譚慧萍， 王惠國， 王林會， 趙增彤， 程楊好， 劉晨光， 王 亮*， 李 倩*

1.大連大學生命科學與技術(shù)學院，遼寧大連 116622；

2.大連賽姆生物工程技術(shù)有限公司，遼寧大連 116620；

3.大連工業(yè)大學生物工程學院，遼寧大連 116034；

4.微生物代謝國家重點實驗室上海交通大學生命科學與技術(shù)學院，上海 200240

上世紀末，學術(shù)界相繼提出了高濃度（High gravity，HG）和超高濃度（Very high gravity，VHG）發(fā)酵的概念，并成功將其應(yīng)用到乙醇發(fā)酵中，使發(fā)酵終點乙醇濃度從6%～8%（v／v）提高到10%～21%（v／v）［1，2］。VHG乙醇發(fā)酵技術(shù)不僅能夠降低下游精餾分離和廢水處理成本，而且不需要增加額外的設(shè)備投入，是降低燃料乙醇生產(chǎn)成本的有效方案［3，4］：（1）燃料乙醇生產(chǎn)成本中，能耗成本居第二，僅次于原料成本；（2）市場上存在多種廉價高效的酶制劑，如α-淀粉酶、糖化酶和蛋白酶等，這使得超高濃度底物易獲得。

周期性的振蕩行為在微生物細胞連續(xù)培養(yǎng)和發(fā)酵過程中時常發(fā)生，如Saccharomyces cerevisiae［5，6］、Zymomonas mobilis［7］、Escherichia coli［8］和Clostridium butyricum［9］等培養(yǎng)過程都曾觀察到這一現(xiàn)象。對于釀酒酵母S．cerevisiae低糖連續(xù)培養(yǎng)過程中的振蕩行為已經(jīng)研究得較為透徹，主要分為糖酵解振蕩和代謝振蕩行為，其振蕩參數(shù)包括葡萄糖-6-磷酸、果糖-6-磷酸、ATP、NADPH等胞內(nèi)代謝物濃度，以及溶氧濃度（DO）、耗氧速率、二氧化碳釋放率等發(fā)酵參數(shù)，振蕩周期在幾分鐘到幾小時之間。然而，BAI等在釀酒酵母VHG乙醇連續(xù)發(fā)酵體系中報道了另一種振蕩行為（VHG振蕩）［3，10-11］，明顯不同于糖酵解振蕩和代謝振蕩，這種振蕩行為的振幅更大（可達50%）、周期更長（5 d～7 d），振蕩的特征參數(shù)包括殘?zhí)?、乙醇和生物量濃度等。隨后，BAI等在研究稀釋速率（0.015 h-1～0.08 h-1）對VHG乙醇連續(xù)發(fā)酵影響時，發(fā)現(xiàn)改變稀釋速率可以獲得振蕩和穩(wěn)態(tài)兩種不同發(fā)酵狀態(tài)［12］，并提出VHG振蕩行為的產(chǎn)生與操作條件和系統(tǒng)的初始狀態(tài)有關(guān)。

雖然后續(xù)研究顯示，木塊固定化細胞［10，13］和發(fā)酵偶聯(lián)氣提實時移除部分乙醇［14，15］可以有效弱化VHG振蕩行為，然而，除稀釋速率外，缺乏對VHG振蕩行為直接誘發(fā)因素的研究。本研究基于前期研究基礎(chǔ)，研究菌種、培養(yǎng)基成分、氧供應(yīng)等對VHG振蕩行為的影響，進一步探究了比生長速率、比死亡速率、稀釋速率和細胞乙醇耐受性對釀酒酵母VHG乙醇連續(xù)發(fā)酵的調(diào)控作用。

1 實驗材料和方法

1.1 菌種

實驗室釀酒酵母S．cerevisiae S288c和工業(yè)釀酒酵母S．cerevisiae 4126均由本實驗室保藏；自絮凝酵母S．cerevisiae BHL01，由工業(yè)釀酒酵母S．cerevisiae 4126經(jīng)染色體整合絮凝基因FLOI得到［16］，由本實驗室保藏。

1.2 培養(yǎng)基

搖瓶種子培養(yǎng)基（g／L）：葡萄糖30，酵母粉5，蛋白胨3，121℃滅菌15 min。

發(fā)酵罐種子培養(yǎng)基（g／L）：葡萄糖120，酵母粉5，蛋白胨3，121℃滅菌15 min。

YPD發(fā)酵培養(yǎng)基（g／L）：葡萄糖280，酵母粉5，蛋白胨3。為減少在高溫滅菌過程中的糖損失，發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌條件為110℃，15 min，滅菌完成后立即用自來水冷卻至室溫。

合成培養(yǎng)基：氮磷鎂成分（g／L）（NH4）2SO45，KH2PO43，MgSO4·7 H2O 0.5，121℃滅菌15 min。微量鹽成分（mg／L）EDTA 15，ZnSO4·7 H2O 4.5，CoCl2·6 H2O 0.3，MnCl2·4H2O 1，CuSO4·7 H2O 0.3，CaCl2·2 H2O 4.5，F(xiàn)eSO4·7 H2O 3，NaMoO4·2 H2O 0.4，H3BO31，KI 0.1，121℃滅菌15 min。維生素成分（mg／L）生物素0.05，泛酸鈣1.0，煙酸1.0，肌醇25.0，維生素B11.0，維生素B61.0，對氨基苯甲酸0.2，0.45μm膜濾除菌。厭氧發(fā)酵過程培養(yǎng)基中添加15μL麥角固醇和660μg／L Tween-80，為酵母細胞膜合成提供前體，115℃滅菌15 min。各組分配制成高濃度母液，并單獨進行滅菌，4℃避光保存，使用前配制成所需終濃度，添加到葡萄糖溶液中。

1.3 種子培養(yǎng)及乙醇連續(xù)發(fā)酵

搖瓶種子培養(yǎng)：從4℃冰箱中取菌種保存試管，接種到170 mL種子培養(yǎng)基中進行活化，在30℃，150 r／min條件下培養(yǎng)20 h。將活化后種子轉(zhuǎn)接到新鮮的種子培養(yǎng)基中，30℃，150 r／min培養(yǎng)18 h。

發(fā)酵罐批次種子培養(yǎng)：搖瓶種子以10%（v／v）的接種量接入裝液量為1.7 L的攪拌式發(fā)酵罐（KBT-2.5 L，韓國）中進行培養(yǎng)，通過流加2 mol／L NaOH控制pH在（4.50±0.02），通氣速率、溫度、攪拌速率分別設(shè)定為0.05 vvm、30℃、300 r／min。

連續(xù)乙醇發(fā)酵：連續(xù)攪拌反應(yīng)裝置如圖1所示，當培養(yǎng)基中的殘?zhí)菨舛鹊陀? g／L，分批種子培養(yǎng)結(jié)束，開啟蠕動泵3以0.027 h-1的稀釋速率向發(fā)酵罐4中流加發(fā)酵培養(yǎng)基，同時打開發(fā)酵罐的溢流口，通過溢流口控制有效發(fā)酵體積為1.7 L，溫度、pH、通氣、攪拌速率等操作條件與發(fā)酵罐種子培養(yǎng)時相同。

圖1 乙醇連續(xù)發(fā)酵系統(tǒng)示意圖

1.4 分析方法

1.4.1 生物量測定

選用細胞干重法進行測定［3］。

1.4.2 葡萄糖、乙醇和甘油的測定

選用Waters高效液相色譜測定，選用色譜柱（Aminex HPX287H，300 mm×7.8 mm）；檢測器選用Waters410示差檢測器；流動相用5 mmol／L的H2SO4；流速設(shè)為0.5 mL／min，柱溫設(shè)為50℃。

1.4.3 酵母乙醇耐受性實驗［17］

將斜面菌種進行搖瓶活化后，用生理鹽水（0.9%NaCl，w／v）配制成相同OD600的菌懸液，分別用12%和16%（v／v）的乙醇溶液沖擊2 h，涂平板，30℃培養(yǎng)24 h后，計細胞菌落數(shù)，與0 h的對照菌落數(shù)對比計算存活率。

2 實驗結(jié)果與討論

2.1 菌株差異對VHG乙醇連續(xù)發(fā)酵的影響

2.1.1 酵母菌株的乙醇耐性比較

本實驗選取三株釀酒酵母S．cerevisiae 4126、S．cerevisiae S288c和S．cerevisiae BHL01，分別進行了乙醇沖擊實驗，比較其乙醇耐受性，結(jié)果如圖2所示。經(jīng)12%（v／v）乙醇沖擊2 h后，酵母細胞S．cerevisiae 4126和S．cerevisiae BHL01的存活率分別為81.5%和88.1%，而S．cerevisiae S288c只有66.1%；經(jīng)16%（v／v）乙醇沖擊2 h后，只有S．cerevisiae BHL01的存活率能夠維持在43.3%，而S．cerevisiae 4126和S．cerevisiae S288c的存活率則分別降至27.2%和16.3%?？梢姡@三株酵母菌株的乙醇耐性由高到低依次為S．cerevisiae BHL01、S．cerevisiae 4126及S．cerevisiae S288c。

圖2 酵母菌株的乙醇耐受性比較

2.1.2 不同乙醇耐性菌株的VHG乙醇連續(xù)發(fā)酵

S．cerevisiae 4126、S．cerevisiae S288c和S．cerevisiae BHL01三株乙醇耐性不同的酵母菌的VHG乙醇連續(xù)發(fā)酵參數(shù)（殘?zhí)恰⒁掖?、甘油和生物量濃度等）如圖3所示，發(fā)現(xiàn)S．cerevisiae 4126及S．cerevisiae BHL01連續(xù)發(fā)酵體系中發(fā)酵參數(shù)均呈現(xiàn)周期性振蕩行為（圖3a、3b），而類似振蕩行為未在S．cerevisiae S288c連續(xù)發(fā)酵體系中觀察到，隨發(fā)酵時間延長S．cerevisiae S288c體系逐漸發(fā)展成高底物濃度（136.4 g／L～149.8 g／L）、低產(chǎn)物濃度（46.5 g／L～56.8 g／L）的擬穩(wěn)態(tài)狀態(tài)（圖3c），表明VHG振蕩行為的產(chǎn)生與菌種有關(guān)。

圖3 三株不同乙醇耐受性酵母菌的VHG乙醇連續(xù)發(fā)酵

如表1所示，S．cerevisiae BHL01、S．cerevisiae 4126和S．cerevisiae S288c VHG連續(xù)發(fā)酵體系的最大乙醇濃度分別為88.4 g／L、71.3 g／L和56.8 g／L，可見S．cerevisiae BHL01和S．cerevisiae 4126的乙醇生產(chǎn)能力要強于S．cerevisiae S288c，這與其乙醇耐受性數(shù)據(jù)一致。另外，三株酵母菌的VHG體系中乙醇濃度變化幅度也是S．cerevisiae BHL01最大（31.6 g／L）、S．cerevisiae 4126其次（20.0 g／L）、S．cerevisiae S288c最?。?.2 g／L），同樣其乙醇生成速率也具有這樣的大小關(guān)系。高乙醇生成速率會造成胞內(nèi)乙醇積累，胞內(nèi)的高濃度乙醇會嚴重損傷和破壞細胞器和酶，導(dǎo)致細胞活力下降甚至死亡［18］。以發(fā)酵參數(shù)的振幅而言，S．cerevisiae BHL01發(fā)酵體系的參數(shù)波動要明顯強于S．cerevisiae 4126體系，而S．cerevisiae 4126體系要強于S．cerevisiae S288c體系，這種強弱關(guān)系與三株酵母菌的乙醇耐受性強弱一致，表明VHG振蕩的強弱可能與酵母細胞的乙醇耐受性有關(guān)。

表1 三株酵母菌的VHG乙醇連續(xù)發(fā)酵參數(shù)

S．cerevisiae BHL01、S．cerevisiae 4126和S．cerevisiae S288c VHG發(fā)酵體系的參數(shù)變化顯示，S．cerevisiae BHL01和S．cerevisiae 4126體系的乙醇濃度都超過了其最大乙醇耐受濃度，發(fā)酵體系中的高濃度乙醇對細胞的生長和代謝產(chǎn)生了抑制作用；而S．cerevisiae S288c的乙醇發(fā)酵生產(chǎn)能力弱，在VHG連續(xù)發(fā)酵過程中，當乙醇濃度達到46.5 g／L～56.8 g／L時（低于其最大乙醇耐受濃度），同時細胞的乙醇生產(chǎn)能力達到極限，發(fā)酵液中乙醇濃度不會繼續(xù)增加，不會對酵母細胞的生長代謝和乙醇合成代謝產(chǎn)生明顯抑制作用，乙醇生成速率維持在恒定水平。此時，細胞乙醇生成與細胞乙醇耐性之間達到了一定平衡，最終發(fā)酵體系達到了含有約150 g／L的殘?zhí)菨舛鹊臄M穩(wěn)態(tài)。S．cerevisiae BHL01、S．cerevisiae 4126和S．cerevisiae S288c VHG發(fā)酵體系的參數(shù)變化表明，酵母細胞的乙醇耐受性對VHG振蕩行為具有重要影響，在同一發(fā)酵體系中菌株乙醇耐受能力越強，其誘發(fā)的振蕩行為越劇烈。

2.2 乙醇脅迫對S．cerevisiae 4126 VHG乙醇連續(xù)發(fā)酵的影響

基于上述研究結(jié)果，本實驗以低糖穩(wěn)態(tài)體系［15］為對照體系，向其中流加含50 g／L或70 g／L乙醇的低糖發(fā)酵培養(yǎng)基，考察外源乙醇脅迫對VHG連續(xù)發(fā)酵過程的影響（見圖4）。這里的對照體系指以S．cerevisiae 4126為實驗菌株、流加含有低濃度葡萄糖（120 g／L）的培養(yǎng)基進行乙醇連續(xù)發(fā)酵可達到穩(wěn)態(tài)系統(tǒng)。

圖4 外源乙醇添加對酵母細胞低糖乙醇連續(xù)發(fā)酵體系的影響

圖4顯示，外源流加50 g／L乙醇能夠誘發(fā)低糖穩(wěn)態(tài)體系產(chǎn)生周期性振蕩行為，殘?zhí)恰⒁掖己蜕锪浚―CW）濃度分別在（39.0～99.1）g／L、（49.5～84.4）g／L和（0.4～3.8）g／L范圍振蕩，平均濃度分別為67.7 g／L、66.7 g／L和1.9 g／L，振蕩周期約為105 h。此外，添加30 g／L或40 g／L乙醇時，均能夠誘導(dǎo)周期性振蕩行為，且高濃度外源乙醇能夠誘導(dǎo)更長周期、更大振幅的振蕩行為［15］。然而，當添加更高濃度乙醇（70 g／L）時，發(fā)酵參數(shù)變化卻并不顯著，殘?zhí)?、乙醇和生物量濃度分別在106.0 g／L～114.1 g／L、62.8 g／L～73.8 g／L和0.03 g／L～0.6 g／L范圍波動。生物量平均濃度不到0.5 g／L，表明此時細胞生長幾乎被完全抑制，而且流加培養(yǎng)基中底物葡萄糖僅消耗10 g／L左右，揮發(fā)損失使得發(fā)酵液中乙醇濃度（62.8 g／L）甚至低于流加培養(yǎng)基中初始濃度（70 g／L），表明外源70 g／L乙醇施加的抑制程度超過了連續(xù)發(fā)酵體系中酵母細胞的乙醇耐受性。

研究結(jié)果表明，在酵母細胞可耐受范圍內(nèi)，通過向低糖穩(wěn)態(tài)系統(tǒng)中外源添加乙醇，對細胞施加抑制，可誘發(fā)穩(wěn)態(tài)系統(tǒng)的發(fā)酵參數(shù)出現(xiàn)周期性振蕩行為，且施加的乙醇抑制越強，誘發(fā)的振蕩行為振幅越大、周期越長，而當外源添加乙醇解除時，發(fā)酵體系會逐漸恢復(fù)到穩(wěn)態(tài)狀態(tài)。

2.3 培養(yǎng)基組成和氧供應(yīng)對釀酒酵母振蕩行為的影響

前期研究表明，乙醇連續(xù)發(fā)酵體系振蕩行為是一種復(fù)雜生物行為，是胞外以及胞內(nèi)因素共同作用的結(jié)果［15］，基于S．cerevisiae 4126 VHG連續(xù)振蕩體系，本實驗選取了對細胞生長狀態(tài)有影響的培養(yǎng)基組成和通氣供應(yīng)來考察振蕩行為受到的影響。

如圖5所示VHG乙醇連續(xù)發(fā)酵，使用營養(yǎng)豐富的YPD培養(yǎng)基時，發(fā)酵參數(shù)呈現(xiàn)大幅度、周期性振蕩行為。然而，將流加培養(yǎng)基切換成合成培養(yǎng)基后，雖然200 h內(nèi)也觀察到了較為明顯的參數(shù)振蕩行為，但運行約300 h后發(fā)酵參數(shù)的振蕩幅度逐漸變小，最后趨于穩(wěn)定，維持在高殘?zhí)牵ā?60 g／L）、低乙醇（～50 g／L）濃度水平，這種振蕩行為類似阻尼振蕩。

圖5 培養(yǎng)基組成對酵母細胞VHG振蕩行為的影響

YPD培養(yǎng)基能夠給酵母細胞提供足夠養(yǎng)分，維持細胞合成以及分解代謝，在無乙醇抑制條件下，能夠使細胞獲得高比生長速率和高乙醇比生成速率。然而，合成培養(yǎng)基中營養(yǎng)匱乏，無法提供滿足酵母細胞生物量積累及乙醇發(fā)酵的充足營養(yǎng)，限制了細胞生長和乙醇生成速率，隨著連續(xù)發(fā)酵的進行，發(fā)酵液中的乙醇濃度和細胞濃度不斷被稀釋，最后維持在一個低乙醇濃度的環(huán)境下，避免了發(fā)酵體系中出現(xiàn)高濃度乙醇以及乙醇濃度動態(tài)變化產(chǎn)生的抑制作用。

圖6所示，停止通氣對發(fā)酵體系參數(shù)振蕩行為影響顯著，通氣停止后酵母細胞生物量積累以及乙醇生成受到了明顯抑制，濃度逐漸減少，同時發(fā)酵液中殘?zhí)菨舛炔粩嗌?，振蕩行為逐漸消失。供氧對細胞生長非常重要，氧分子參與細胞中氧化磷酸化過程產(chǎn)生大量ATP，為細胞代謝活動提供能量，而在厭氧條件下1分子葡萄糖通過糖酵解途徑僅能產(chǎn)生2分子的ATP，能量供應(yīng)相對不足。雖然VHG乙醇連續(xù)發(fā)酵過程中通氣速率較小，僅0.05 vvm，但溶解氧被細胞利用后使糖酵解產(chǎn)物丙酮酸進入TCA循環(huán)得到進一步氧化，為酵母細胞代謝提供足夠ATP。因此，供氧或能量供應(yīng)有助于酵母細胞VHG連續(xù)振蕩行為的維持，表明這是一個耗能過程。

圖6 供氧對酵母細胞振蕩行為的影響

2.4 VHG振蕩行為分析

VHG乙醇連續(xù)發(fā)酵過程中，酵母細胞遭受高濃度底物的滲透壓脅迫以及高濃度產(chǎn)物乙醇的抑制作用，周期性振蕩行為的產(chǎn)生是環(huán)境和細胞因素綜合作用的結(jié)果［15，19，20］。前期研究表明，高濃度底物的滲透壓脅迫以及細胞周期變化與VHG振蕩行為無直接關(guān)聯(lián)［15，19］，通過木塊固定化提高酵母細胞乙醇耐受能力［10，13］和發(fā)酵偶聯(lián)氣提操作實時移除發(fā)酵液中部分乙醇［14，15］都能夠有效弱化VHG振蕩行為，且通過改變VHG乙醇連續(xù)發(fā)酵的稀釋速率可以切換穩(wěn)態(tài)和振蕩狀態(tài)［12］。本研究結(jié)果表明，細胞乙醇耐受性差異（與菌種、外源乙醇脅迫等有關(guān)）和細胞生長和能量狀態(tài)（與培養(yǎng)基組成、供氧等有關(guān)）對VHG振蕩行為有顯著影響。

每株酵母菌都存在一個臨界乙醇耐受濃度Ecrit，當發(fā)酵體系中乙醇濃度E超過Ecrit時，會對細胞生長和代謝產(chǎn)生抑制作用。在底物葡萄糖過量（280 g／L）和營養(yǎng)充足（YPD培養(yǎng)基）的VHG乙醇連續(xù)發(fā)酵體系中（無限制性基質(zhì)存在），細胞濃度變化率和乙醇濃度變化率滿足：及稀釋速率。

當發(fā)酵體系中乙醇濃度E低于Ecrit時，產(chǎn)物乙醇對細胞生長和代謝的影響可忽略（無限制性產(chǎn)物存在），此時細胞比生長速率達到最大μmax，遠大于稀釋速率D（此時細胞比死亡速率α可忽略不計），發(fā)酵體系中細胞不斷積累。厭氧或微氧條件下，釀酒酵母的乙醇積累與細胞生長相關(guān)，發(fā)酵體系中乙醇濃度隨細胞生長而不斷積累。當發(fā)酵液中乙醇濃度E超過臨界乙醇耐受濃度Ecrit時，高濃度乙醇會抑制細胞生長使其比生長速率μ逐漸減小，此時比死亡速率α不斷增加。在細胞比生長速率μ逐漸減小的過程中，細胞生長速率d X／d t和乙醇生成速率d E／d t隨之發(fā)生著變化，從式（1）和（2）可知d X／d t和d E／d t的變化趨勢并不一致，這與VHG振蕩周期中觀察到生物量濃度和乙醇濃度曲線的相位差吻合［3，15，19］，文獻顯示生物量濃度較乙醇濃度先出現(xiàn)下降，在S．cerevisiae 4126 VHG連續(xù)振蕩體系中這種相位差約24 h，這種差異正是由于細胞生長和乙醇生成對乙醇脅迫的響應(yīng)不同造成的，這可能是誘導(dǎo)周期性VHG振蕩行為的關(guān)鍵。基于此，VHG振蕩行為的調(diào)控與μ，D和α相關(guān)，而α與細胞乙醇耐受性（Ethanol tolerance，Et）密切相關(guān)，本研究提出VHG振蕩調(diào)控與μ，D和Et存在一定函數(shù)關(guān)系。除稀釋速率D外［12，21］，本研究結(jié)果證實比生長速率μ（與培養(yǎng)基組成、供氧狀態(tài)等相關(guān)）以及乙醇耐受性Et（菌種差異、外源乙醇脅迫等相關(guān)）是VHG振蕩行為產(chǎn)生的另外兩個關(guān)鍵因素。

3 結(jié) 論

其中，X、S0、S、E、μ、qeth、α及D分別表示細胞濃度、流加培養(yǎng)基中初始糖濃度、殘?zhí)菨舛?、乙醇濃度、細胞比生長速率、乙醇比生成速率、細胞比死亡速率

（1）VHG振蕩行為的產(chǎn)生與酵母細胞的乙醇耐受性有關(guān)，且乙醇耐受性越強的酵母菌的振蕩行為越顯著；在酵母細胞可耐受范圍內(nèi)，向低糖穩(wěn)態(tài)系統(tǒng)中施加外源乙醇脅迫，可誘發(fā)周期性振蕩行為，且施加的乙醇抑制作用越強，誘發(fā)的振蕩行為越劇烈，而當外源乙醇脅迫解除時，發(fā)酵體系可恢復(fù)到穩(wěn)態(tài)狀態(tài)。

（2）VHG振蕩行為的產(chǎn)生與培養(yǎng)基組成以及氧供應(yīng)相關(guān)，營養(yǎng)和能量供應(yīng)是維持周期性VHG振蕩的重要因素。

（3）VHG振蕩行為的產(chǎn)生與比生長速率μ、比死亡速率α、稀釋速率D以及乙醇耐受性Et相關(guān)，且細胞生長和乙醇生成對乙醇脅迫的響應(yīng)不同可能是誘發(fā)VHG振蕩行為的關(guān)鍵。