一般動物實驗倫理學(xué)原則。所有動物均嚴格按照動物飼養(yǎng)規(guī)則喂養(yǎng)，溫度為25 ℃，濕度為60%，實驗室適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后用于實驗研究。甘草酸二銨注射液（20190520），來自江蘇神龍藥業(yè)有限公司；注射用鹽酸氨溴索（20190312），由山東羅欣藥業(yè)集團股份有限公司生產(chǎn)。大鼠IL-13 ELISA 試劑盒來自上海江萊生物；實時定量熒光PCR（qRT-PCR）擴增引物由金唯智公司合成；TRIzol 試劑（貨號為15596026）來自Invitrogen 公司；逆轉(zhuǎn)錄（貨號為R123-01）及qRT-PCR 試劑盒（貨號為Q121-02）來自南京諾唯贊公司；Western blotting 所用抗體均來自abcam 公司，一抗為兔抗IL-13 抗體（ab52538）、兔抗磷酸化的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子6（p-STAT6）抗體（ab44718）、兔抗STAT6 抗體（ab217998）和兔抗MUC5AC 抗體（ab3649），二抗為辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）（ab205718）。

1.2 方法

1.2.1動物分組及建模 按隨機數(shù)字表法將大鼠分為正常組，模型組，甘草酸二銨低、中、高劑量組和鹽酸氨溴索組，每組15 只。COPD 大鼠模型制作參考王駿等［6］。除正常組外，其余各組在實驗開始后的第1 天和第14 天將大鼠麻醉后氣管內(nèi)滴入200μg LPS；第2～13 天和第15～28 天在特制的1 m3的特制煙室中，給予大鼠每日2 次香煙煙熏（每次10 根，每次30 min）。第29～42 天，對各組大鼠進行相應(yīng)的藥物處理，均行大鼠尾部靜脈注射。根據(jù)等效劑量折算表，大鼠對于甘草酸二銨注射液的等效劑量為15 mg/kg，因此，設(shè)置低、中、高劑量分別為7.5 mg/kg、15 mg/kg 和30 mg/kg。鹽酸氨溴索組每日注射6.5 mg/kg。正常組和模型組大鼠注射等量無菌生理鹽水。每天1次，持續(xù)14 d。

1.2.2酚紅排痰實驗 參考文獻［7］研究，每組取5只大鼠，先將酚紅用生理鹽水配成不同濃度的溶液，分別測量其在558 nm 處的吸光度值，以此制作標準曲線，然后大鼠腹腔注射7.05 mmol/L 酚紅溶液0.5 mL，30 min后處死分離氣管，用1 mol/L氫氧化鈉溶液反復(fù)沖洗，合并沖洗液注入比色管中，測量其在558 nm 處的吸光度值，根據(jù)酚紅的標準曲線計算出痰液排泄量。

1.2.3大鼠肺功能檢測 各組剩余10 只大鼠戊巴比妥鈉注射麻醉后分離暴露氣管，進行氣管插管并固定，用小動物肺功能檢測儀測定肺阻力（RI）和動態(tài)肺順應(yīng)性（Cdyn）。

1.2.4肺泡灌洗液中IL-13 的含量測定“1.2.3”中各組10 只大鼠檢測肺功能后，行右支氣管插管，用1 mL PBS反復(fù)抽吸3遍，回收肺泡灌洗液，回收率在80%以上，4 ℃、3 000 r/min 條件下離心10 min，取上清液置于-20 ℃冰箱保留備檢；依照ELISA 試劑盒說明書步驟檢測肺泡灌洗液中IL-13 的含量，酶標儀450 nm 檢測待測樣本，然后將樣本的吸光度值代入回歸方程，得到濃度值。

1.2.5大鼠肺組織病理學(xué)觀察 各組10 只大鼠灌洗結(jié)束后，開胸，留取肺組織。肺組織固定于4%多聚甲醛中，常規(guī)操作制備石蠟切片并進行HE 染色，觀察其病理學(xué)改變。

1.2.6實時熒光定量PCR 檢測IL-13、STAT6 和MUC5AC mRNA表達量水平 取“1.2.5”所取左肺組織一小塊，液氮速凍后采用TRIzol 等試劑提取肺組織總RNA，5 00 ng 定量逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，然后用SYBR Green Ⅰ熒光染料技術(shù)進行qRT-PCR 擴增。所用引物如表1 所示，反應(yīng)條件為預(yù)變性95 ℃、5 min；循環(huán)反應(yīng)95 ℃、10 s，60 ℃、30 s，主循環(huán)40 個；融解曲線，95 ℃、15 s，60 ℃、60 s，95 ℃、15 s。采用2-ΔΔCt法，通過Ct值計算目的基因相對表達水平。

表1 實時定量熒光PCR引物序列

1.2.7肺 組 織IL-13、p-STAT6、MUC5AC 蛋 白 檢測 取“1.2.5”中所保存各組肺組織，剪碎，置于玻璃勻漿器中；加入含有PMSF 的裂解液，冰上反復(fù)勻漿。30 min 后，4 ℃下12 000 r/min 離心5 min，收集上清液，參照BCA 試劑盒測定蛋白總濃度。配制10%分離膠、4%濃縮膠。取50 μg 蛋白上樣，沸水浴處理5 min 使蛋白變性，冷卻后可以上樣。初始電壓為80 V，待樣品進入分離膠后，換成120 V。電泳結(jié)束后，將目的條帶凝膠切除，轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，冰上進行轉(zhuǎn)膜反應(yīng)，電壓為60 V，反應(yīng)時間2 h。結(jié)束后用TBS 清洗，用封閉液室溫下?lián)u床搖動封 閉1 h，TBS 清 洗 后，加 入 兔 抗IL-13、兔 抗p-STAT6、兔抗STAT6 以及兔抗MUC5AC 單克隆抗體（稀釋倍數(shù)1∶200），4 ℃過夜。TBS 后加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG 二抗（稀釋倍數(shù)1∶1 000），室溫下孵育2 h，TBS 清洗、ECL 顯色后置于BioRad成像系統(tǒng)中分析電泳條帶。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 20.0 統(tǒng)計軟件分析處理數(shù)據(jù)，計量資料均以xˉ±s描述，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用SNK-q檢驗，P<0.05代表差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 甘草酸二銨對各組大鼠酚紅排泌量和肺泡灌洗液中IL-13水平的影響與正常組相比，模型組氣管排泌量和肺泡灌洗液中IL-13水平顯著升高（P<0.05）；與模型組相比，甘草酸二銨各劑量組和鹽酸氨溴索組大鼠氣管排泌量和肺泡灌洗液中IL-13水平均顯著降低（P<0.05）；其中甘草酸二銨高劑量組與鹽酸氨溴索組氣管排泌量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），肺泡灌洗液中IL-13水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見表2。

表2 甘草酸二銨對各組大鼠酚紅排泌量的影響/±s

表2 甘草酸二銨對各組大鼠酚紅排泌量的影響/±s

注：IL-13為白細胞介素-13。①與正常組相比，P<0.05。②與模型組相比，P<0.05。③與甘草酸二銨低劑量組相比，P<0.05。④與甘草酸二銨中劑量組相比，P<0.05。⑤與甘草酸二銨高劑量組相比，P<0.05。

?

2.2 甘草酸二銨對各組大鼠肺功能的影響與正常組相比，模型組大鼠RI 顯著增高，Cdyn 顯著降低（P<0.05）；與模型組相比，甘草酸二銨低、中、高劑量組RI 依次降低（P<0.05），Cdyn 依次增加（P<0.05），且甘草酸二銨高劑量組RI、Cdyn水平與鹽酸氨溴索組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），見表3。

表3 甘草酸二銨對各組大鼠肺功能的影響/（cmH2O·mL-1·s-1，±s）

表3 甘草酸二銨對各組大鼠肺功能的影響/（cmH2O·mL-1·s-1，±s）

注：RI為肺阻力，Cdyn為動態(tài)肺順應(yīng)性。①與正常組相比，P<0.05。②與模型組相比，P<0.05。③與甘草酸二銨低劑量組相比，P<0.05。④與甘草酸二銨中劑量組相比，P<0.05。

?

2.3 甘草酸二銨對大鼠肺組織病理學(xué)的影響正常組大鼠氣管壁可見少量炎性細胞，肺形態(tài)正常，而模型組的大鼠表現(xiàn)出明顯的支氣管上皮炎性細胞浸潤，隨后小支氣管壁增厚，支氣管周圍肺組織中的淋巴聚集體增加，支氣管腔分泌物增多。與模型組相比，甘草酸二銨低、中、高劑量組都表現(xiàn)出較少的病理變化，尤其是甘草酸二銨高劑量組的大鼠，支氣管無明顯炎性細胞浸潤和淋巴聚集，與鹽酸氨溴索組類似。見圖1。

圖1 各組肺組織病理切片（HE染色×40）：A為正常組；B為模型組；C為甘草酸二銨7.5 mg/kg組；D為甘草酸二銨15 mg/kg組；E為甘草酸二銨30 mg/kg組；F為鹽酸氨溴索組

2.4 甘草酸二銨對各組大鼠肺組織IL-13、STAT6和MUC5AC mRNA 表達量的影響與正常組相比，模型組大鼠肺組織中IL-13、STAT6 和MUC5AC mRNA 表達水平顯著增加（P<0.05）；與模型組比較，甘草酸二銨各劑量組大鼠肺組織中IL-13、STAT6和MUC5AC mRNA 表達水平均顯著減少（P<0.05），且呈劑量依賴性；與鹽酸氨溴索組相比，甘草酸二銨高劑量組在IL-13、STAT6 表達量水平明顯下降，而在MUC5AC mRNA水平無統(tǒng)計學(xué)意義，見表4。

表4 甘草酸二銨對各組大鼠肺組織IL-13、STAT6和MUC5AC mRNA表達量的影響/±s

表4 甘草酸二銨對各組大鼠肺組織IL-13、STAT6和MUC5AC mRNA表達量的影響/±s

注：IL-13為白細胞介素-13，STAT6為信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子6，MUC5AC為黏蛋白5AC，β-actin為β-肌動蛋白。①與正常組相比，P<0.05。②與模型組相比，P<0.05。③與甘草酸二銨低劑量組相比，P<0.05。④與甘草酸二銨中劑量組相比，P<0.05。⑤與甘草酸二銨高劑量組相比，P<0.05。

?

2.5 甘草酸二銨對各組大鼠肺組織IL-13/STAT6通路相關(guān)蛋白表達量的影響與正常組比較，模型組大鼠肺組織中IL-13、p-STAT6/STAT6 和MUC5AC蛋白表達水平均顯著上調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；與模型組比較，甘草酸二銨各劑量組大鼠肺組織中IL-13、pSTAT-6/ STAT6 和MUC5AC 水平均顯著下調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），且呈劑量依賴性，且甘草酸二銨高劑量組與鹽酸氨溴索組IL-13、p-STAT6/STAT6 和MUC5AC 水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見圖2，表5。

表5 甘草酸二銨對各組大鼠肺組織IL-13、p-STAT6和MUC5AC 蛋白表達量的影響/±s

表5 甘草酸二銨對各組大鼠肺組織IL-13、p-STAT6和MUC5AC 蛋白表達量的影響/±s

注：IL-13 為白細胞介素-13，p-STAT6 為磷酸化的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子6，STAT6 為信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子6，MUC5AC 為黏蛋白5AC，β-actin為β-肌動蛋白。①與正常組相比，P<0.05。②與模型組相比，P<0.05。③與甘草酸二銨低劑量組相比，P<0.05。④與甘草酸二銨中劑量組相比，P<0.05。

?

圖2 甘草酸二銨對各組大鼠肺組織IL-13/STAT6通路相關(guān)蛋白表達量的影響

3 討論

COPD 是呼吸內(nèi)科常見疾病，容易引起并發(fā)癥。最新調(diào)查顯示，COPD 死亡率在全球疾病中排名第6，在我國排名第4，嚴重威脅著人們健康［8］。氣管黏液分泌過多，一方面加重氣管阻塞，引起通氣功能障礙，加速肺功能下降；另一方面影響氣管纖毛去除功能，從而影響COPD 病人對吸入細菌和有毒顆粒的去除，引起反復(fù)感染，并進一步刺激黏液分泌［9-10］。在本研究中，通過香煙煙熏聯(lián)合LPS 建立COPD 大鼠模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)模型組大鼠相比正常組肺阻力增加，肺順應(yīng)性以及排痰能力均有下降，IL-13 在水平升高，STAT6 磷酸化水平以及MUC5AC mRNA和蛋白水平均增加，肺組織出現(xiàn)病理性損傷，說明COPD大鼠模型建立成功。

現(xiàn)代藥理學(xué)認為，甘草酸二銨具有許多生物學(xué)功能，例如抗氧化，免疫調(diào)節(jié)，抗炎，調(diào)節(jié)內(nèi)源性類固醇激素水平和保護細胞膜結(jié)構(gòu)等［11］。研究表明，甘草酸二銨可以迅速作用于肺，通過改善肺血液循環(huán)，減少氣管痙攣，增加肺泡通氣，緩解臨床癥狀［12］。另一方面，方妮等［13］發(fā)現(xiàn)COPD 穩(wěn)定期病人應(yīng)用甘草酸二銨后，較對照組血清CRP、IL-6 和TNF-α 水平明顯降低，外周血T 淋巴細胞水平明顯升高，說明甘草酸二銨可減輕炎癥反應(yīng)，增強免疫功能。甘草酸二銨對COPD 氣管黏液高分泌的作用機制還不清楚，因此，本實驗選用甘草酸二銨低、中、高三個劑量對COPD 大鼠模型進行處理，探究其對氣管黏液高分泌的影響，并分析可能存在的作用機制。甘草酸二銨各劑量組大鼠較模型組相比均表現(xiàn)出肺泡灌洗液IL-13 降低，肺組織病理損傷減輕，提示甘草酸二銨改善COPD 大鼠氣管黏液高分泌，與鹽酸氨溴索處理組效果一致。

研究表明，氣管黏液的分泌受體內(nèi)多個信號通路調(diào)節(jié)［14］。其中，IL-13介導(dǎo)的信號通路在其中具有重要的調(diào)控作用。IL-13 對氣管上皮杯狀細胞的化生、黏蛋白的轉(zhuǎn)錄、翻譯以及釋放等黏液分泌的過程中都發(fā)揮著促進作用［15］。當用含有IL-13 的培養(yǎng)液培養(yǎng)人支氣管上皮細胞時，可觀察到上皮細胞轉(zhuǎn)化為胞內(nèi)富含黏液的杯狀細胞［16］。而激活型轉(zhuǎn)錄因子STAT6 作為IL-13 信號通路的下游分子，在IL-13信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中發(fā)揮著極重要的作用［17］，當通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)使小鼠過表達IL-13 時，如果STAT6 信號通路完整，可以在大鼠體內(nèi)無氣管炎癥的情況下觀察到氣管黏液高分泌的現(xiàn)象，說明IL-13 誘導(dǎo)小鼠氣管上皮細胞黏液高分泌依賴于STAT6 信號通路［18］。MUC5AC 是構(gòu)成COPD 病人黏液的主要黏蛋白，其基因轉(zhuǎn)錄水平可受STAT6 磷酸化水平調(diào)節(jié)。同時，有報道指出，IL-13 可增強MUC5AC 啟動子活性，驅(qū)動MUC5AC 基因表達［19］。本研究中發(fā)現(xiàn)，甘草酸二銨各劑量組大鼠肺組織中IL-13、STAT6、MUC5AC mRNA 水平以及IL-13、p-STAT6/STAT6、MUC5AC蛋白表達水平都顯著低于模型組，且呈劑量依賴性，進一步表明甘草酸二銨可能通過抑制IL-13/STAT6通路激活發(fā)揮降低慢性阻塞性肺疾病大鼠氣管黏液高分泌的作用。

綜上所述，甘草酸二銨抑制IL13/STAT6 信號通路，進而抑制黏液高分泌，改善氣管阻塞，為臨床治療COPD 提供了新思路。然而未能說明甘草酸二銨與鹽酸氨溴索各自的優(yōu)缺點，還需進一步地研究。