陳倩倩，張英麗，李陽，唐音

作者單位：南陽市中心醫(yī)院腫瘤科，河南 南陽 473000

乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展與體內(nèi)基因的異常表達密切相關(guān)，針對這些基因的分子靶向治療已成為乳腺癌治療研究的熱點［1-2］。研究發(fā)現(xiàn)長鏈非編碼RNA（ln?cRNA）雖不編碼蛋白質(zhì)，但其在生物體內(nèi)起重要調(diào)節(jié)作用，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［3］。細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑2B 反義RNA1（CDKN2B-AS1）作為一種lncRNA，研究發(fā)現(xiàn)CDKN2B-AS表達水平在特發(fā)性肺纖維化病人外周血中顯著降低，且可通過調(diào)節(jié)蛋白p53信號通路預(yù)測肺癌［4］。研究報道喉鱗狀細胞癌組織中CDKN2B-AS高表達，與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和晚期臨床階段密切相關(guān)，抑制CDKN2B-AS1可抑制喉鱗狀細胞癌細胞增殖、遷移和侵襲，誘導(dǎo)細胞凋亡［5］。且發(fā)現(xiàn)CDKN2B-AS1 在乳腺癌組織中顯著過表達［6］。然而CDKN2B-AS1 對乳腺癌細胞機制研究尚未可知。研究發(fā)現(xiàn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展與miRNA的異常表達也密切關(guān)聯(lián)，為了更好地理解乳腺癌發(fā)生發(fā)展的分子機制，進一步研究miRNA 在乳腺癌中的作用功能十分重要［7］。研究報道微小RNA-339-5p（miR-339-5p）可降低小鼠體內(nèi)乳腺癌細胞的生長繁殖能力，有望成為乳腺癌治療的潛在新靶點［8］。miR-339-5p通過靶向鼠雙微體基因（MDM2）調(diào)節(jié)乳腺癌MCF-7細胞p53腫瘤抑制通路［9］。因此，本研究主要觀察研究CDKN2BAS1可能通過靶向miR-339-5p有關(guān)對乳腺癌細胞增殖、遷移、侵襲的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料收集南陽市中心醫(yī)院2017 年1 月2019 年1 月收治的37 例乳腺癌病人手術(shù)切除的保存于保存超低溫冰箱內(nèi)的癌組織及癌旁組織（癌組織邊緣2～5 cm），病人或其近親屬知情同意，本研究符合《世界醫(yī)學協(xié)會赫爾辛基宣言》相關(guān)要求。

乳腺癌細胞MDA-MB-453 由上海滬震提供；胎牛血清、RPMI-1640 培養(yǎng)基由上海聯(lián)碩生物提供；MTT試劑盒、BCA試劑盒、蛋白裂解液由碧云天生物提供；增殖標記蛋白細胞增殖核抗原-67（Ki67）、細胞周期依賴性蛋白激酶抑制因子1A（P21）、上皮型鈣黏蛋白（E-cadherin）、神經(jīng)型鈣黏蛋白（N-cadherin）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）單抗、羊抗兔免疫球蛋白（IgG）均由武漢維諾賽生物提供；熒光定量試劑盒、Trizol試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒均由美國Progema公司提供；Transwell小室、Matrigel膠均由美國BD公司提供；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒由北京Solarbio公司提供；ELISA試劑盒由上海繼錦公司提供。二氧化碳孵育箱、Thermo FC酶標儀由美國Thermo公司提供；熒光顯微鏡由日本Olympus公司提供；FACSCan?to Ⅱ流式細胞儀由美國Bio-Rad公司提供。

1.2 細胞培養(yǎng)與分組10%胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)液培養(yǎng)乳腺癌細胞MDA-MB-453，在恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，取對數(shù)期MDA-MB-453 細胞，將CD?KN2B-AS1 小分子干擾RNA（si-CDKN2B-AS1）、CD?KN2B-AS1 陰性對照（si-NC）分別轉(zhuǎn)染至MDA-MB-453 細胞，記為si-CDKN2B-AS1 組及si-NC 組；另將si-CDKN2B-AS1 分別與miR-339-5p 陰性對照（antimiR-NC）和miR-339-5p 特異性寡核苷酸抑制劑（an?ti-miR-339-5p）共同轉(zhuǎn)染至MDA-MB-453 細胞，記為si-CDKN2B-AS1+anti-miR-NC 組及si-CDKN2B-AS1+anti-miR-339-5p組。

1.3 RT-qPCR 法檢 測CDKN2B-AS1 及miR-339-5p 的表達水平各組細胞均進行24 h 培養(yǎng)，常規(guī)提取總RNA，并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，反應(yīng)條件為16 ℃、30 min，42 ℃、30 min，85 ℃、5 min，4 ℃、5 min；然后按照熒光定量試劑盒使用說明進行PCR。2-ΔΔCt法計算相對表達量。

1.4 流式細胞儀檢測細胞周期各組細胞均進行24 h 培養(yǎng)，在制備的單細胞懸液中加70%乙醇3 mL固定，PBS 洗滌，加RNase A 于37 ℃水浴30 min，加碘化丙啶（PI）避光30 min。應(yīng)用流式細胞儀及相關(guān)軟件檢測并分析細胞周期。

1.5 MTT 檢測細胞存活率各組細胞均進行24 h培養(yǎng)，每孔加MTT 溶液20μL，孵育4 h時棄除上清，每孔加150μL 二甲基亞砜（DMSO），應(yīng)用酶標儀對490 nm處檢測吸光度（OD）值進行測定，并計算細胞存活率（%）。

1.6 Western blotting 法檢測Ki67、P21、E-cad?herin、N-cadherin 蛋白表達常規(guī)加入RIPA 細胞裂解液對細胞蛋白進行提取，BCA 蛋白試劑盒對蛋白含量進行檢測。取蛋白溶液50μg 進行蛋白變性后，進行SDS-PAGE，將分離的蛋白凝膠轉(zhuǎn)移至PVDF膜，常規(guī)室溫封閉90 min，分別加相應(yīng)的一抗，4 ℃進行24 h 孵育。TBST 洗膜。再加入二抗，室溫下孵育2 h，TBST 洗膜。加入ELC，暗室顯影、拍照，用Quantity One 凝膠分析軟件處理，對各蛋白條帶灰度值進行分析，并計算各蛋白相對表達水平。

1.7 Transwell檢測細胞遷移和侵襲收集各組細胞進行無血清培養(yǎng)，取200μL 在Transwell 小室上層接種，并進行24 h培養(yǎng)，吸去培養(yǎng)液并后棉簽去除上層細胞，用多聚甲醛進行30 min的固定，然后用結(jié)晶紫染色10 min，顯鏡拍照并記錄遷移的細胞數(shù)量。細胞侵襲實驗：將100μL基質(zhì)膠Matrigel加于Transwell小室上層，待凝固后接種細胞，之后操作與細胞遷移相同。

1.8 熒光素酶報告實驗檢測CDKN2B-AS1 與miR-339-5p 靶向調(diào)控Starbase 數(shù)據(jù)庫證實CD?KN2B-AS1 與miR-339-5p 有結(jié)合位點。構(gòu)建野生型及突變型基因靶點CDKN2B-AS1 的熒光素酶表達載體，即WT-CDKN2B-AS1及MUT-CDKN2B-AS1，并將其分別與miR-NC 及miR-339-5p 共同轉(zhuǎn)染至MDA-MB-453 細胞，最后嚴格按說明書完成熒光素酶活性的檢測。

1.9 統(tǒng)計學方法應(yīng)用SPSS 20.0 統(tǒng)計軟件對相關(guān)數(shù)據(jù)進行分析，計量資料均符合正態(tài)分布，用xˉ±s表示，兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 在乳腺癌組織中CDKN2B-AS1 的表達乳腺癌組織中CDKN2B-AS1 表達水平為2.23±0.08，顯著高于癌旁組織的1.00±0.06，差異有統(tǒng)計學意義（t=74.82，P<0.001）。

2.2 抑制CDKN2B-AS1 對MDA-MB-453 增殖的影響si-CDKN2B-AS1 組MDA-MB-453 細胞中G0期細胞比例、P21表達水平高于si-NC組，S期細胞比例、細胞存活率及Ki67 表達水平低于si-NC 組（P<0.05），見圖1，表1。

表1 抑制細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑2B反義RNA1（CDKN2B-AS1）對MDA-MB-453細胞增殖的影響/±s

表1 抑制細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑2B反義RNA1（CDKN2B-AS1）對MDA-MB-453細胞增殖的影響/±s

注：si-NC 為CDKN2B-AS1 陰性對照，si-CDKN2B-AS1 為CDKN2B-AS1 小分子干擾RNA，Ki67 為增殖標記蛋白細胞增殖核抗原-67，P21 為細胞周期依賴性蛋白激酶抑制因子1A。

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圖1 Ki67、P21蛋白的表達

2.3 抑制CDKN2B-AS1 對MDA-MB-453 遷移、侵襲的影響與si-NC組相比，si-CDKN2B-AS1組MDAMB-453細胞中CDKN2B-AS1表達水平、細胞遷移、侵襲數(shù)及N-cadherin表達水平顯著降低，E-cadherin表達水平升高（P<0.05），見圖2，表2。

表2 抑制細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑2B反義RNA1（CDKN2B-AS1）對MDA-MB-453細胞遷移、侵襲的影響/±s

表2 抑制細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑2B反義RNA1（CDKN2B-AS1）對MDA-MB-453細胞遷移、侵襲的影響/±s

注：si-NC 為CDKN2B-AS1 陰性對照，si-CDKN2B-AS1 為CDKN2B-AS1 小分子干擾RNA，N-cadherin 為神經(jīng)型鈣黏蛋白，E-cadherin 為上皮型鈣黏蛋白。

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圖2 抑制CDKN2B-AS1對E-cadherin、N-cadherin表達的影響

2.4 CDKN2B-AS1靶向miR-339-5p數(shù)據(jù)庫預(yù)測顯示CDKN2B-AS1與miR-339-5p存在結(jié)合位點。與miR-NC 組0.99±0.05 相 比，miR-339-5p 組WT-CD?KN2B-AS1細胞熒光素酶活性0.20±0.03顯著降低（t=40.65，P<0.001）；而MUT-CDKN2B-AS1的細胞熒光素酶活性差異無統(tǒng)計學意義（t=0.38，P=0.706）。與si-NC組的0.95±0.05相比，si-CDKN2B-AS1組miR-339-5p表達水平2.83±0.07顯著升高（t=65.56，<0.001）。見圖3。

圖3 CDKN2B-AS1靶向miR-339-5p

2.5 抑制miR-339-5p 可逆轉(zhuǎn)抑制CDKN2B-AS1對MDA-MB-453 增殖、遷移、侵襲的影響si-CD?KN2B-AS1+anti-miR-339-5p 組MDA-MB-453 細 胞 中miR-339-5p 表達水平、G0 期細胞比例及P21、E-cad?herin 表達水平顯著降低，S 期細胞比例、細胞存活率、細胞遷移、侵襲數(shù)及Ki67、N-cadherin 表達水平顯著升高（P<0.05），見表3，4。

表3 抑制miR-339-5p可逆轉(zhuǎn)抑制細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑2B反義RNA1（CDKN2B-AS1）對MDA-MB-453細胞增殖、遷移、侵襲的影響/±s

表3 抑制miR-339-5p可逆轉(zhuǎn)抑制細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑2B反義RNA1（CDKN2B-AS1）對MDA-MB-453細胞增殖、遷移、侵襲的影響/±s

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表4 Ki67、PCNA、E-cadherin、N-cadherin蛋白的表達/±s

表4 Ki67、PCNA、E-cadherin、N-cadherin蛋白的表達/±s

注：Ki67 為增殖標記蛋白細胞增殖核抗原-67，P21 為細胞周期依賴性蛋白激酶抑制因子1A，N-cadherin 為神經(jīng)型鈣黏蛋白，E-cadherin 為上皮型鈣黏蛋白。

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3 討論

越來越多研究表明，lncRNA 與乳腺癌發(fā)生發(fā)展過 程 有 關(guān)，如MALAT1 可 抑 制 乳 腺 癌 轉(zhuǎn) 移［10］。LINC00673 可 并 通 過miR-515-5p/MARK4/Hippo 信號通路促進乳腺癌細胞增殖［11］。LncRNA HEIH通過miR-4458/SOCS1軸抑制三陰性乳腺癌細胞增殖和誘導(dǎo)凋亡［12］。研究發(fā)現(xiàn)CDKN2B-AS1在結(jié)腸癌中異常表達，其可能是結(jié)腸癌發(fā)展的診斷生物標志物［13］。CDKN2B-AS1 又名ANRIL，胃癌病人中CDKN2BAS1高表達，與TNM分期和腫瘤大小顯著相關(guān)，敲低CDKN2B-AS1顯著抑制胃癌細胞系的增殖［14］。干擾CDKN2B-AS1 可通過miR-181a-5p/TGFβ1 軸抑制宮頸癌細胞增殖、侵襲、遷移，并促進細胞凋亡［15］。說明CDKN2B-AS1 可參與癌癥等發(fā)生發(fā)展，但CD?KN2B-AS1 對乳腺癌機制研究不清楚。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與癌旁組織相比，乳腺癌組織中CDKN2B-AS1表達水平顯著升高。說明CDKN2B-AS1可能在乳腺癌中起促癌作用。而進一步轉(zhuǎn)染抑制CDKN2B-AS1表達后發(fā)現(xiàn)，G0期細胞比例明顯升高，而S期細胞比例明顯降低，說明抑制CDKN2B-AS1 可阻滯細胞周期；而細胞存活率、細胞遷移、侵襲數(shù)以及Ki67、Ncadherin 表達水平的顯著降低，P21、E-cadherin 表達水平的顯著升高，則說明可通過抑制CDKN2B-AS1而抑制細胞的增殖、遷移及侵襲。

研究報道在侵襲性細胞系MDA-MB-468 和MDA-MB-231以及乳腺癌組織中miR-339-5p表達下調(diào)，miR-339-5p 過表達在體外可對乳腺癌細胞的遷移和侵襲起到抑制作用，可能是乳腺癌預(yù)后的潛在生物標志物［16］。miR-339-5p 可減弱lncRNA MAFGAS1 誘導(dǎo)的乳腺癌的侵襲性［17］。miR-339-5p 可通過調(diào)節(jié)EMT 抑制非小細胞肺癌的轉(zhuǎn)移［18］。lncRNA MALAT1 通過與miR-339-5p 結(jié)合來調(diào)節(jié)BLCAP 的表達，并促進乳腺癌預(yù)后不良［19］。本研究顯示CD?KN2B-AS1 可靶向調(diào)控miR-339-5p，而抑制miR-339-5p逆轉(zhuǎn)抑制CDKN2B-AS1對MDA-MB-453細胞增殖、遷移、侵襲的作用。提示CDKN2B-AS1 可通過對miR-339-5p 的調(diào)控而影響MDA-MB-453 細胞的增殖、遷移及侵襲。

綜上所述，抑制CDKN2B-AS1 表達可抑制乳腺癌MDA-MB-453 細胞增殖、遷移、侵襲，可能與miR-339-5p表達有關(guān)。