李國(guó)東，梁博，何明璇，崔昭，劉亞維

作者單位：1保定市第一中心醫(yī)院消化三科，河北 保定 071000；2保定市第二醫(yī)院消化內(nèi)科，河北 保定 071000；3河北大學(xué)附屬醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科，河北 保定 071030

炎癥性腸病是臨床常見(jiàn)的一種消化系統(tǒng)疾病，主要病理類(lèi)型為克羅恩病與潰瘍性結(jié)腸炎。近年來(lái)，炎癥性腸病發(fā)病率逐年上升，目前關(guān)于其發(fā)病機(jī)制尚未闡明，其主要臨床表現(xiàn)為腹痛、腹瀉等，研究表明炎癥反應(yīng)、腸道菌群變化在炎癥性腸病發(fā)生及發(fā)展中發(fā)揮重要作用，同時(shí)微小RNA（miRNA）表達(dá)異常并可參與炎癥性腸病發(fā)生及發(fā)展過(guò)程［1-4］。微小RNA-377（miR-377）在高糖誘導(dǎo)的人腎小球系膜細(xì)胞中表達(dá)水平升高，敲低其表達(dá)可抑制細(xì)胞增殖及炎癥反應(yīng)［5］。微小RNA-31（miR-31）在炎癥性腸病中表達(dá)水平升高，但關(guān)于其具體作用機(jī)制尚未闡明［6］。因此，本研究主要探討miR-377、miR-31在炎癥性腸病血清中的表達(dá)及其與炎癥反應(yīng)、腸道菌群的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2016 年5 月至2019 年6 月保定市第一中心醫(yī)院收治的110例炎癥性腸病病人為研究組，所有病人均符合炎癥性腸病診斷標(biāo)準(zhǔn)，其中潰瘍性結(jié)腸炎75例，克羅恩病35例［7］。其中活動(dòng)期69 例，男42 例，女27 例，年齡（42.36±7.52）歲，范圍為32～60 歲；緩解期41 例，男23 例，女18 例，年齡（41.58±8.36）歲，范圍為31～62 歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：嚴(yán)重心腦血管疾病病人；合并自身免疫性疾病病人；合并其他炎性疾病病人。同時(shí)選取同院體檢的健康志愿者60 例為對(duì)照組，其中男40 例，女20 例，年齡（45.32±9.67）歲，范圍為35～67歲。各組研究對(duì)象年齡、性別比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。病人或其近親屬知情同意，本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)赫爾辛基宣言》相關(guān)要求。

1.2 方法

1.2.1標(biāo)本采集 所有研究對(duì)象于早晨空腹時(shí)分別采集外周靜脈血5 mL，置于促凝管內(nèi)保存，4 ℃條件下經(jīng)3 500 r/min 離心10 min，吸取上清，置于-40 ℃冰箱內(nèi)保存。

1.2.2實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）檢測(cè)miR-377、miR-31 的表達(dá)水平 采用Trizol 法（美國(guó)Invitrogen 公司）提取血清總RNA，應(yīng)用Nano?drop2000c超微量分光光度計(jì)檢測(cè)RNA濃度與純度，RNA OD260/OD280處于1.8～2.0。miR-377正向引物5’-ATCACACAAAGGCAAC-3’，反 向 引 物5’-GTG?CAGGGTCCGAGGT-3’；miR-31 正 向 引 物5’-GGCATAGCTGTTGAACTGGG-3’，反 向 引 物5’-CGATCGTCAGCATCACTAGC-3’；U6 正向引物5’-GCTTCGGCAGCACATATACT-3’，反向引物5’-GTG?CAGGGTCCGA GGTATTC-3’，引物由上海生工生物工程股份有限公司設(shè)計(jì)合成。反轉(zhuǎn)錄體系：5×gDNA Buffer 2μL，10×King RT Buffer 2μL，F(xiàn)astKing RT En?zyme Mix 1μL，F(xiàn)Q-RT Primer Mix 2μL，RNA（2μg），RNase-Free 雙蒸水補(bǔ)足體系至20 μL；反應(yīng)條件：42 ℃15 min，95 ℃3 min。反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，以cD?NA 為模板進(jìn)行qRT-PCR 擴(kuò)增，反應(yīng)體系：10×PCR Buffer 2.5μL，MgSO42.5μL，dNTPs 2.5μL，正反向引物各0.5 μL，cDNA 2 μL，RNase-Free 雙蒸水補(bǔ)足體系至25 μL；反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性60 s，95 ℃變性60 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共36 次循環(huán)。miR-377、miR-31以U6為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算miR-377、miR-31相對(duì)表達(dá)量。反轉(zhuǎn)錄與熒光定量檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京天根生化科技有限公司。

1.2.3檢測(cè)炎性因子IL-34、CRP、PCT 的水平 采用ELISA 法檢測(cè)血清白細(xì)胞介素-34（IL-34）、C 反應(yīng)蛋白（CRP）的水平，檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海鈺博生物科技有限公司，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。采用電化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)血清降鈣素原（PCT）的水平，應(yīng)用羅氏全自動(dòng)免疫分析儀601進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)試劑盒購(gòu)自深圳市長(zhǎng)征生物科技有限公司。

1.2.4檢測(cè)腸道菌群 取病人新鮮糞便0.5 g，稀釋?zhuān)?0 μL 進(jìn)行檢測(cè)腸道菌群，主要包括腸球菌（EC）、酵母菌（SB）、雙歧桿菌（BL）、消化球菌（PS）、小梭菌（CD）、腸桿菌（EMB）、葡萄球菌（SP）、擬桿菌（BD）、乳桿菌（LC）、真桿菌（ES），采用瓊脂糖培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，其中厭氧菌為：BL、PS、BD、ES、CD、LC；需氧菌：EC、SB、EMB、SP。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 21.0 進(jìn)行分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以xˉ±s表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；采用Pearson 法分析miR-377、miR-31 表達(dá)量與IL-34、CRP、PCT 水平的相關(guān)性，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 炎癥性腸病病人血清中miR-377、miR-31的表達(dá)水平與對(duì)照組（0.96±0.16、0.97±0.24）比較，研究組血清中miR-377、miR-31 的表達(dá)水平（2.23±0.50、2.39±0.41）顯著升高（t=19.13、24.61，均P<0.001）。

2.2 活動(dòng)期與緩解期病人血清中miR-377、miR-31的表達(dá)水平與緩解期（1.70±0.26、2.02±0.19）比較，活動(dòng)期病人血清中miR-377、miR-31 的表達(dá)水平（2.54±0.30、2.61±0.34）顯著升高（t=14.90、10.19，均P<0.001）。

2.3 炎癥性腸病病人血清IL-34、CRP、PCT 水平與對(duì)照組比較，研究組血清IL-34、CRP、PCT 水平顯著升高（P<0.05），見(jiàn)表1。

表1 炎癥性腸病病人血清IL-34、CRP、PCT水平/±s

表1 炎癥性腸病病人血清IL-34、CRP、PCT水平/±s

注：IL-34 為血清白細(xì)胞介素-34，CRP 為C 反應(yīng)蛋白，PCT 為血清降鈣素原。

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2.4 miR-377、miR-31 表達(dá)量與IL-34、CRP、PCT水平的相關(guān)性分析采用Pearson 法分析miR-377、miR-31表達(dá)量與IL-34、CRP、PCT水平的相關(guān)性，miR-377 與IL-34 呈正相關(guān)（r=0.99，P<0.001），miR-377 與CRP 呈正相關(guān)（r=0.50，P<0.001），miR-377 與PCT 呈正相關(guān)（r=0.86，P<0.001）；miR-31 與IL-34 呈正相關(guān)（r=0.95，P<0.001），miR-31與CRP呈正相關(guān)（r=0.64，P<0.001），miR-31 與PCT 呈 正 相 關(guān)（r=0.85，P<0.001）。

2.5 miR-377、miR-31 表達(dá)量與腸道菌群數(shù)量的相關(guān)性根據(jù)表達(dá)量平均值將病人分為miR-377低表達(dá)組53 例、miR-377 高表達(dá)組57 例、miR-31 低表達(dá)組57 例、miR-31 高表達(dá)組53 例，比較分析miR-377、miR-31 表達(dá)量與腸道菌群數(shù)量的相關(guān)性，結(jié)果顯示與miR-377 低表達(dá)組比較，miR-377 高表達(dá)組SB、BL、LC、EC、BD、PS、SC 的數(shù)量明顯升高（P<0.05），ES的數(shù)量明顯降低（P<0.05）；與miR-31低表達(dá)組比較，miR-31 高表達(dá)組SB、BL、LC、EC、BD、PS、SC 的數(shù)量明顯升高（P<0.05），ES 的數(shù)量明顯降低（P<0.05），見(jiàn)表2。

表2 miR-377、miR-31表達(dá)量與腸道菌群數(shù)量的相關(guān)性/［LgN（CFU/g），±s］

表2 miR-377、miR-31表達(dá)量與腸道菌群數(shù)量的相關(guān)性/［LgN（CFU/g），±s］

注：EC為腸球菌，SB為酵母菌，BL為雙歧桿菌，PS為消化球菌，CD為小梭菌，EMB為腸桿菌，SP為葡萄球菌，BD為擬桿菌，LC為乳桿菌，ES為真桿菌。

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3 討論

炎癥性腸病臨床表現(xiàn)呈多樣化且缺乏特異性，需結(jié)合臨床表現(xiàn)、內(nèi)鏡、血清學(xué)指標(biāo)等檢查結(jié)果進(jìn)行判斷，但易造成誤診或漏診，因而尋找新指標(biāo)更準(zhǔn)確判斷炎癥性腸病的炎癥活動(dòng)性具有重要意義［8-11］。

本研究結(jié)果顯示炎癥性腸病病人血清中miR-377 表達(dá)水平顯著升高，且活動(dòng)期病人血清中miR-377的表達(dá)水平高于緩解期。miR-377在炎癥性疾病中表達(dá)水平升高，并可參與其發(fā)生及發(fā)展過(guò)程［12］。miR-377 可參與大鼠腦缺血損傷后的炎癥和血管生成過(guò)程［13］。下調(diào)miR-377 通過(guò)上調(diào)靶基因SIRT1 表達(dá)而抑制缺氧誘導(dǎo)的人視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞血管生成及炎癥［14］。提示miR-377 在炎癥性腸病發(fā)生及發(fā)展過(guò)程中可能發(fā)揮重要調(diào)控作用。IL-34屬于新型細(xì)胞因子，其可參與機(jī)體多種免疫及炎癥性疾病發(fā)生過(guò)程，IL-34與炎癥性腸病活動(dòng)指標(biāo)CRP的水平呈正相關(guān)，并可參與炎癥性腸病發(fā)生及發(fā)展過(guò)程［15］。PCT是由多種氨基酸構(gòu)成的一種降鈣素前體，可作為敗血癥及細(xì)菌感染的特異性指標(biāo)，并可反映全身系統(tǒng)炎性反應(yīng)［16］。本研究結(jié)果顯示炎癥性腸病病人血清IL-34、CRP、PCT 水平顯著升高，與上述研究結(jié)果相似。同時(shí)本研究進(jìn)一步分析顯示miR-377與IL-34、CRP、PCT 呈正相關(guān)，提示miR-377 可能通過(guò)提高IL-34、CRP、PCT水平從而促進(jìn)炎癥反應(yīng)的發(fā)生。

本研究結(jié)果顯示炎癥性腸病病人血清miR-31的表達(dá)水平升高，且活動(dòng)期顯著高于緩解期。miR-31 在類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎病人外周血單核細(xì)胞中的表達(dá)水平升高，并可能作為評(píng)估類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎疾病活動(dòng)程度的生物標(biāo)記物［17］。下調(diào)miR-31 表達(dá)可抑制結(jié)腸炎發(fā)展進(jìn)程［18］。miR-31 在結(jié)腸炎中表達(dá)水平升高并可促進(jìn)炎癥反應(yīng)的發(fā)生［19］。與上述研究結(jié)果相似，進(jìn)一步分析顯示miR-31與IL-34、CRP、PCT 呈正相關(guān)，提示miR-31可能促進(jìn)炎癥反應(yīng)的發(fā)生從而誘發(fā)炎癥性腸病。腸道菌群失衡是導(dǎo)致炎癥性腸病發(fā)病的重要原因之一，腸道菌群失衡還可促進(jìn)炎癥反應(yīng)的發(fā)生。根據(jù)表達(dá)量平均值將病人分為miR-377 低表達(dá)組53 例、miR-377 高 表達(dá)組57 例、miR-31低表達(dá)組57例、miR-31高表達(dá)組53例，比較分析miR-377、miR-31 表達(dá)量與腸道菌群數(shù)量的相關(guān)性，結(jié)果顯示隨著miR-377、miR-31 表達(dá)水平的升高SB、BL、LC、EC、BD、PS、SC 的數(shù)量明顯升高，而ES 的數(shù)量明顯降低。分析原因可能為菌群數(shù)量改變或比例失調(diào)可導(dǎo)致腸道黏膜功能障礙，其中腸道上皮細(xì)胞無(wú)法感應(yīng)菌群并給出錯(cuò)誤反應(yīng)從而造成腸道內(nèi)免疫應(yīng)答功能紊亂，一般情況下真桿菌與白細(xì)胞數(shù)等呈負(fù)相關(guān)，炎癥程度越高則酵母菌數(shù)目、腸球均屬數(shù)目越高，即不同菌數(shù)目失調(diào)與炎癥性腸病病人炎癥反應(yīng)程度密切相關(guān)，本研究結(jié)果說(shuō)明miR-377、miR-31 表達(dá)水平升高可提高SB、BL、LC、EC、BD、PS、SC的數(shù)量，其中SB、EC數(shù)量增多可引起炎癥性反應(yīng)，還可增加代謝產(chǎn)物及毒素從而損害腸道黏膜繼而促進(jìn)腸道炎癥的發(fā)生。提示miR-377、miR-31 可能通過(guò)調(diào)控腸道菌群而影響IL-34、CRP、PCT水平從而引發(fā)炎癥性腸病。

綜上所述，miR-377、miR-31 在炎癥性腸病血清中的表達(dá)水平升高，二者均與炎性反應(yīng)及腸道菌群密切相關(guān)，但關(guān)于其具體作用機(jī)制仍需進(jìn)一步探究。