路亞嵐，周 澧，韓云林，王克維，秦 川

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 醫(yī)學(xué)實驗動物研究所 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 比較醫(yī)學(xué)中心 國家衛(wèi)生健康委員會人類比較醫(yī)學(xué)重點實驗室北京市人類重大疾病實驗動物模型工程技術(shù)研究中心，北京 100021)

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)是一種以進行性神經(jīng)認(rèn)知障礙為主要臨床表現(xiàn)的神經(jīng)退行性疾病，中國AD患者人數(shù)超過800萬，是繼心血管疾病、腫瘤和腦卒中之后的第四大殺手[1-3]。AD具有老年斑和神經(jīng)原纖維纏結(jié)(neurofibillary tangle, NFT)兩大病理學(xué)特征，分別由β-淀粉樣蛋白(Amyloid beta, Aβ)和磷酸化Tau蛋白(p-Tau)蛋白的異常聚集形成。它們會誘發(fā)神經(jīng)毒性作用，導(dǎo)致神經(jīng)元和突觸丟失，引起神經(jīng)衰退[4]。目前靶向Aβ的數(shù)十種藥物的臨床實驗均宣告失敗，針對Tau蛋白的藥物研發(fā)是一個重要的新方向[5]。而且Aβ的毒性作用也需要Tau蛋白介導(dǎo)，然而Tau蛋白異常磷酸化與神經(jīng)元損傷之間的關(guān)系尚不十分明確[6]。因此，p-Tau蛋白的神經(jīng)毒性作用的進一步闡述是一個重要的科學(xué)問題。岡田酸(okadaic acid, OA)是海洋生物中提取的一種蛋白磷酸酶的強效抑制劑，是建立Tau蛋白過度磷酸化模型的公認(rèn)藥物[7-8]。本研究采用OA誘導(dǎo)神經(jīng)母細胞瘤細胞株SH-SY5Y，檢測Tau蛋白磷酸化水平，細胞形態(tài)、細胞凋亡指標(biāo)以及抗凋亡家族蛋白(inhibitor of apoptosis family proteins, IAPs)表達水平，探索Tau蛋白的異常磷酸化對神經(jīng)元凋亡的影響，以及IAPs的調(diào)控作用，為AD的預(yù)防和診療奠定了重要基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞：人源神經(jīng)母細胞瘤細胞系SH-SYSY(北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院細胞資源中心/國家實驗細胞資源共享平臺)。

1.1.2 主要試劑：OA(Sigma- Aldrich公司)；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)、青霉素-鏈霉素(penicillin-streptomycin, PS)、0.25%胰蛋白酶和磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline, PBS)(Gibco公司)；RIPA裂解液和BCA試劑盒(上海碧云天生物科技有限公司)；Protease inhibitor cocktail(Roche公司)；caspase 3和GAPDH抗體(CST公司)；β-actin抗體(Abcam公司)；p-Tau抗體(Thermo Scientific公司)；HRP標(biāo)記山羊抗兔/小鼠二抗(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；ECL發(fā)光試劑(Millipore公司)；TUNEL試劑盒(Roche公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞的分組及處理：將SH-SY5Y細胞(含10% FBS+1% PS的DMEM培養(yǎng)基)以5×105個/孔接種于6孔板，待細胞匯合度達到80%時，加入20和40 nmol/L OA，分別誘導(dǎo)0、12、24、48和72 h后倒置顯微鏡下觀察拍照。

1.2.2 Western blot檢測蛋白表達：收集OA誘導(dǎo)后的SH-SY5Y細胞團塊，使用RIPA裂解細胞，提取蛋白，BCA法測定蛋白濃度。通過10%～15%的SDS-PAGE分離蛋白，300 mA恒流轉(zhuǎn)膜后，5% BSA或脫脂奶粉封閉1 h，加入一抗4 ℃過夜孵育，TBST 漂洗后加入二抗，室溫孵育1 h后漂洗，使用ECL發(fā)光試劑盒和凝膠成像系統(tǒng)拍照。

1.2.3 透射電鏡檢測細胞超微結(jié)構(gòu)：收集≥1×107個OA誘導(dǎo)后的SH-SY5Y細胞團塊，加入2.5%戊二醛4℃固定過夜后，用PBS沖洗3次；之后1%鋨酸4℃固定2 h，去離子水沖洗3次，每次10 min；梯度乙醇脫水、環(huán)氧丙烷置換處理，樹脂浸透、包埋，制成90 nm厚的超薄切片，醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛染色后，應(yīng)用JEM-1400 Plus電鏡觀察拍照。

1.2.4 TUNEL法檢測細胞凋亡：OA誘導(dǎo)后的SH-SY5Y細胞經(jīng)4%多聚甲醛固定，PBS清洗后，浸入封閉液中封閉10 min，PBS清洗后0.1% Triton X-100室溫透化2 min，PBS清洗后，滴加TdT酶反應(yīng)液，37 ℃避光孵育1 h后，浸入0.3% H2O2中室溫封閉5 min，PBS漂洗后滴加Streptavidin-HRP工作液，37 ℃反應(yīng)30～60 min，漂洗后滴加DAB染液顯色，去離子水漂洗數(shù)次后封片，光鏡下觀察拍照。

1.2.5 RT-qPCR檢測IAPs的mRNA水平：按照Trizol試劑說明書提取細胞樣本RNA，測量濃度，使用PrimeScript RT Master Mix cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。通過TB Green Premix Ex Taq TM Ⅱ(TliRNaseH Plus) 試劑盒對IAPs進行qPCR檢測，β-actin為內(nèi)參(表1)。使用FTC-3000p實時PCR系統(tǒng)完成實驗后，采用2△△Ct法分析數(shù)據(jù)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 OA誘導(dǎo)SH-SY5Y細胞Tau蛋白磷酸化

SH-SY5Y細胞經(jīng)過OA誘導(dǎo)24 h后Tau磷酸化水平顯著上調(diào)，在20 nmol/L時大約上調(diào)2倍，在40 nmol/L時約上調(diào)5倍(圖1A～B)。

2.2 OA對SH-SY5Y細胞形態(tài)的作用

20 nmol/L OA處理細胞12 h后細胞開始變圓，貼壁能力減弱，神經(jīng)突樣結(jié)構(gòu)變短，隨著時間增加，細胞形態(tài)逐漸不規(guī)則，神經(jīng)突樣結(jié)構(gòu)變短、消失，出現(xiàn)大量凋亡及死亡細胞，72 h后，細胞進一步皺縮、核凝集、碎裂，幾乎全部死亡，培養(yǎng)基中存在大量漂浮細胞(圖2A～B)。在相同時間下，40比20 nmol/L OA組的細胞形態(tài)異常更嚴(yán)重，在48 h時貼壁細胞數(shù)量顯著減少(圖2A)。

2.3 OA誘導(dǎo)SH-SY5Y細胞線粒體損傷

對照組線粒體雙層膜結(jié)構(gòu)清晰，線粒體嵴分布均勻；OA處理24 h后的線粒體明顯腫脹，部分線粒體嵴稀少，排列紊亂；處理48 h后線粒體嵴斷裂、退化甚至消失，比24 h更為嚴(yán)重(圖3)。

2.4 OA誘導(dǎo)SH-SY5Y細胞凋亡檢測

OA誘導(dǎo)24 h后幾乎全部棕黃色著色，代表細胞大量凋亡發(fā)生，48 h時大量漂浮死亡細胞，殘余細胞幾乎全部皺縮，著色為棕褐色，發(fā)生嚴(yán)重的凋亡現(xiàn)象(圖4A～B)。

2.5 OA促進SH-SY5Y細胞凋亡蛋白表達

隨著OA的誘導(dǎo)，caspase3的活性狀態(tài)比(cleaved /pro-caspase3)表達呈時間依賴性增加，具體為：24 h約為對照組2倍，48 h約為對照組4倍，72 h約為對照組8倍；在OA處理48和72 h后，40 nmol/L組caspase3的活性狀態(tài)比高于20 nmol/L組(P<0.01)(圖5A～B)。

2.6 OA誘導(dǎo)SH-SY5Y細胞的IAPs mRNA表達

OA誘導(dǎo)SH-SY5Y細胞24 h后，7個IAPs家族成員在20和/或40 nmol/L有不同程度的顯著上調(diào)，其中cIAP1、cIAP2、apollon和livin在OA兩個濃度條件下均顯著上調(diào)(P<0.05)(圖6)。

表1 IAPs qPCR引物列表Table 1 IAPs qPCR primers list

A.Western blot; B.quantification analysis of p-Tau in OA induced SH-SY5Y cells; *P<0.001 compared with control group; #P<0.01 compared with 20 nmol/L OA group

A.SH-SY5Y cell morphology after 20 nmol/L (up) and 40 nmol/L (down) OA treatment for 0, 12, 24, 48 and 72 hours; B.the measure of axon length; *P<0.001 compared with control group

Representative images for SH-SY5Y cells mitochondrial structure damage in OA (20 nmol/L) treatment for24 hours and 48 hours

A.representative TUNEL images were shown in OA (20 nmol/L) treatment for 24 hours and 48 hours; B.qualification of apoptotic cell ratio upon OA treatment; *P<0.001 compared with control group

A.Western blot of pro-caspase 3 and cleaved-caspase 3 in OA induced SH-SY5Y cells; B.quantification of cleaved/pro-caspase 3 grayscale value in 20 nmol/L and 40 nmol/L OA induced SH-SY5Y cells;*P<0.01, **P<0.001 compared with control group (0 hours);#P<0.001 compared with 20 nmol/L OA treatment for 48 hours; △P<0.001 compared with 20 nmol/L OA treatment for 72 hours

*P<0.05, **P<0.01 compared with control group圖6 OA誘導(dǎo)的SH-SY5Y細胞的IAPs蛋白mRNA水平表達量Fig 6 OA induced SH-SY5Y cell IAPs mRNA level were detected by n=3)

3 討論

突觸、神經(jīng)元的丟失是AD的關(guān)鍵特征，也是功能異常的重要原因[8-9]。Tau蛋白是一種重要的微管相關(guān)蛋白，在維持微管的穩(wěn)定性、軸索的運輸以及軸突的生長中具有重要作用[4]。天然狀態(tài)很少有聚集的趨勢，其過度磷酸化會喪失與管蛋白結(jié)合的能力，使其更容易聚集成雙螺旋纖維絲，形成NFT，導(dǎo)致其相關(guān)的胞體和軸突物質(zhì)轉(zhuǎn)運障礙以及相應(yīng)的神經(jīng)元活性降低[4]。本文通過OA誘導(dǎo)Tau蛋白異常磷酸化，模擬NFT，結(jié)果發(fā)現(xiàn)確實可促進細胞損傷(細胞形態(tài)異常、細胞凋亡、活性caspase 3表達量上調(diào))，提示在AD患者腦組織中過度磷酸化的Tau蛋白形成的NFT會隨時間積累，誘導(dǎo)進行性的神經(jīng)元損傷。此外，通過該模型的OA誘導(dǎo)細胞在40 nmol/L OA誘導(dǎo)條件下24 h內(nèi)即出現(xiàn)大面積凋亡，損傷非常嚴(yán)重，在大多數(shù)實驗中建議選擇20 nmol/L OA。

細胞凋亡是一種細胞程序性死亡，主要包括內(nèi)部線粒體途徑、外部凋亡途徑和B粒酶介導(dǎo)的細胞凋亡[10-11]。通過超微結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，細胞線粒體形態(tài)明顯異常，出現(xiàn)腫脹、雙層膜結(jié)構(gòu)受損，脊消失等表型，提示內(nèi)部線粒體途徑參與OA誘導(dǎo)的細胞凋亡過程。在AD患者尸檢中發(fā)現(xiàn)線粒體形態(tài)和功能障礙，以及相關(guān)的自由基、脂質(zhì)/蛋白過氧化，在APPswe/PS1dE9小鼠中也發(fā)現(xiàn)類似的線粒體功能障礙[12]。線粒體損傷是AD的一個共性特征，因此，增強線粒體蛋白代謝，研發(fā)維持線粒體結(jié)構(gòu)和功能穩(wěn)定性的藥物可能是AD防治的一個可行的策略。

IAPs家族蛋白作為抵抗細胞凋亡的關(guān)鍵蛋白家族之一，在OA誘導(dǎo)的細胞凋亡過程中，IAPs家族成員呈不同程度上調(diào)，表明作為重要的抵抗凋亡因子參與細胞保護[13]。由此推測在阻止AD進程中可能發(fā)揮功能，進一步探索該家族成員功能，尤其是cIAP1、cIAP2、apollon和livin蛋白，可能會為預(yù)防/延緩甚至治療AD的進展提供方向。

綜上所述，本研究系統(tǒng)揭示了OA誘導(dǎo)的Tau蛋白異常磷酸化可能是通過內(nèi)源線粒體途徑誘導(dǎo)細胞凋亡，在這個過程中IAPs家族蛋白各成員都是顯著上調(diào)，積極對抗凋亡作用。本研究闡述了NFT與突觸神經(jīng)元丟失的可能機制，同時為AD的治療的可能靶點(比如：減少Tau異常磷酸化、對抗線粒體凋亡途徑、上調(diào)抗凋亡家族蛋白)提供了思路。