劉 旭，常 德*，王俊鋒

(1.中國人民解放軍總醫(yī)院 第三醫(yī)學(xué)中心，北京 100069； 2.中國人民解放軍總醫(yī)院 第二醫(yī)學(xué)中心，北京 100853)

為揭示各種生命活動和遺傳現(xiàn)象，人類在上世紀(jì)90年代啟動了人類基因組計劃。隨著人類基因組測序計劃的順利完成，生命科學(xué)研究重心轉(zhuǎn)向了研究基因功能，以及解析基因在不同表型中的作用機(jī)制。基因組測序只是人類基因組計劃中的第一個步驟，更艱巨的任務(wù)是明確基因的功能和破譯非編碼區(qū)的意義，也就是DNA序列如何決定和影響生物學(xué)性狀。在結(jié)構(gòu)基因組學(xué)的研究成就和高通量的分析技術(shù)得到發(fā)展的背景下，功能基因組學(xué)作為一門新學(xué)科應(yīng)運(yùn)而生[1-2]。其研究目的是分析全部基因的功能，包括結(jié)構(gòu)編碼基因、小分子RNA、非編碼RNA和代謝產(chǎn)物等， 解釋它們是如何相互調(diào)控和影響生物學(xué)表型，從而控制生命現(xiàn)象。功能基因的篩選和鑒定是研究基因如何調(diào)控生物過程發(fā)生和變化的基礎(chǔ)，這項工作的順利完成很大程度上依賴新技術(shù)、新方法的發(fā)展和應(yīng)用。為分離出某種表型或生命過程的功能基因，一方面可以從性狀入手研究基因，即基于正向遺傳學(xué)的篩選方法[3]；也可從基因入手反向研究相關(guān)性狀，即基于反向遺傳學(xué)的篩選方法[4]，本文將對功能基因篩選策略及其優(yōu)缺點(diǎn)進(jìn)行綜述(表1)。

1 基于正向遺傳學(xué)的篩選方法

基于正向遺傳學(xué)的篩選策略是指以個體或細(xì)胞的特定表型為切入點(diǎn)，尋找表型相對應(yīng)的基因，并揭示基因的功能[3]。該策略的完成需要具備特異性的生物學(xué)表型，然后通過分子生物學(xué)或遺傳學(xué)方法獲得候選基因，最后對候選基因進(jìn)行評價和功能驗證。具體包括傳統(tǒng)的遺傳學(xué)分析、基于DNA測序的基因突變分析、基因表達(dá)譜分析和全基因組關(guān)聯(lián)研究、高通量基因測序、表達(dá)譜分析(基因表達(dá)譜、蛋白表達(dá)譜、microRNA表達(dá)譜和代謝組等)和生物信息學(xué)技術(shù)等。

1.1 傳統(tǒng)遺傳學(xué)分析

功能基因在基因組上的基因座一般都相對較穩(wěn)定，通過構(gòu)建精細(xì)遺傳圖譜和分子連鎖圖，先將突變基因首先確定在某條染色體的某個區(qū)段，然后利用各種分子標(biāo)記來把定位區(qū)間逐漸縮小一個范圍。下一步采用計算機(jī)和分子遺傳學(xué)方法, 分離定位區(qū)內(nèi)可能相關(guān)的基因，并逐個檢測和對比家系中患者與正常者的這些基因，確定相應(yīng)生物學(xué)性狀的候選基因[4]。利用該方法中國科學(xué)家收集短指家系中短指患者及健康人標(biāo)本，用連鎖分析方法進(jìn)行全基因組掃描，首次定位并克隆了家族性A-1型短指(趾)癥基因IHH[5]；然而該方法對研究對象要求較高、工作繁重，耗費(fèi)大量人力、物力和財力。

1.2 全基因組關(guān)聯(lián)分析

全基因組關(guān)聯(lián)研究(genome-wide association studies，GWAS)是篩選大規(guī)模群體樣本基因組中的序列變異，包括單核苷酸變異(單核苷酸多態(tài)性single-nucleotide polymorphisms, SNPs)和 拷 貝 數(shù) 變 異 (copy number variation, CNV)等，尋找與某種表型具有相關(guān)性的基因，是篩選復(fù)雜疾病易感基因的方法之一[6]。利用該技術(shù)發(fā)現(xiàn)了冠心病易感基因ADTRP和MIA3/TANGO1[7]、肥胖癥相關(guān)的基因FTO[8]以及2型糖尿病[9]的相關(guān)易感基因PTPN22、CTLA-4、IL2-RA和INS[9]。GWAS為復(fù)雜性狀研究提供了線索，找到了很多未曾發(fā)現(xiàn)的基因和染色體區(qū)域，并且不需預(yù)先假設(shè)相關(guān)基因。但是，GWAS研究中的樣本混雜，易出現(xiàn)假陰性和假陽性結(jié)果。盡管非編碼區(qū)基因可以調(diào)控編碼基因，從而影響表型，但是GWAS發(fā)現(xiàn)的關(guān)聯(lián)SNPs常在基因間區(qū)或內(nèi)含子上, 很少位于外顯子區(qū)或者UTR區(qū)。大量研究結(jié)果提示稀有變異導(dǎo)致了許多復(fù)雜表型，而芯片檢測位點(diǎn)大多是發(fā)現(xiàn)常見變異，較少檢測到稀有變異。同時數(shù)據(jù)共享、數(shù)據(jù)解讀和后續(xù)基因功能驗證都是需要克服的問題。

表1 常用的基因篩選方法特點(diǎn)Table 1 Features of commonly used genetic screening strategies

1.3 表達(dá)譜差異分析

表達(dá)譜包括基因表達(dá)譜、蛋白表達(dá)譜、microRNA表達(dá)譜和代謝產(chǎn)物譜等。通過比較具有不同生物學(xué)表型樣本間的基因、蛋白質(zhì)或者microRNA的差異，篩選出表型相關(guān)分子是目前用于鑒定功能基因較多的一種方法[10-11]。DNA微陣列是較早運(yùn)用于篩選功能基因的一種技術(shù)，隨后出現(xiàn)了轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)[10]，該技術(shù)不需提前設(shè)計芯片，就可對樣本的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行檢測。同理，蛋白組表達(dá)譜和microRNA表達(dá)譜可對比樣本間蛋白質(zhì)和microRNA的表達(dá)差異，篩選出某種生物學(xué)表型相關(guān)的蛋白質(zhì)或者microRNA分子[10-11]。然而，差異表達(dá)譜技術(shù)最大的缺陷在于基因、蛋白、microRNA分子和代謝產(chǎn)物的時空表達(dá)差異性。生命活動是一種動態(tài)過程，若僅比較兩種或幾種靜止的狀態(tài)，無法再現(xiàn)生物學(xué)過程，篩選到的性狀相關(guān)分子同表型之間無因果關(guān)系，后續(xù)需要大量的驗證工作。另外，這些技術(shù)產(chǎn)生的數(shù)據(jù)量巨大，如何從中挖掘出有意義的信息也是后續(xù)分析中的核心問題。

1.4 高通量基因組測序篩選功能基因

利用高通量基因組測序方法，分析野生型和突變型之間基因組的差異，可找到控制表型的DNA序列。目前應(yīng)用較多的是基因組外顯子測序，該技術(shù)捕捉外顯子DNA區(qū)域，富集后進(jìn)行高通量測序，從而獲得表型相關(guān)基因，已有一大批功能基因被鑒定出。然而該技術(shù)主要針對結(jié)構(gòu)變異區(qū)，忽略了非編碼區(qū)變異，并且在捕捉外顯子DNA時存在捕獲不均和偏差等問題。全基因組測序技術(shù)可以對全基因組范圍內(nèi)的插入缺失(insertion-deletion, Indel)、拷貝數(shù)變異(copy number variation, CNV)、結(jié)構(gòu)變異(structure variations, SV)和單堿基變異(single nucleotide variants, SNV)進(jìn)行檢測，分析較為全面，但是該技術(shù)主要問題是成本較昂貴以及如何從海量數(shù)據(jù)中發(fā)掘有意義的信息。

1.5 利用生物信息學(xué)方法篩選功能基因

隨著計算機(jī)和網(wǎng)絡(luò)技術(shù)的發(fā)展，以及基因組、轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組和代謝組等不同大規(guī)模組學(xué)的數(shù)據(jù)的整合，生物信息學(xué)在綜合現(xiàn)有資料、預(yù)測和選擇基因序列、克隆并獲得候選功能基因、開展基因功能篩選研究中扮演著重要角色。該研究策略不限定某種技術(shù)或信息，將不同的數(shù)據(jù)整合到一個大的體系中，從整體角度進(jìn)行候選功能基因的選擇，篩選的范圍廣，常用于新基因的功能探索研究。不過該領(lǐng)域依賴于網(wǎng)絡(luò)和計算機(jī)科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，受限于生物大數(shù)據(jù)的共享程度，更重要的是如何去偽存真，從海量醫(yī)學(xué)文獻(xiàn)和數(shù)據(jù)中挖掘重要的候選基因[12]。

2 基于反向遺傳學(xué)的篩選方法

基于反向遺傳學(xué)的篩選策略是在基因組全部DNA序列信息的基礎(chǔ)上，對基因進(jìn)行加工和修飾，包括點(diǎn)突變、基因插入、基因剔除或基因置換等，人工使得被修飾的生物體具備某些生物學(xué)特性，從中挑選該興趣的表型并鑒定相關(guān)基因，研究功能基因的結(jié)構(gòu)與功能[4]。目前，利用該技術(shù)篩選功能基因的方法眾多，主要包括cDNA文庫技術(shù)、RNAi文庫技術(shù)、反義RNA技術(shù)、CRISPR/Cas9篩選技術(shù)和插入突變技術(shù)等。

2.1 cDNA文庫篩選策略

cDNA文庫是指機(jī)體編碼成蛋白質(zhì)的基因的集合，通過mRNA的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的，利用PCR、酶切、連接、轉(zhuǎn)化等DNA克隆技術(shù)生成cDNA文庫。將構(gòu)建cDNA表達(dá)文庫導(dǎo)入特定的細(xì)胞，人工誘導(dǎo)突變細(xì)胞庫，通過特定表型篩選技術(shù)獲得感興趣的表型[13]，并反向定位所導(dǎo)入的cDNA克隆，從而鑒定出表型相關(guān)基因，同時可直接研究目的基因；但是cDNA文庫篩選功能基因時，需要提前知道基因序列，且只能過表達(dá)突變細(xì)胞文庫中的目的基因。

2.2 RNA干擾篩選策略

RNAi是生物界廣泛存在的一種現(xiàn)象，在雙鏈RNA激活下，高效特異性降解同源mRNA。該技術(shù)可特異性抑制或關(guān)閉特定基因表達(dá)，在功能基因組學(xué)、基因治療和基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛[14]。RNAi篩選策略的早期應(yīng)用開始于線蟲和果蠅等生物，篩選細(xì)胞凋亡、細(xì)胞形態(tài)和代謝相關(guān)的功能基因，隨后逐漸應(yīng)用至篩選哺乳動物生命過程相關(guān)功能基因，包括生長發(fā)育、感染發(fā)生、腫瘤耐藥和轉(zhuǎn)移基因。然而，篩選效果同RNA文庫的質(zhì)量、形式以及RNAi抑制效率等相關(guān)[15]。存在的主要問題包括：第一，基因覆蓋面窄，因為現(xiàn)有大部分RNAi文庫必須提前知道靶基因的序列，需要構(gòu)建RNAi隨機(jī)文庫來彌補(bǔ)；第二，為保證較好的干擾效果，每個基因需合成多條寡核苷酸或構(gòu)建多個載體，導(dǎo)致大大增加了工作量和成本；第三，只能抑制或關(guān)閉基因的表達(dá)，不能過表達(dá)基因，而某些突變表型是通過基因過表達(dá)獲得，因此，需要配合cDNA文庫技術(shù)使用[20]。

2.3 CRISPR/Cas9篩選策略

CRISPR-Cas9技術(shù)可進(jìn)行基因編輯，主要是通過一段與目標(biāo)DNA相同的向?qū)NA序列來定位靶向基因，指導(dǎo)Cas9酶進(jìn)行基因的修飾，從而突變基因。CRISPR/Cas9技術(shù)能高效、準(zhǔn)確、簡便的修飾基因，已廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，逐漸取代RNAi和cDNA文庫技術(shù)用于篩選和鑒定功能基因，是一種較為理想的功能篩序方法[16]。然而，由于CRISPR-Cas9系統(tǒng)通過20個堿基的向?qū)NA定位靶標(biāo)，有可能錯配導(dǎo)致脫靶，是目前限制其應(yīng)用的一個重要缺陷[17]。

2.4 模式生物篩選策略

模式生物是指在科學(xué)試驗中廣泛應(yīng)用的、具有標(biāo)準(zhǔn)屬性的試驗生物。這些生物的結(jié)構(gòu)簡單、細(xì)胞數(shù)量少，分布簡單，表型容易觀察[18]。目前常用的模式生物有果蠅、線蟲、擬南芥和酵母等[19]，該類生物的基因組小，編碼基因的比例高，主要是管家基因，很少有基因組中的重復(fù)序列和非編碼序列，是壓縮了的基因組，適合編碼區(qū)基因的研究。

2.5 插入突變篩選策略

插入突變是利用已知的外源DNA插入序列破壞基因的結(jié)構(gòu)而導(dǎo)致突變，可以直接驗證個別基因與所篩選性狀之間的關(guān)系，該方法不需提前知道基因表達(dá)和基因產(chǎn)物，可對未知基因進(jìn)行研究，是一種理想的功能基因組學(xué)研究方法[20]。目前，利用插入突變進(jìn)行功能基因組學(xué)研究應(yīng)用較多的工具是轉(zhuǎn)座子，包括DNA-DNA方式轉(zhuǎn)座的轉(zhuǎn)座子和反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子。前者可通過DNA復(fù)制或直接切除兩種方式獲得移動片段，并將移動片段插入基因組；后者在結(jié)構(gòu)和復(fù)制上類似反轉(zhuǎn)錄病毒，先通過轉(zhuǎn)錄合成mRNA，再經(jīng)過反轉(zhuǎn)錄合成新DNA序列整合到基因組中。由于轉(zhuǎn)座子可在基因組中跳躍，利用轉(zhuǎn)座子作為工具，對基因組中的基因進(jìn)行插入突變，并根據(jù)轉(zhuǎn)座子位置可鎖定插入位點(diǎn)，得到功能獲得性或丟失性突變，選擇合適的表型篩選方法分離突變克隆，最后克隆功能基因[21]。

本團(tuán)隊整合了轉(zhuǎn)座子插入突變技術(shù)、反義RNA技術(shù)和真核基因表達(dá)調(diào)控技術(shù)的功能基因組學(xué)技術(shù)，建立了隨機(jī)基因突變調(diào)控技術(shù)。該技術(shù)基于能在真核細(xì)胞中高效整合的piggyBac轉(zhuǎn)座子而構(gòu)建的基因搜尋載體隨機(jī)插入基因組，通過插入的基因搜尋載體上的四環(huán)素反應(yīng)元件(TRE)受到轉(zhuǎn)錄激活因子的激活，產(chǎn)生反義RNA可以下調(diào)基因表達(dá)，而且該種基因表達(dá)的調(diào)控受強(qiáng)力霉素調(diào)控。因此，該技術(shù)產(chǎn)生全基因組純合基因突變；提供全基因組基因篩選和基因功能分析；同時發(fā)現(xiàn)并證實其基因突變和功能表達(dá)的關(guān)系；系統(tǒng)性基因功能定位和分析其在遺傳和生化通路中的功能特點(diǎn)；快速分離與疾病有關(guān)基因和變阻器式基因表達(dá)調(diào)控。

此外，在插入突變中應(yīng)用較多的轉(zhuǎn)座子包括反轉(zhuǎn)錄病毒、Sleeping Beauty、PiggyBac、Tol1/2、Hsmar1和Mions等。1993年以線蟲為研究對象，證明可利用轉(zhuǎn)座子在基因組中獲得插入突變[22]；隨后采用反轉(zhuǎn)錄病毒作為基因搜尋載體并結(jié)合相應(yīng)的表型可篩選出新的腫瘤抑制基因tsg101；1997年首次在哺乳動物細(xì)胞中使用外源性SB轉(zhuǎn)座子突變基因[22]；2004年報道了一種能在全基因組范圍內(nèi)整合的轉(zhuǎn)座子PiggyBac[23]。PiggyBac是一種從昆蟲中分離出來的可移動的DNA元件，通過“剪切和粘貼”機(jī)制在載體和染色體之間進(jìn)行有效的轉(zhuǎn)位，整合位置多見于內(nèi)含子區(qū)域，插入效率高，在原核和真核生物中均可進(jìn)行有效轉(zhuǎn)座。2005年證明在哺乳動物細(xì)胞中PiggyBac轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)能高效且穩(wěn)定的整合；很多實驗已證實PiggyBac轉(zhuǎn)座系統(tǒng)攜帶的外源基因片段的能力強(qiáng)，最高可攜帶14.3 kb片段且不會影響轉(zhuǎn)座效率；近70%插入位點(diǎn)位于轉(zhuǎn)錄單位附近；插入效率高；能在人體細(xì)胞的23條染色體上轉(zhuǎn)座，插入位點(diǎn)可覆蓋整個基因組[22-25]。因此，插入突變篩選功能基因的策略依賴于所使用的插入突變工具，一方面要有較高的整合效率，另一方面要在基因組上覆蓋范圍廣[26-27]。

綜上所述，功能基因(既包括編碼基因，又包括非編碼基因)的篩選研究對于揭示生物的生長、發(fā)育、代謝等生命活動規(guī)律，以及人類重大疾病的發(fā)生機(jī)制、預(yù)防、診斷、治療和藥物研發(fā)等方面具有重要意義。人類全基因組核苷酸測序的完成只是解密人類遺傳密碼的基礎(chǔ)，如果不能賦予一個基因功能，徒有核苷酸的排列序列是毫無價值和意義的，更重要的是認(rèn)識這些DNA是如何實現(xiàn)其功能的。雖然可以憑借核苷酸序列推測基因的功能，但是后期需要大量的實驗驗證。因此，通過特定的方法進(jìn)行功能篩選，獲得同表型具有因果關(guān)系的基因，在后基因組時代解析基因功能以及開展相關(guān)應(yīng)用中意義重大。本文中基于傳統(tǒng)遺傳學(xué)、全基因組關(guān)聯(lián)分析、表達(dá)譜差異、基因組測序、生物信息學(xué)、cDNA文庫、RNA干擾、CRISPR/Cas9技術(shù)、插入突變、模式生物等技術(shù)的篩選策略，根據(jù)是從表型到基因的篩選，還是從基因到表型的篩選，大致分為基于正向遺傳學(xué)和基于反向遺傳學(xué)的篩選技術(shù)并進(jìn)行了綜述；然而，這些技術(shù)并不是孤立的，常可以聯(lián)合應(yīng)用，優(yōu)勢互補(bǔ)，最終的目的是快速、系統(tǒng)地評價基因功能，發(fā)現(xiàn)功能基因的潛在價值，服務(wù)于人類健康。