馮梅，江霞，王艷麗，王奇峰

作者單位：1武漢大學(xué)附屬愛爾眼科醫(yī)院屈光科，湖北 武漢 430063；2華中科技大學(xué)協(xié)和深圳醫(yī)院眼科，廣東 深圳 518052

糖尿病性視網(wǎng)膜?。―R）是糖尿病的常見且特定的微血管并發(fā)癥，預(yù)計到2040年將影響6.42億成年人，DR 會影響三分之一的糖尿病病人，是視力喪失的主要原因之一［1-2］。許多DR 病人對目前的治療方法［如激光光凝、眼內(nèi)注射類固醇和抗血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）藥物］反應(yīng)不佳，且這些治療手段無法從發(fā)病機制上改善DR，并且必須通過玻璃體內(nèi)注射頻繁給藥［3-4］。因此，迫切需要開發(fā)新的策略以改善DR 的治療。臨床上，無論是否患有糖尿病性黃斑水腫（DME），DR 大致可分為早期非增殖性DR（NPDR）和晚期增殖性DR（PDR）［5］。慢性視網(wǎng)膜炎癥被認(rèn)為是NPDR 和PDR 發(fā)病的主要原因，白細(xì)胞浸潤到視網(wǎng)膜，炎性遞質(zhì)的釋放，可破壞血-視網(wǎng)膜屏障（blood retinal barrier，BRB），使血管滲漏和新血管形成［6］。研究發(fā)現(xiàn)DR 小鼠中核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3（NLRP3）的激活會損害視網(wǎng)膜免疫反應(yīng)，導(dǎo)致BRB 破壞，在DR 晚期觀察到的血管滲漏和視網(wǎng)膜新血管形成［7］。富氫水是一種富含氫氣的水，其可在不同病理狀態(tài)下減輕組織的氧化應(yīng)激和炎性損傷，如心肌損傷［8］、肝炎、腎炎等［9］；還可抑制NLRP3 炎癥小體的激活減輕膿毒癥小鼠肺部炎癥［10-11］；另有研究發(fā)現(xiàn)富氫水對糖尿病病人慢性炎癥、氧化應(yīng)激均有改善作用［12-13］。富氫水對DR 是否具有保護(hù)作用還未見相關(guān)報道，故本研究以DR 大鼠為對象，探究富氫水對DR 的影響及作用機制，為富氫水的臨床應(yīng)用及DR的治療提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料2020 年6—9 月，8 周齡，雄性Sprague-Dawley 大鼠65 只，體質(zhì)量范圍180～200 g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，許可證號為SCXK（京）2016-0011，所有動物均嚴(yán)格按照動物飼養(yǎng)規(guī)則喂養(yǎng)，溫度為（24±2）℃，濕度范圍為50%～60%，自由飲水和攝食。本研究中的所有實驗均符合“視覺和眼科研究協(xié)會”關(guān)于“動物在眼科和視覺研究中的使用”聲明的要求。

1.2 藥物及試劑鏈脲佐菌素（STZ）（美國Sigma公司，批號S0130）；復(fù)方托吡卡胺滴眼液（日本參天制藥株式會社，批號J20180051）；Genteal tears 凝膠滴劑（美國Novartis Pharmaceuticals）；熒光素鈉染料（F8140，Solarbio）；伊文思藍(lán)染色液（R3248，南京沃博生物科技有限公司）；異凝集素B4（isolectin GSIB4，美國Vectorlabs，貨號FL-1201）；大鼠血管生成素-1（Ang-1）（ml023339）、VEGF（ml064294）、白細(xì)胞介素1β（IL-1β）（ml037361）、白細(xì)胞介素6（IL-6）（ml064292）酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）試劑盒均購自上海酶聯(lián)生物公司；兔抗Bcl-2 相關(guān)X 蛋白（Bax）（ab32503）、B 淋巴細(xì)胞瘤-2（Bcl-2）（ab196495）、硫氧還蛋白相互作用蛋白（TXNIP）（ab188865）、NL?RP3（ab263899）、IL-1β（ab9787）、胱天蛋白酶-1（cas?pase-1）（ab179515）、β-肌動蛋白（β-actin）（ab8227）、山羊抗兔IgG H&L（HRP）（ab205718）、山羊抗兔IgG H&L（Alexa Fluor? 594）（ab1500080）均購自英國abcam 公司；HE 染色試劑（C0105S）、RIPA 裂解液（P0013B）、BCA 試劑盒（P0010）均購自碧云天生物科技公司；Accu-Chek Active 型羅氏活力血糖儀（羅氏血糖健康醫(yī)護(hù)公司）；多功能酶標(biāo)儀（iMark680，Bio-Rad 公司）、熒光顯微鏡（日本Olympus 公司）；Hydrogen-500E高純氫氣發(fā)生器（英國普拉勒科技有限公司）；小動物視網(wǎng)膜影像系統(tǒng)（Micron Ⅳ，美國Phoenix Research Labs 公司）；三維光學(xué)相干斷層掃描儀（OCT-2000 型，日本Topcon 公司）；多功能真彩色細(xì)胞圖像分析系統(tǒng)（KH-3000，美國Media Cyber?netics公司）。

1.3 方法

1.3.1富氫水的制備 將氫氣溶于生理鹽水中制備飽和溶液（壓力0.4 MPa，維持6 h），富氫水中氫氣濃度為0.6 mmol/mL，保存于4 ℃冰箱中備用；每周制備新鮮富氫水用于實驗。

1.3.2動物分組及造模 大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d 后開始實驗，采用隨機數(shù)字表法隨機選取15只大鼠為空白組，以普通飼料喂養(yǎng)，參考文獻(xiàn)［14］一次性尾靜脈注射60 mg/kg 鏈脲STZ 造模（注射前大鼠禁食20 h），3 d 后尾尖處取血檢測空腹血糖（FBG），連續(xù)3 d的FBG 超過16.7 mmol/L 的大鼠被歸為糖尿病模型?？瞻捉M注射等量檸檬酸鹽緩沖液。有2只大鼠在實驗過程中死亡，3 只大鼠不合格，不納入后續(xù)實驗。將造模成功的糖尿病大鼠根據(jù)FBG 水平分為模型組、富氫水低、高劑量組（5、10 mL/kg），每組15 只。除空白組外，其余大鼠喂養(yǎng)高脂高糖飼料（66.5%基礎(chǔ)飼料+10%豬油+20%蔗糖+2.5%膽固醇+1%膽酸鈉）［15］，喂養(yǎng)8 周后，進(jìn)行眼底照相和熒光素血管造影（FFA），觀察視網(wǎng)膜是否發(fā)生病變。結(jié)果均觀察到大鼠視網(wǎng)膜有微血管瘤、血管擴張、迂曲，有明顯的熒光素滲漏和新生血管；表明糖尿病大鼠視網(wǎng)膜發(fā)生病變，且處于晚期PDR，建模成功。

1.3.3給藥方法 模型制備完成后，富氫水各劑量組腹腔注射相應(yīng)劑量的藥物，空白組和模型組給予等量生理鹽水腹腔注射，1次/天，連續(xù)給藥28 d。

1.3.4取材及指標(biāo)檢測

1.3.4.1空腹血糖（FBG） 給藥結(jié)束后，大鼠稱重并記錄，采集尾大鼠末梢毛細(xì)血管全血，F(xiàn)BG水平。

1.3.4.2眼底熒光素血管造影（FFA） 檢查開始前大鼠眼睛滴入復(fù)方托吡卡胺進(jìn)行擴張，并滴入gen?teal tears 凝膠，以防止角膜干燥。向大鼠腹腔內(nèi)注射10%熒光素鈉染料（用無菌鹽水稀釋10 倍，劑量為2 mL/kg）。注射后30 s 拍攝FFA 圖像，觀察大鼠右眼熒光素滲漏和新生血管。使用熒光分析軟件計算相對熒光素強度。

1.3.4.3光學(xué)相干斷層掃描（OCT）檢測視網(wǎng)膜厚度FFA檢查完成后，OCT測量大鼠視盤周圍視網(wǎng)膜厚度（測量點為距視盤盤沿約1.5 mm位置），在成像之前，先在眼睛上涂抹Genteal tears以保持角膜濕潤。角度每隔30°測量1次，每只大鼠共測量12次，在軟件中計算視網(wǎng)膜厚度取平均值；再進(jìn)行眼底彩色照相。

1.3.4.4視網(wǎng)膜血管通透性的測量 通過測量視網(wǎng)膜血管的伊文思藍(lán)-白蛋白復(fù)合物滲漏來分析視網(wǎng)膜血管通透性。每組隨機選取5 只大鼠，將伊文思藍(lán)（EB）染料溶解在生理鹽水（45 g/L）中。在深麻醉下，將染料（45 mg/kg）注射到每只大鼠的尾靜脈中。染料循環(huán)120 min 后，打開胸腔，并插入左心室。以66 mL/min 向每只大鼠灌注4%多聚甲醛2 min 以清除染料。灌注后，摘除眼睛并分離視網(wǎng)膜。測量每個視網(wǎng)膜的濕重。在70 ℃下將每個視網(wǎng)膜在0.12 mL 甲酰胺中孵育18 h 來提取EB。提取物在4 ℃下以70 000g離心45 min。在620 nm 和720 nm 測量濾液的吸光度。染料濃度由甲酰胺中EB 的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算，乘以120μL 即為EB 滲漏量（ng），并標(biāo)準(zhǔn)化為視網(wǎng)膜重量（mg），結(jié)果表示為μg/g。

1.3.4.5HE染色 每組隨機選取5只大鼠，左眼行上直肌縫線定位后，取出眼球，立即置于福爾馬林、乙醇、冰醋酸混合固定液中固定12 h，然后去除多余組織（晶狀體、玻璃體）繼續(xù)固定12 h。取距視乳頭下方1 mm處的視網(wǎng)膜組織，分級乙醇脫水，常規(guī)石蠟包埋，以事先標(biāo)記好的鼻側(cè)視網(wǎng)膜作為包埋面。以約4μm厚度行連續(xù)切片，進(jìn)行HE染色。光鏡下觀察視網(wǎng)膜病理變化；并計算距視盤邊緣100μm處100μm長度內(nèi)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞（RGC）層單位面積RGC數(shù)。

1.3.4.6免疫熒光染色 取“1.3.4.5”中石蠟切片，二甲苯脫蠟，0.01 mol/L PBS 清洗3 次，微波修復(fù)15 min，PBS 清洗后在室溫下用1%BSA 封閉20 min。滴加一抗isolectin GS-IB4（1∶100）4 ℃孵育過夜，洗去一抗，加Alexa Fluor? 594 標(biāo)記的二抗室溫下孵育1 h，抗熒光淬滅劑封片。熒光顯微鏡下觀察所有免疫熒光標(biāo)記切片中新生血管情況。

1.3.4.7TUNEL 染色 將“1.3.4.4”中石蠟切片參照TUNEL 染色試劑盒說明書的步驟進(jìn)行染色；在顯微鏡下觀察切片并拍照（每個切片選取5個視野）。利用Image-J 軟件分析細(xì)胞凋亡率，細(xì)胞凋亡率（%）=視野內(nèi)陽性染色細(xì)胞數(shù)目/細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.3.4.8視網(wǎng)膜TXNIP/NLRP3 通路相關(guān)蛋白的表達(dá) 另外5只大鼠的左眼視網(wǎng)膜剪碎后置于干凈試管中，加入RIPA裂解液研磨后提取組織蛋白。BCA法測定其中總蛋白濃度，平衡蛋白濃度為3 g/L，各組取10μL平衡后的蛋白提取液上樣，SDS-PAGE 凝膠電泳，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜，5%的脫脂奶粉封閉2 h，按照分子量及蛋白marker 標(biāo)記裁剪目的條帶，加入相應(yīng)的一抗（β-actin、TXNIP、NLRP3、Bax、Bcl-2、Caspase-1、IL-1β，按1∶1 000的比例稀釋），4 ℃冰箱孵育過夜，漂洗后加入二抗（按1∶5 000 的比例稀釋）室溫孵育2 h，ECL 顯色，將條帶置于凝膠成像儀中拍照，并以Im?age-J軟件分析圖片，得出各蛋白相對表達(dá)量。

1.3.4.9視網(wǎng)膜勻漿中Ang-1、VEGF水平 將大鼠右眼視網(wǎng)膜置于干凈試管中，制備勻漿液；ELISA試劑盒測量視網(wǎng)膜勻漿中Ang-1、VEGF、IL-1β、IL-6水平。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法使用GraphPad Prism 6.0 和SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)表示為±s，使用單向方差分析進(jìn)行多個組之間的比較，組間有差異進(jìn)一步采用SNK-q檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠FBG和體質(zhì)量與空白組相比，模型組大鼠FBG 水平顯著升高，體質(zhì)量顯著降低（P<0.05）；與模型組相比，富氫水低、高劑量組大鼠FBG水平明顯降低，體質(zhì)量明顯增加（P<0.05）。見表1。

表1 富氫水對糖尿病性視網(wǎng)膜?。―R）大鼠空腹血糖（FBG）和體質(zhì)量的影響/±s

表1 富氫水對糖尿病性視網(wǎng)膜?。―R）大鼠空腹血糖（FBG）和體質(zhì)量的影響/±s

注：①與空白組比，P<0.05。②與模型組比，P<0.05。

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2.2 各組大鼠視網(wǎng)膜血管滲漏和新生血管情況彩色眼底照片、FFA照片和免疫熒光染色結(jié)果顯示，與空白組相比，DR 模型組可觀察到大鼠視網(wǎng)膜新血管形成和血管曲折，血管滲漏嚴(yán)重（P<0.05）；與模型組相比，富氫水低、高劑量組大鼠視網(wǎng)膜新血管數(shù)量和血管滲漏明顯降低（P<0.05）。見圖1，表2。

圖1 各組大鼠的彩色眼底照片、眼底熒光素造影照片（FFA）和血管Isolectin-GS IB4免疫熒光染色（×40） 圖3 各組視網(wǎng)膜病理變化情況（HE染色×200） 圖4 各組大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)元凋亡（TUNEL檢測×100）

2.3 各組大鼠視網(wǎng)膜厚度OCT 結(jié)果顯示，與空白組相比，模型組大鼠視網(wǎng)膜下有明顯出血，視網(wǎng)膜厚度顯著降低（P<0.05）；與模型組相比，富氫水低、高劑量組大鼠視網(wǎng)膜下出血減輕，視網(wǎng)膜厚度明顯增加（P<0.05）。見圖2，表2。

表2 富氫水對糖尿病性視網(wǎng)膜病（DR）大鼠視網(wǎng)膜新生血管、視網(wǎng)膜厚度的影響/±s

表2 富氫水對糖尿病性視網(wǎng)膜?。―R）大鼠視網(wǎng)膜新生血管、視網(wǎng)膜厚度的影響/±s

注：①與空白組比，P<0.05。②與模型組比，P<0.05。

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圖2 各組大鼠OCT檢查照片（比例尺：50微米）：A為空白組；B為模型組；C為富氫水低劑量組；D為富氫水高劑量組

2.4 各組大鼠BRB 通透性、視網(wǎng)膜病理變化與空白組相比，模型組大鼠的BRB通透性顯著增加（P<0.05）；與模型組相比，富氫水低、高劑量組大鼠的BRB通透性明顯降低（P<0.05）。見表3。

空白組大鼠視網(wǎng)膜整體形態(tài)完整，細(xì)胞排列緊密。與空白組相比，模型組大鼠視網(wǎng)膜細(xì)胞結(jié)構(gòu)遭到破壞，水腫明顯，神經(jīng)纖維層（NFL）表面大量炎性滲出，內(nèi)核層（INL）可見細(xì)胞數(shù)目明顯減少，體積變大，顏色變淺，RGC 數(shù)量顯著減少（P<0.05）；與模型組相比，富氫水低、高劑量組大鼠視網(wǎng)膜水腫情況逐漸減輕，損傷得到改善，RGC 數(shù)量明顯增加（P<0.05）。見圖3，表3。

表3 富氫水對糖尿病性視網(wǎng)膜?。―R）大鼠伊文思藍(lán)（EB）染料滲漏量、視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)量的影響/±s

表3 富氫水對糖尿病性視網(wǎng)膜?。―R）大鼠伊文思藍(lán)（EB）染料滲漏量、視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)量的影響/±s

注：①與空白組比，P<0.05。②與模型組比，P<0.05。

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2.5 各組大鼠視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡及相關(guān)蛋白的表達(dá)情況與空白組相比，模型組大鼠視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡率顯著升高（P<0.05）；與模型組相比，富氫水低、高劑量組視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡率明顯降低（P<0.05）。

與空白組相比，模型組大鼠視網(wǎng)膜Bax、Bcl-2表達(dá)、Bax/Bcl-2比值顯著增加（P<0.05）；與模型組相比，富氫水低、高劑量組視網(wǎng)膜Bax表達(dá)、Bax/Bcl-2比值明顯降低，Bcl-2表達(dá)明顯增加（P<0.05）。見圖4，5；表4。

表4 富氫水對糖尿病性視網(wǎng)膜?。―R）大鼠凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響/±s

表4 富氫水對糖尿病性視網(wǎng)膜?。―R）大鼠凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響/±s

注：Bax為Bcl-2相關(guān)X蛋白，Bcl-2為B淋巴細(xì)胞瘤-2，β-actin為β-肌動蛋白。①與空白組比，P<0.05。②與模型組比，P<0.05。

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圖5 各組大鼠視網(wǎng)膜凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)

2.6 各組大鼠視網(wǎng)膜TXNAIP/NLRP3 通路相關(guān)蛋B白的表達(dá)與空白組相比，模型組大鼠視網(wǎng)膜TXNIP、NLRP3、IL-1β、Caspase-1 表達(dá)顯著增加（P<0.05）；與模型組相比，富氫水低、高劑量組視網(wǎng)膜TXNIP、NLRP3、IL-1β、Caspase-1 表達(dá)明顯降低（P<0.05）。見圖6，表5。

表5 富氫水對糖尿病性視網(wǎng)膜?。―R）大鼠視網(wǎng)膜TXNIP、NLRP3通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響/±s

表5 富氫水對糖尿病性視網(wǎng)膜病（DR）大鼠視網(wǎng)膜TXNIP、NLRP3通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響/±s

注：TXNIP 為硫氧還蛋白相互作用蛋白，NLRP3 為核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3，IL-1β 為白細(xì)胞介素1β，caspase-1 為胱天蛋白酶-1。①與空白組比，P<0.05。②與模型組比，P<0.05。

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圖6 各組大鼠視網(wǎng)膜TXNIP/NA LRP3通路相關(guān)蛋白的表達(dá)B

2.7 各組大鼠視網(wǎng)膜勻漿中Ang-1、VEGF、IL-1β、IL-6 水平與空白組相比，模型組大鼠視網(wǎng)膜勻漿中Ang-1、VEGF、IL-1β、IL-6 水 平 顯 著 增 加（P<0.05）；與模型組相比，富氫水低、高劑量組視網(wǎng)膜勻漿中Ang-1、VEGF、IL-1β、IL-6 水平明顯降低（P<0.05）。見表6。

表6 富氫水對糖尿病性視網(wǎng)膜病（DR）大鼠視網(wǎng)膜勻漿中血管生成素-1（Ang-1）、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、白細(xì)胞介素1β（IL-1β）、白細(xì)胞介素6（IL-6）水平的影響/±s

表6 富氫水對糖尿病性視網(wǎng)膜病（DR）大鼠視網(wǎng)膜勻漿中血管生成素-1（Ang-1）、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、白細(xì)胞介素1β（IL-1β）、白細(xì)胞介素6（IL-6）水平的影響/±s

注：Ang-1為血管生成素-1，VEGF為血管內(nèi)皮生長因子，IL-1β為白細(xì)胞介素1β，IL-6為白細(xì)胞介素6。①與空白組比，P<0.05。②與模型組比，P<0.05。

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3 討論

炎癥與氧化應(yīng)激在DR 血-視網(wǎng)膜屏障（BRB）通透性中發(fā)揮重要作用［16］。在DR 早期，膠質(zhì)細(xì)胞會通過釋放神經(jīng)營養(yǎng)因子和血管生成因子來保護(hù)視網(wǎng)膜免受高血糖引起的損傷，從而使其活動過度，隨著時間的增加，慢性高血糖會引起大量炎性因子釋放，隨后在DR晚期出現(xiàn)明顯的新生血管［7］。研究發(fā)現(xiàn)在DR 小鼠視網(wǎng)膜中發(fā)現(xiàn)大量小膠質(zhì)細(xì)胞的活化和增殖［17］。小膠質(zhì)細(xì)胞在DR 晚期分泌大量促炎遞質(zhì)（如IL-1β、IL-6），會損害BRB 并導(dǎo)致視網(wǎng)膜神經(jīng)元和血管損傷［18］。本研究結(jié)果顯示，DR 大鼠視網(wǎng)膜有較多新生血管和血管曲折，血管滲漏嚴(yán)重，BRB 通透性顯著增加，且視網(wǎng)膜厚度降低，細(xì)胞凋亡增加，視網(wǎng)膜細(xì)胞明顯水腫，有大量炎性滲出，神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層細(xì)胞數(shù)量減少；說明DR 大鼠視網(wǎng)膜BRB 破壞，神經(jīng)元和血管出現(xiàn)明顯損傷。研究發(fā)現(xiàn)富氫水對代謝綜合征（包括血脂異常，高血糖和肥胖）病人慢性炎癥、氧化應(yīng)激均有改善作用［12］，并可有效改善多種糖尿病相關(guān)標(biāo)志物水平和全身性DNA 氧化損傷［13］。在本研究中，給予富氫水干預(yù)的DR 大鼠，F(xiàn)BG 降低，體質(zhì)量增加，新血管數(shù)量、血管滲漏、BRB 通透性明顯降低，且視網(wǎng)膜厚度增加，細(xì)胞凋亡減少，視網(wǎng)膜水腫情況減輕，損傷得到改善；提示富氫水可抑制新生血管形成，降低DR 大鼠視網(wǎng)膜血管通透性，保護(hù)BRB和視網(wǎng)膜神經(jīng)元損傷。

本研究還發(fā)現(xiàn)DR 大鼠視網(wǎng)膜中Caspase-1 和IL-1β表達(dá)顯著增加。IL-1β可通過自分泌的方式激活Caspase-1放大初始炎癥反應(yīng)，也會引起視網(wǎng)膜線粒體功能障礙，線粒體DNA 損傷和細(xì)胞凋亡。而IL-1β 的成熟及釋放都受到NLRP3 炎癥小體的嚴(yán)格調(diào)控［19］，而且NLRP3 激活與視網(wǎng)膜細(xì)胞損傷和血管通透性顯著相關(guān)［20］。在本研究中，與空白組視網(wǎng)膜相比，DR 組視網(wǎng)膜中NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-6和Bax/Bcl-2 均上調(diào)；與以往的研究結(jié)果一致，表明NLRP3 炎癥小體在DR 中發(fā)揮重要作用。TXNIP/NLRP3 途徑是DR 治療的潛在治療靶標(biāo)。體外研究發(fā)現(xiàn)維生素D3 可通過抑制ROS/TXNIP/NLRP3 炎癥小體途徑發(fā)揮對視網(wǎng)膜血管損傷和細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用［21］。Ang-1 和VEGF 是促進(jìn)血管生成的重要因子，在視網(wǎng)膜血管通透性中起關(guān)鍵作用［22］。據(jù)報道，TXNIP 增加了糖尿病大鼠視網(wǎng)膜中VEGF 的表達(dá)［23］。高糖誘導(dǎo)活性氧的過量產(chǎn)生，導(dǎo)致TXNIP 從其結(jié)合蛋白Trx 上解離，然后結(jié)合到NLRP3 并引起NLRP3 炎性體的激活［24］。本研究發(fā)現(xiàn)，在DR 大鼠視網(wǎng)膜中NLRP3 的上調(diào)伴隨著TXNIP 的增加，以及Ang-1 和VEGF 的升高；說明TXNIP/NLRP3 與DR 大鼠視網(wǎng)膜血管通透性密切相關(guān)。富氫水可能通過減少TXNIP 的表達(dá)抑制NLRP3 活化，增加Bcl-2 表達(dá)，抑制Caspase-1、IL-1β、Bax 的表達(dá)，并降低Bax/Bcl-2、Ang-1、VEGF 和IL-6 水平；提示富氫水可抑制TXNIP/NLRP3通路的激活。

綜上所述，富氫水可抑制新生血管形成，降低DR 大鼠視網(wǎng)膜血管通透性，減輕視網(wǎng)膜神經(jīng)元損傷；其作用機制可能與抑制TXNIP/NLRP3 通路的激活有關(guān)。而富氫水是通過何種途徑抑制TXNIP/NL?RP3通路的激活有待進(jìn)一步深入研究。