萬全會(huì)，徐曉寧，王劉玉，李剛

作者單位：1南陽市第二人民醫(yī)院骨科，河南 南陽 473000；2鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤科，河南 鄭州 450001

骨肉瘤惡性程度高、侵襲力強(qiáng)、易發(fā)生早期轉(zhuǎn)移，有約30%的病人確診時(shí)已存在肺組織轉(zhuǎn)移［1］，盡管新的輔助治療手段不斷提高，但晚期及發(fā)生轉(zhuǎn)移病人5 年生存率依然較低［2］。盡管目前對(duì)骨肉瘤病因、發(fā)病機(jī)制及診療等方面有所了解，但影響骨肉瘤發(fā)生及進(jìn)展的關(guān)鍵性基因尚不清楚，為該病臨床分子診斷及靶向藥物治療帶來了困難。

長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，Ln?cRNA）作為機(jī)體內(nèi)普遍存在的一種長度>200 nt 的無編碼蛋白功能的RNA，在諸多疾病病理過程中發(fā)揮重要作用［3］，尤其是參與了多種癌種的病程進(jìn)程，參與調(diào)控了癌細(xì)胞增殖、凋亡、轉(zhuǎn)移、侵襲等過程［4］。IncRNA-重編程調(diào)節(jié)器（LncRNA-regulator of repro?gramming，LncRNA-ROR）是一種重要的LncRNA，在細(xì)胞重編程過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用［5］，有研究指出，慢性盆腔炎病人血清中LncRNA-ROR 水平升高［6］。亦有研究指出，LncRNA-ROR 表達(dá)水平與心力衰竭嚴(yán)重程度相關(guān)［7］。近年來研究發(fā)現(xiàn)，其在乳腺癌［8］、前列腺癌［9］、卵巢癌［10］等多種惡性腫瘤組織中表達(dá)異常。但其是否參與了骨肉瘤進(jìn)程，鮮有報(bào)道。本研究分析了LncRNA-ROR 在骨肉瘤組織中表達(dá)情況，比較了不同骨肉瘤臨床病理指標(biāo)該基因表達(dá)差異，探討其對(duì)病人預(yù)后的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取南陽市第二人民醫(yī)院2008 年2 月至2014 年5 月行手術(shù)切除的原發(fā)性骨肉瘤病人，納入標(biāo)準(zhǔn)：①病人入院前未行放化療；②經(jīng)臨床、影像學(xué)及術(shù)后病理學(xué)檢查確診為原發(fā)性骨肉瘤。排除標(biāo)準(zhǔn)：①同時(shí)患有其他惡性腫瘤或者其他良惡性腫瘤繼發(fā)骨肉瘤者；②有代謝性骨病病史，心肝腎等重要臟器嚴(yán)重功能障礙者；③不能完成隨訪或隨訪資料不全者。共納入96 例，男性58 例，女性38 例，年齡范圍7～64 歲，中位年齡21 歲。腫瘤位置：股骨42 例，脛骨19 例，其他35 例。按照En?neking 分期標(biāo)準(zhǔn)：ⅡA 期33 例，ⅡB 期43 例，Ⅲ期20例。組織學(xué)分型：成骨細(xì)胞型45 例，軟骨細(xì)胞型15例，成纖維細(xì)胞型18 例，混合型18 例。同期，留取行手術(shù)治療的非腫瘤病人新鮮正常骨組織45例，中位年齡23 歲，與骨肉瘤病人差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=1.75，P=0.079）。

本研究病人或其近親屬知情同意，本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)赫爾辛基宣言》相關(guān)要求。

1.2 方法

1.2.1采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR術(shù)分析骨肉瘤和正常骨組織中LncRNA-ROR 表達(dá)水平 取液氮中保存的骨肉瘤及正常骨組織，剪碎，冰浴中研磨充分，按Trizol 試劑盒（美國Invitrogen 公司，批號(hào)15596-026）說明對(duì)組織中總RNA進(jìn)行提取，重復(fù)進(jìn)行3次，利用核酸蛋白定量儀（美國Invitrogen 公司，型號(hào)Qubit 3.0）分別對(duì)260 nm 和280 nm 處吸光度OD 值進(jìn)行測定，OD260/OD280 在1.70～2.10 為合格。將總RNA按反轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國Fermentas，批號(hào)K1622）操作說明反轉(zhuǎn)錄成cDNA。按照應(yīng)該定量PCR試劑盒（日本TaKaRa公司，批號(hào)AK5805）說明利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀（美國ABI 公司，型號(hào)StepOnePlus）對(duì)引物（由上海生工生物公司設(shè)計(jì)合成）擴(kuò)增。引物序列：LncRNA-ROR：正 向 5’-GAGGGGACATTTTC?CATCCT-3’，反向5’-TCCAGTGGCTGTGCTAGATG-3’；GAPDH：正 向5’-AATGGACAACTGGTCGTG?GAC-3’，反向5’-CCCTCCAGGGGATCTGTTTG-3’。反應(yīng)條件：95 ℃、3 min，95 ℃、30 s，59 ℃、30 s，74 ℃、30 s，循環(huán)38 次，獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)6 次。用2-ΔΔCt法計(jì)算骨肉瘤和正常骨組織中LncRNA-ROR表達(dá)量。

1.2.2病例隨訪 所有病人均在術(shù)后第1天開始隨訪，對(duì)病人進(jìn)行電話隨訪、門診隨診等，截至2019年5 月31 日，隨訪時(shí)間范圍7～60 個(gè)月，記錄病人生存時(shí)間，獲得病人5年生存率。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法使用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)軟件分析。計(jì)量資料以±s表示，兩組間比較行t檢驗(yàn)，多組間比較行單因素方差分析，生存分析使用Kaplan-Meier法，病人預(yù)后生存時(shí)間影響因素分析采用Cox 回歸模型。P<0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LncRNA-ROR 在骨肉瘤和正常骨組織中表達(dá)水平LncRNA-ROR 在骨肉瘤組織中表達(dá)量為（2.31±0.20），正常骨組織中則為（1.03±0.11），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=39.94，P<0.001）。

2.2 LncRNA-ROR 在不同臨床特征指標(biāo)的骨肉瘤組織中表達(dá)差異LncRNA-ROR在不同年齡、性別、腫瘤位置、腫瘤大小、組織學(xué)分型及是否發(fā)生病理性骨折間的表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），而在不同Enneking 分期、KPS 評(píng)分及是否發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移間的表達(dá)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表1。

表1 LncRNA-ROR在不同臨床特征指標(biāo)的骨肉瘤組織中表達(dá)差異/±s

表1 LncRNA-ROR在不同臨床特征指標(biāo)的骨肉瘤組織中表達(dá)差異/±s

注：LncRNA-ROR為長鏈非編碼-重編程調(diào)節(jié)器，KPS為Karnofsky功能狀態(tài)。

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2.3 LncRNA-ROR 在骨肉瘤組織中表達(dá)水平對(duì)病人5年生存率的影響以LncRNA-ROR 在骨肉瘤組織中表達(dá)量的P25值（2.16）為界值，將病人分為低表達(dá)組（n=26）和高表達(dá)組（n=70），Kaplan-Meier 生存分析結(jié)果顯示，低表達(dá)組病人中位生存時(shí)間51.00個(gè)月，生存時(shí)間（45.42±3.26）個(gè)月，5 年生存率50.00%；高表達(dá)組病人中位生存時(shí)間21.00 個(gè)月，生存時(shí)間（27.31±2.04）個(gè)月，5 年生存率18.57%，Log-Rank檢驗(yàn)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=13.20，P<0.001）。

2.4 影響骨肉瘤病人5 年生存率的多因素分析以臨床指標(biāo)及LncRNA-ROR 表達(dá)量為自變量，以病人生存狀態(tài)為因變量，行Cox 回歸分析，結(jié)果顯示，Enneking 分期、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和LncRNA-ROR 表達(dá)是影響骨肉瘤病人5 年生存率的獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因素（HR=2.15、2.83、2.09，P<0.05），見表2。

表2 影響骨肉瘤病人5年生存率的多因素分析

3 討論

骨肉瘤作為一種惡性腫瘤極高的來源于間葉組織的腫瘤，具有較高的侵襲轉(zhuǎn)移潛力，已成為兒童及青年人群第二大癌癥相關(guān)死亡原因［11］。近年來，隨診技術(shù)進(jìn)步，在治療骨瘤方面新的化療藥物及技術(shù)方案的不斷涌現(xiàn)，在改善病人生命質(zhì)量及降低肺轉(zhuǎn)移率方面發(fā)揮一定作用［12］，但病人總體預(yù)后依然不盡如人意，超過1/3 的病人最終死于該?。?3］。研究表明，骨肉瘤發(fā)生、進(jìn)展是一個(gè)涉及眾多基因及信號(hào)通路累積突變的綜合作用的結(jié)果［14-15］。Ln?cRNA 作為廣泛存在于胞漿及胞核內(nèi)的不具有編碼蛋白功能的RNA 分子，不僅參與了多種疾病的發(fā)生，而且越來越多的研究開始關(guān)注其在癌癥病程中的作用［16-17］。LncRNA-ROR 是一種LncRNA 類型，在誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞形成及維持干細(xì)胞多分化潛能中發(fā)揮重要作用，同時(shí)參與了機(jī)體氧化應(yīng)激過程［5］。研究表明，LncRNA-ROR 高表達(dá)參與了腫瘤惡性增殖及細(xì)胞侵襲過程，并且可促進(jìn)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程［18］。本研究結(jié)果顯示，LncRNA-ROR 在骨肉瘤組織中表達(dá)量高于正常骨組織，說明LncRNA-ROR 在骨肉瘤組織中表達(dá)升高，可能參與了骨肉瘤發(fā)生過程。本研究結(jié)果顯示，LncRNA-ROR 在Enneking 分期ⅡB～Ⅲ期、KPS 評(píng)分<70 及發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的骨肉瘤組織中呈高表達(dá)，說明LncRNA-ROR 表達(dá)量升高可能參與了骨肉瘤惡性進(jìn)展，且與骨肉瘤遠(yuǎn)處侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)，可能是骨肉瘤診療的潛在目標(biāo)靶基因。

Shi 等［19］指出，LncRNA-ROR 促進(jìn)腎癌增殖，且與良好預(yù)后呈負(fù)相關(guān)。Lu等［20］采用薈萃分析的方法評(píng)估lncRNA-ROR 在人類癌癥預(yù)后中的意義，結(jié)果顯示，高lncRNA ROR表達(dá)與較短的總生存期顯著相關(guān)，與癌癥預(yù)后較差有關(guān)，可以作為各種癌癥中不利的預(yù)后因素。本研究結(jié)果顯示，低表達(dá)組病人中位生存時(shí)間、平均生存時(shí)間和5 年生存率50.00%均高于高表達(dá)組，說明LncRNA-ROR 表達(dá)與骨肉瘤病人預(yù)后有關(guān)，高表達(dá)預(yù)示病人預(yù)后不良。Cox回歸分析顯示，Enneking分期、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和LncRNA-ROR表達(dá)是影響骨肉瘤病人5年生存率的獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因素，進(jìn)一步說明LncRNA-ROR高表達(dá)是骨肉瘤病人不良預(yù)后的獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因素，可作為評(píng)估病人預(yù)后的指標(biāo)。

綜上所述，LncRNA-ROR 在骨肉瘤組織中呈高表達(dá)，參與了骨肉瘤發(fā)生及惡性化進(jìn)展，且與不良預(yù)后有關(guān)，是病人生存時(shí)間的獨(dú)立影響因素，有望為骨肉瘤早期診斷及靶向治療提供新的基因靶位，但LncRNA-ROR 可能的作用機(jī)制，尚待進(jìn)一步利用分子生物學(xué)技術(shù)予以研究明確。