李宇興，王海嬌，薛思明，范亞軍

(長(zhǎng)春師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130032)

多胺是小分子聚陽(yáng)離子天然化合物，存在于除一些古生代以外的所有生物體中[1]，其正電荷與碳骨架相連，可以與生物多陰離子(主要是核酸)產(chǎn)生相互作用[2]。在植物中，腐胺、亞精胺和精胺不僅參與細(xì)胞的增殖、分化和程序性死亡等基本細(xì)胞過(guò)程，而且還參與對(duì)環(huán)境脅迫的適應(yīng)性反應(yīng)[3]。細(xì)菌主要只合成兩種多胺，腐胺和亞精胺[4]。對(duì)細(xì)菌中多胺功能的研究表明，多胺參與了許多生長(zhǎng)以外的功能，包括結(jié)合到細(xì)胞壁和鐵載體的生物合成。它們?cè)谀退嵝苑矫嬉埠苤匾?，可以起到自由基離子清除劑的作用[5]。已有研究表明，多胺(PA)代謝與一些與應(yīng)激相關(guān)的關(guān)鍵信號(hào)分子的形成有關(guān)的代謝途徑是相互聯(lián)系的。例如，PA的生物合成需要前體，這些前體也用于合成其他重要的應(yīng)激相關(guān)代謝物，如S-腺苷蛋氨酸(SAM，參與乙烯代謝)、鳥(niǎo)氨酸(參與合成脯氨酸)和精氨酸(一氧化氮的前體)[6-8]。幾乎所有的真核生物都是在鳥(niǎo)氨酸脫羧酶(ODC)的催化下直接從鳥(niǎo)氨酸合成腐胺(Put)的。然而，植物還有另一條合成Put的途徑，該途徑是由精氨酸脫羧酶(ADC)作用，然后在胍丁胺亞氨基水解酶(AIH)和N-氨基甲酰-Put酰胺水解酶(CPA)的催化下連續(xù)兩步合成Put[9]。

在許多生物體中，PA還在基本的細(xì)胞過(guò)程中發(fā)揮調(diào)節(jié)分子的作用，包括細(xì)胞分裂、分化、基因表達(dá)、DNA和蛋白質(zhì)合成以及細(xì)胞凋亡[10-12]。近年來(lái)大量研究表明外源多胺能夠增加植物抗逆性，保護(hù)植物免受不同類(lèi)型非生物脅迫的傷害[13]。在植物中，PA參與了器官發(fā)生、胚胎發(fā)生、花的起始和發(fā)育、葉片衰老、花粉管生長(zhǎng)、果實(shí)發(fā)育和成熟、對(duì)非生物和生物脅迫的響應(yīng)等生理過(guò)程[14-23]。高等植物中最常見(jiàn)的PA有二胺腐胺、三胺亞精胺和四胺精胺[24]，可能以游離形式存在，在這種形式下，它們與小分子(如酚類(lèi)化合物)共價(jià)結(jié)合，或者以不溶性結(jié)合形式存在，以不溶性結(jié)合形式存在的多胺與核酸和蛋白質(zhì)等大分子共價(jià)結(jié)合[25]。大量研究表明，游離多胺(主要是腐胺、亞精胺、精胺及其異構(gòu)體熱敏胺)以及多胺氧化產(chǎn)物(過(guò)氧化氫和γ-氨基丁酸)在植物發(fā)育的不同過(guò)程中都是必需的，并參與非生物和生物脅迫反應(yīng)[26]。

在前期從吉林省西部草原地區(qū)羊草根際分離出產(chǎn)多胺菌DJ，利用16S rDNA法對(duì)其菌種進(jìn)行鑒定，鑒定結(jié)果為陰溝腸桿菌(Enterobactercloacae)。本實(shí)驗(yàn)旨在對(duì) DJ菌在鹽堿條件下適應(yīng)性進(jìn)行初步研究，進(jìn)而為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)及推廣植物促生菌的應(yīng)用提供理論及實(shí)踐基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)菌株為羊草根際土壤菌DJ，前期已進(jìn)行篩選和保存。

實(shí)驗(yàn)試劑為ADF培養(yǎng)基1 L：KH2PO44 g，Na2HPO46 g, MgSO4·7H2O 0.2 g，葡萄糖2 g，葡萄糖酸2 g, 檸檬酸2 g，精氨酸/鳥(niǎo)氨酸 2 g，調(diào)節(jié)pH值至7，定容至1 L，121℃條件下高溫滅菌30 min備用。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 DJ菌在不同底物培養(yǎng)基中生長(zhǎng)狀況分析

分別配制pH值為7以精氨酸和鳥(niǎo)氨酸為底物的培養(yǎng)基，1∶100接種等量DJ菌(每組重復(fù)3 次)，搖床培養(yǎng)2、4、8、12、24 h，在波長(zhǎng)600 nm處測(cè)量DJ菌在不同時(shí)間段吸光度(OD值)變化并分析結(jié)果。

1.2.2 DJ菌最適生長(zhǎng)條件的研究

分別配制pH值為4、5、7、8、9的ADF培養(yǎng)基，1∶100接種等量DJ菌(每個(gè)梯度重復(fù)3 次)，搖床培養(yǎng)2、4、8、12、24 h，在波長(zhǎng)600 nm處測(cè)量DJ菌在不同時(shí)間段OD值變化，并對(duì)其生長(zhǎng)狀況進(jìn)行分析。

1.2.3 DJ菌在鹽堿條件下生長(zhǎng)狀況分析

在ADF培養(yǎng)基中加入30 mmol/L NaCl并調(diào)節(jié)pH值至9,模擬鹽堿環(huán)境，以pH值7為對(duì)照組，配制ADF半固體培養(yǎng)基，瓊脂濃度為0.28%，在平板中心接入0.5 μL DJ菌液(每組重復(fù)3 次),在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，觀察并測(cè)量菌圈大小。

2 結(jié)果與分析

2.1 DJ菌在不同底物培養(yǎng)基中生長(zhǎng)狀況分析

多胺在生物體內(nèi)的合成主要以精氨酸或鳥(niǎo)氨酸為底物，分別以這兩種底物培養(yǎng)基對(duì)DJ菌進(jìn)行培養(yǎng)，并檢測(cè)了在不同時(shí)間段DJ菌的生長(zhǎng)狀況，結(jié)果如圖1所示，DJ菌在以精氨酸為底物的培養(yǎng)基中生物量更高，生長(zhǎng)狀況更好(*表示P<0.05,**表示P<0.01)，所以在后續(xù)研究中選用以精氨酸為底物的培養(yǎng)基對(duì)其進(jìn)行培養(yǎng)。

圖1 在不同底物培養(yǎng)基中DJ菌的生長(zhǎng)狀況

2.2 DJ菌在不同pH條件下生長(zhǎng)狀況分析

為了確定DJ菌的最適生長(zhǎng)pH條件,配制不同pH值A(chǔ)DF培養(yǎng)基，在不同pH值條件下對(duì)DJ菌進(jìn)行培養(yǎng)，測(cè)量其不同時(shí)間段OD值變化，結(jié)果如圖2所示，DJ菌在中性偏堿的條件下生長(zhǎng)狀況更好，說(shuō)明其最適生長(zhǎng)條件為中性偏堿環(huán)境。

圖2 不同pH 值對(duì)DJ菌生物量的影響

2.3 DJ菌在鹽堿條件下生長(zhǎng)狀況分析

為進(jìn)一步分析DJ菌在鹽堿條件下的適應(yīng)情況，在培養(yǎng)基中加入30 mmol/L NaCl并調(diào)節(jié)pH值至9，模擬鹽堿條件，以pH值7為對(duì)照組，培養(yǎng)24 h后觀察，結(jié)果如圖3所示，模擬鹽堿組菌圈直徑大小與對(duì)照組相比有顯著差異(**表示P<0.01)，在模擬鹽堿組平板中DJ菌菌圈明顯大于對(duì)照組，說(shuō)明DJ菌在鹽堿條件下趨動(dòng)性更強(qiáng)，比較適應(yīng)在鹽堿環(huán)境中生長(zhǎng)。

圖3 半固體流動(dòng)平板實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)果與討論

土地鹽堿化會(huì)導(dǎo)致大面積土地荒漠化及土地資源流失，致使生態(tài)失衡，是當(dāng)前農(nóng)業(yè)發(fā)展面臨的主要問(wèn)題[27]。目前植物根際微生物引起越來(lái)越多的重視，植物根際微生物可以改善土壤結(jié)構(gòu)，增加土壤營(yíng)養(yǎng)，有些促生菌類(lèi)能夠增加植物非生物脅迫下的抗性，調(diào)節(jié)植物的生長(zhǎng)發(fā)育，促進(jìn)植物生長(zhǎng)。近年來(lái)從土壤中分離出多株具有降解農(nóng)藥等環(huán)境污染物、增加植物抗性促進(jìn)植物生長(zhǎng)作用的陰溝腸桿菌菌株，研究表明，不同植物結(jié)合使用陰溝腸桿菌后能加速對(duì)土壤中污染物的降解[28-31]。另外，在鹽脅迫條件下陰溝腸桿菌能夠調(diào)節(jié)自身基因表達(dá)，合成對(duì)植物有益的多肽或激素類(lèi)物質(zhì)，提高作物抗氧化能力及作物產(chǎn)量。本研究中對(duì)前期分離產(chǎn)多胺陰溝腸桿菌DJ在不同pH值條件下進(jìn)行培養(yǎng)，結(jié)果表明其在中性偏堿條件下生長(zhǎng)較好，由于多胺的合成主要以精氨酸或鳥(niǎo)氨酸為底物，我們測(cè)試了這兩種底物培養(yǎng)基中DJ菌生長(zhǎng)狀況，結(jié)果表明，DJ菌在以精氨酸為底物的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)狀況更好，之后利用半固體流動(dòng)平板模擬鹽堿環(huán)境對(duì)其進(jìn)行培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)其在鹽堿環(huán)境中DJ菌菌圈明顯大于對(duì)照組，說(shuō)明DJ菌在鹽堿條件下趨動(dòng)性更強(qiáng)，有更好的適應(yīng)性。但其鹽堿條件下的適應(yīng)機(jī)制目前尚不明確，需要后續(xù)進(jìn)行進(jìn)一步的深入研究。