王航宇，楊文義，韓大正，魏書堂，武利萍，徐夢(mèng)陽，閆春曉，譚莉霞，董勇，楊國威，華靜，杜瑩瑩

作者單位：河南大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化病聯(lián)合微創(chuàng)病區(qū)，河南 開封 475001

潰瘍性結(jié)腸炎（UC）是臨床常見的慢性炎癥性腸道疾病，可發(fā)于任何年齡，而相較于年輕病人，老年病人受年齡影響，身體機(jī)能降低，治療更為棘手［1-2］。目前UC發(fā)病機(jī)制尚未明確，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為免疫系統(tǒng)紊亂引起的免疫炎癥反應(yīng)是其發(fā)病的主要因素［3-，4］。有研究表明，核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白6（NLRP-6）具有抑制天然免疫反應(yīng)相關(guān)信號(hào)通路作用，能夠促進(jìn)白細(xì)胞介素-18（IL-18）及抗菌肽的分泌，參與腸黏膜屏障的損傷及修復(fù)過程，與腸道炎癥性疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)［5-6］。而降鈣素原（PCT）是細(xì)菌感染、內(nèi)毒素刺激后機(jī)體大量表達(dá)的炎性介質(zhì)，在腸道炎癥反應(yīng)中也發(fā)揮著重要作用［7］。本研究分析老年UC病人NLRP-6、PCT和IL-18表達(dá)水平，分析三者用于評(píng)估UC病情的臨床意義，報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2019 年1 月至2020 年12 月河南大學(xué)第一附屬醫(yī)院收治的72例老年UC 病人。72例病人中活動(dòng)期52 例（輕度18 例，中度20 例，重度14 例），緩解期20 例?；顒?dòng)期病人中男30 例，女22例；年齡（65.42±6.37）歲，范圍為60～72 歲；病程（4.21±1.38）年，范圍為1～6 年；病變部位包括直腸24 例，乙狀結(jié)腸16 例，降結(jié)腸12 例。緩解期病人中男12 例，女8 例；年齡（64.87±4.96）歲，范圍為60～73歲；病程（3.92±1.51）年，范圍為1～6 年；病變部位包括直腸10 例，乙狀結(jié)腸7 例，降結(jié)腸3 例。緩解期、活動(dòng)期病人一般資料差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。納入標(biāo)準(zhǔn)：符合《炎癥性腸病診斷與治療的共識(shí)意見（2018年·北京）》［8］診斷標(biāo)準(zhǔn)；年齡≥60歲；對(duì)研究知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他消化道疾?。缓喜盒阅[瘤、自身免疫性疾病；有非甾體抗炎藥、質(zhì)子泵抑制劑等藥物長期應(yīng)用史；合并重要器官實(shí)質(zhì)性疾病；酗酒；有精神疾病史。病人或其近親屬知情同意，本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)赫爾辛基宣言》相關(guān)要求。

1.2 方法NLRP-6 陽性細(xì)胞蛋白的表達(dá)檢驗(yàn)：取病人直腸或結(jié)腸黏膜切片標(biāo)本，采用Eli VisionTM?plus即用型免疫組化試劑盒及二氨基聯(lián)苯胺顯色劑進(jìn)行免疫組化染色，高倍鏡下（×400）選擇5個(gè)視野，采用Image-ProPlus 6.0 軟件測(cè)定各視野中陽性染色區(qū)域的累積光密度值，取平均值為該黏膜組織中NLRP-6陽性細(xì)胞蛋白的表達(dá)水平。

NLRP-6、IL-18 mRNA 表達(dá)水平檢測(cè)：取病人直腸或結(jié)腸黏膜切片標(biāo)本，Trizol 法提取RNA，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA，再進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，β-actin 為內(nèi)參，以2-ΔΔCt法計(jì)算NLRP-6、IL-18 mRNA表達(dá)水平。

IL-18、PCT 檢測(cè)：腸鏡檢查前1 d 采集病人6 mL血液標(biāo)本，以酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)IL-18 水平，以雙抗夾心免疫化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)血清PCT水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法數(shù)據(jù)分析采用SPSS 21.0 軟件。正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；偏態(tài)分布的資料以M（P25，P75）表示，比較采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)；相關(guān)性分析采用Pearson 相關(guān)分析法和Spearman 相關(guān)分析法；各檢測(cè)指標(biāo)均建立均繪制受試者工作特征曲線（ROC 曲線），讀取最大約登指數(shù)，對(duì)應(yīng)計(jì)算理論閾值和靈敏度、特異度；聯(lián)合診斷ROC 曲線繪制時(shí)建立logistic 預(yù)測(cè)/診斷評(píng)估模型，依據(jù)所得回歸系數(shù)B，歸一化加權(quán)計(jì)算并對(duì)應(yīng)處理各樣本資料，由此進(jìn)行聯(lián)合應(yīng)用的ROC 分析；P<0.05表明差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 病人NLRP-6、PCT 和IL-18 表達(dá)水平比較緩解期病人NLRP-6 基因和蛋白表達(dá)高于活動(dòng)期（P<0.05），IL-18 基因表達(dá)、血清IL-18、血清PCT 水平低于活動(dòng)期（P<0.05），見表1。

表1 老年UC病人72例NLRP-6、PCT和IL-18表達(dá)水平比較/±s

表1 老年UC病人72例NLRP-6、PCT和IL-18表達(dá)水平比較/±s

注：UC為潰瘍性結(jié)腸炎，NLRP-6為核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白6，IL-18為白細(xì)胞介素-18，PCT為降鈣素原。①數(shù)據(jù)中，偏態(tài)分布的資料以M（P25，P75）表示。

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2.2 不同病情活動(dòng)度病人NLRP-6、PCT 和IL-18表達(dá)水平比較活動(dòng)期病人NLRP-6 基因和蛋白表達(dá)比較：輕度>中度>重度（P<0.05），IL-18基因表達(dá)、血清IL-18、血清PCT 比較：重度>中度>輕度（P<0.05），見表2。

表2 老年UC病人活動(dòng)期52例不同病情活動(dòng)度NLRP-6、PCT、IL-18表達(dá)水平比較/±s

表2 老年UC病人活動(dòng)期52例不同病情活動(dòng)度NLRP-6、PCT、IL-18表達(dá)水平比較/±s

注：UC為潰瘍性結(jié)腸炎，NLRP-6為核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白6，IL-18為白細(xì)胞介素-18，PCT為降鈣素原。①數(shù)據(jù)中，偏態(tài)分布的資料以M（P25，P75）表示。

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2.3 相關(guān)性分析活動(dòng)期病人NLRP-6基因表達(dá)和蛋白表達(dá)均與IL-18 基因表達(dá)、血清IL-18、血清PCT及疾病活動(dòng)度負(fù)相關(guān)，IL-18 基因表達(dá)與血清IL-18、血清PCT 及疾病活動(dòng)度正相關(guān)，血清IL-18 與血清PCT 及疾病活動(dòng)度正相關(guān)，血清PCT 與疾病活動(dòng)度正相關(guān)（均P<0.05），見表3。

表3 活動(dòng)期病人NLRP-6、PCT和IL-18表達(dá)水平間的相關(guān)性及與疾病活動(dòng)度的相關(guān)性

2.4 NLRP-6、PCT 和IL-18 表達(dá)水平評(píng)估UC 活動(dòng)期中重度的價(jià)值經(jīng)ROC 分析可知NLRP-6 基因表達(dá)、NLRP-6 蛋白表達(dá)、IL-18 基因表達(dá)、血清IL-18、血清PCT 評(píng)估UC 活動(dòng)期中重度均具有較好診斷價(jià)值，AUC（95%CI）分 別 為0.92（0.82～0.98）、0.90（0.79～0.97）、0.74（0.60～0.85）、0.86（0.74～0.94）、0.98（0.90～1.00）；聯(lián)合應(yīng)用血清IL-18、PCT 評(píng)估UC 活動(dòng)期中重度的評(píng)估價(jià)值高于各指標(biāo)單獨(dú)應(yīng)用AUC（95%CI）為0.99（0.92～1.00）。見表4，圖1。

圖1 NLRP-6、PCT和IL-18表達(dá)水平評(píng)估UC活動(dòng)期中重度的ROC曲線

表4 NLRP-6、PCT和IL-18表達(dá)水平評(píng)估UC病情程度

3 討論

UC 發(fā)病機(jī)制并不十分明確，治療方法較為局限，尤其是老年病人身體機(jī)能較差，能夠準(zhǔn)確診斷、評(píng)估病情對(duì)治療具有重要意義［9-10］。近年研究發(fā)現(xiàn)，炎癥小體可以識(shí)別外源性和內(nèi)源性信號(hào)，調(diào)節(jié)多條信號(hào)通路的表達(dá)，促進(jìn)炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生，在介導(dǎo)炎癥損傷、自身免疫反應(yīng)方面發(fā)揮著重要作用，能夠影響腸道炎癥的發(fā)生、發(fā)展，各類炎癥小體及其調(diào)控的相關(guān)因子或可成為UC 診斷、病情評(píng)估的新生物標(biāo)志物［11］。

NLRP-6 是能抑制天然免疫反應(yīng)相關(guān)信號(hào)通路的NLRs 蛋白家族成員，可促進(jìn)半胱氨酸蛋白酶-1（caspase-1）的激活，進(jìn)而激活促炎性因子IL-18 前體，激活的前體切割為成熟的IL-18 細(xì)胞因子釋放到胞外參與炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答，參與UC 免疫系統(tǒng)紊亂和腸道發(fā)生慢性、反復(fù)性炎癥反應(yīng)過程［12-13］。細(xì)胞因子IL-18 在炎癥和體內(nèi)平衡中發(fā)揮雙重作用，參與多種免疫性疾病的發(fā)生，部分研究證實(shí)，IL-18 的異常表達(dá)與UC 的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)［14］。目前關(guān)于NLRP6、IL-18在腸道炎癥性疾病中的作用機(jī)制已受到臨床關(guān)注，但現(xiàn)有研究多為動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，相關(guān)人體的研究較少，仍需臨床進(jìn)行深入研究。除NLRP6、IL-18 外，PCT 是目前臨床中常用的炎癥標(biāo)志物，與自身免疫性疾病及慢性炎癥性疾病病情進(jìn)展密切相關(guān)，在感染、炎癥性疾病的發(fā)生、預(yù)測(cè)和診治過程中應(yīng)用廣泛，但在UC 診治中的應(yīng)用報(bào)道較少［15］?；诖?，本研究分析老年UC 病人NLRP6、IL-18、PCT的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，相較于緩解期，活動(dòng)期病人處于NLRP-6基因和蛋白低表達(dá)而IL-18基因表達(dá)、血清IL-18、血清PCT高表達(dá)狀態(tài)，且隨著疾病活動(dòng)程度的加重，NLRP-6基因和蛋白降低，IL-18基因表達(dá)、血清IL-18、血清PCT表達(dá)增加，說明UC發(fā)生后NLRP-6基因和蛋白低表達(dá)，IL-18基因表達(dá)、血清IL-18、血清PCT 高表達(dá)，與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)［16-17］結(jié)果一致?？赡艿臋C(jī)制為：UC 發(fā)病后NLRP-6 與caspase-1 和含胱天蛋白酶募集結(jié)構(gòu)域（CARD 結(jié)構(gòu)域）的凋亡相關(guān)顆粒樣蛋白結(jié)合，其在機(jī)體促進(jìn)IL-18 的成熟及分泌，IL-18 通過誘導(dǎo)和激活免疫細(xì)胞、誘導(dǎo)促炎性細(xì)胞因子、趨化因子和生長因子的產(chǎn)生，參與上皮修復(fù)和愈合過程，使得UC病人NLRP-6表達(dá)下調(diào)而IL-18 表達(dá)上調(diào)，NLRP-6 在UC 發(fā)病過程中可能發(fā)揮了保護(hù)性作用［18-19］；同時(shí)UC 病人機(jī)體發(fā)生的一系列免疫應(yīng)答、炎癥反應(yīng)使血清PCT 表達(dá)上調(diào)，因此，NL?RP-6、IL-18、PCT 均參與UC 病情加重的免疫炎癥過程。相關(guān)性分析顯示，活動(dòng)期病人NLRP-6 基因和蛋白表達(dá)、IL-18 基因表達(dá)、血清IL-18、血清PCT 表達(dá)間均存在相關(guān)性，且NLRP-6 基因表達(dá)和蛋白表達(dá)與疾病活動(dòng)度負(fù)相關(guān)，IL-18 基因表達(dá)、血清IL-18、血清PCT表達(dá)與疾病活動(dòng)度正相關(guān)，提示NLRP-6、IL-18、PCT 表達(dá)是相互影響的，NLRP-6 基因和蛋白的低表達(dá)一定程度上導(dǎo)致了IL-18 和PCT 的高表達(dá)，三者均參與UC 病情進(jìn)展。此外，本研究中ROC曲線結(jié)果顯示，NLRP-6 基因表達(dá)、NLRP-6 蛋白表達(dá)、IL-18 基因表達(dá)、血清IL-18、血清PCT 均作為評(píng)估UC 活動(dòng)期中重度的指標(biāo)，診斷效能較好，表明臨床檢測(cè)UC 病人NLRP-6、IL-18、PCT 表達(dá)水平具有指導(dǎo)意義。考慮到臨床實(shí)際中檢測(cè)基因、蛋白表達(dá)相較于血清生化檢測(cè)更為復(fù)測(cè)，本研究還分析了血清IL-18 聯(lián)合PCT 評(píng)估UC 活動(dòng)期中重度的效能，評(píng)估價(jià)值優(yōu)于單一指標(biāo)檢測(cè)，具有較高臨床價(jià)值。

綜上所述，老年UC 病人NLRP-6、PCT 和IL-18表達(dá)均與疾病活動(dòng)度有關(guān)，檢測(cè)三者水平用于指導(dǎo)疾病活動(dòng)度的評(píng)估。但本研究納入樣本量較少，且未能判斷檢測(cè)指標(biāo)判斷疾病痊愈的價(jià)值，有待在后續(xù)研究中加以改進(jìn)。