姜秀芳，耿亞楠，陽(yáng)盛洪，魏 平，趙 名*，朱玲玲*

(1.軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院 軍事認(rèn)知與腦科學(xué)研究所， 北京 100850； 2.中國(guó)人民解放軍陸軍第957醫(yī)院，西藏自治區(qū) 阿里地區(qū) 859000)

炎性反應(yīng)是多種生理和病理過(guò)程的基礎(chǔ)，是生物體對(duì)各種有害刺激(如有害刺激物、受損細(xì)胞和病原體等)的防御機(jī)制。通常，由于炎性反應(yīng)具有從原始刺激和炎性反應(yīng)中消除受損組織或壞死細(xì)胞的功能，因此認(rèn)為炎性反應(yīng)對(duì)于自我愈合和修復(fù)具有積極的意義。然而，過(guò)度或不受控制的炎性反應(yīng)對(duì)生物體是有害的，并可能引發(fā)炎性疾病[1]。對(duì)于腦這一特殊器官來(lái)說(shuō)，炎性反應(yīng)被廣泛認(rèn)為是神經(jīng)功能退化的主要原因[2]。動(dòng)物模型和遺傳學(xué)研究結(jié)果表明，神經(jīng)退行性疾病發(fā)生發(fā)展過(guò)程中通常伴有神經(jīng)組織的免疫信號(hào)失調(diào)、炎性分泌因子水平改變以及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的異?；罨痆3]。因此，減輕或抑制炎性反應(yīng)是防治多種腦疾病的重要策略。

絞股藍(lán)皂苷(gypenoside, GP)是中藥絞股藍(lán)的主要藥理活性成分。細(xì)胞和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，絞股藍(lán)皂苷具有多種生理活性，包括免疫調(diào)節(jié)、抗缺血、降血脂、抗氧化等[4-5]。以往研究報(bào)道發(fā)現(xiàn)絞股藍(lán)皂苷可通過(guò)抗感染活性而表現(xiàn)出抗焦慮或抗抑郁樣的效應(yīng)[6-7]。但絞股藍(lán)皂苷對(duì)神經(jīng)元炎性損傷的影響及分子機(jī)制尚不清楚。本文以LPS誘導(dǎo)PC12細(xì)胞建立神經(jīng)元炎性損傷模型，研究絞股藍(lán)皂苷對(duì)神經(jīng)元炎性損傷的影響及分子機(jī)制，研究結(jié)果將為其用于防治神經(jīng)炎性反應(yīng)疾病提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

絞股藍(lán)皂苷(中國(guó)科學(xué)院蘭州化學(xué)物理研究所楊軍麗實(shí)驗(yàn)室制備，純度≥98%)。將絞股藍(lán)皂苷溶解于無(wú)菌水中，配成30 mg/mL的溶液備用。RPMI1640(Gibco)；胎牛血清(Ausbian)；LPS(Sigma-Aldrich公司)；CCK-8試劑盒(日本同仁化學(xué)研究所)；Trizol(Thermo-Fisher公司)。反轉(zhuǎn)錄試劑盒HiScript?Ⅲ RT SuperMix for q-PCR和實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)預(yù)混液ChamQTM SYBR?q-PCR Master Mix(南京諾唯贊生物科技股份有限公司)。蛋白裂解液Laemmli Sample Buffer(Bio-Rad公司)，BCA蛋白定量試劑盒(北京普利萊基因技術(shù)有限公司)。p-p65、t-p65一抗以及抗鼠或兔二抗(Cell Signaling Technology公司)；β-actin一抗(Sigma-Aldrich公司)；PC12細(xì)胞(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞資源中心)。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞的培養(yǎng)及分組處理：將PC12細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI1640完全培養(yǎng)液中，在5% CO2培養(yǎng)箱中飽和濕度條件下37 ℃常規(guī)培養(yǎng)，每2～3天傳代或換液1次。將PC12細(xì)胞分為對(duì)照組、LPS處理組、不同劑量(30、100 μg/mL)絞股藍(lán)皂苷干預(yù)組和絞股藍(lán)皂苷干預(yù)聯(lián)合LPS處理組。

1.2.2 CCK8法測(cè)定細(xì)胞活力：將處于對(duì)數(shù)增殖期的PC12細(xì)胞用胰蛋白酶消化計(jì)數(shù)，以5 000個(gè)/孔接種于96孔板中，經(jīng)各實(shí)驗(yàn)組處理完畢后，每孔各加入10 μL的CCK-8溶液，輕輕晃動(dòng)搖勻，將培養(yǎng)板放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育1 h，然后用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm的吸光值(A)。以對(duì)照組細(xì)胞的細(xì)胞活力為100%，計(jì)算各實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞活力。

1.2.3 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)炎性因子mRNA的表達(dá)水平：收集各組細(xì)胞樣品，采用Trizol法提取總RNA，應(yīng)用UV5nano紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)進(jìn)行定量，取1 μg總RNA采用HiScript?Ⅲ RT SuperMix for q-PCR試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，然后采用ChamQTM SYBR? q-PCR Master Mix預(yù)混液在C1000 Touch Thermal CyclerPCR儀上進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)。PCR程序參照試劑盒提供的兩步法進(jìn)行：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)。各組實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。以β-actin作為內(nèi)參基因，用2-ΔΔCt法計(jì)算各處理組目的基因的相對(duì)表達(dá)量，將對(duì)照組的相對(duì)表達(dá)量設(shè)定為1，各處理組是相對(duì)于1的變化倍數(shù)。采用Primer3(Version4.1.0)在線設(shè)計(jì)各目的基因的上下游引物，如表1所示。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.2.4 Western blot檢測(cè)p-p65蛋白：收集各處理組細(xì)胞樣品，加入Laemmli Sample緩沖液充分裂解后煮沸變性10 min；然后4 ℃、12 000 r/min離心10 min，上清即全細(xì)胞裂解液。采用BCA法進(jìn)行蛋白定量。各處理組取20 μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳。PVDF膜轉(zhuǎn)印后，將膜放在5%脫脂奶粉中室溫封閉1 h；TBST洗滌3次后，加入適當(dāng)稀釋于5%脫脂奶粉中的一抗，并4 ℃孵育過(guò)夜。TBST洗滌3次，然后加入辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的二抗(1∶2 000稀釋)室溫孵育2 h，洗滌后在暗室中進(jìn)行顯影定影。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 不同劑量的LPS對(duì)PC12細(xì)胞炎性反應(yīng)的影響

經(jīng)不同劑量的LPS刺激后，TNF-α和IL-1β mRNA水平均顯著上調(diào)，IL-6的mRNA水平在300 ng/mL的LPS刺激下才發(fā)生明顯上調(diào)。因此，在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中，300 ng/mL的 LPS被用于構(gòu)建PC12細(xì)胞的神經(jīng)炎性反應(yīng)模型(圖1)。

2.2 絞股藍(lán)皂苷預(yù)處理減輕LPS刺激導(dǎo)致的PC12細(xì)胞活力下降

與對(duì)照組相比，LPS組的細(xì)胞活力下降到85.7%(P<0.01)，絞股藍(lán)皂苷單獨(dú)處理對(duì)PC12細(xì)胞活力沒(méi)有影響，卻可以減輕LPS所導(dǎo)致的細(xì)胞活力下降(P<0.01)(圖2)。

2.3 絞股藍(lán)皂苷預(yù)處理減輕LPS誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞炎性反應(yīng)

LPS組的炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6表達(dá)水平顯著高于空白對(duì)照組(P<0.01)，絞股藍(lán)皂苷預(yù)處理后，TNF-α、IL-1β和IL-6表達(dá)水平均顯著低于LPS模型組(P<0.01)(圖3)。

2.4 絞股藍(lán)皂苷預(yù)處理對(duì)LPS誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞內(nèi)NF-κB信號(hào)通路的影響

LPS可導(dǎo)致p-p65的蛋白水平上調(diào)，但t-p65蛋白水平保持不變，提示NF-κB信號(hào)通路受到了活化，不同劑量的絞股藍(lán)皂苷預(yù)處理后，可以劑量依賴性的下調(diào)p-p65的蛋白水平(圖4)。

*P<0.01 compared with control圖1 不同劑量LPS刺激對(duì)PC12細(xì)胞中TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA水平的影響

*P<0.01 compared with control; #P<0.01 compared with LPS treatment alone圖2 CCK-8法檢測(cè)PC12細(xì)胞活力的變化Fig 2 Change of PC12 cell viability detected by CCK-8 assay n=4)

3 討論

LPS誘導(dǎo)的大鼠腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細(xì)胞瘤PC12細(xì)胞炎性反應(yīng)模型被國(guó)內(nèi)外多家實(shí)驗(yàn)室用來(lái)研究神經(jīng)元炎性損傷的研究。例如，基于該細(xì)胞模型評(píng)價(jià)了新型環(huán)氧合酶2抑制劑對(duì)神經(jīng)炎性反應(yīng)的抑制作用[8]。利用該模型評(píng)價(jià)了天然產(chǎn)物樟芝多糖對(duì)神經(jīng)細(xì)胞炎性反應(yīng)的調(diào)節(jié)作用[9]。在本實(shí)驗(yàn)體系中，LPS也同樣可以對(duì)PC12細(xì)胞造成細(xì)胞活力下降、炎性因子上調(diào)等損傷性反應(yīng)，進(jìn)一步證明該細(xì)胞模型的穩(wěn)定性和可重復(fù)性，為進(jìn)一步研究絞股藍(lán)皂苷預(yù)處理對(duì)神經(jīng)元炎性損傷的影響奠定了良好基礎(chǔ)。

*P<0.01 compared with control; #P<0.01 compared with LPS treatment alone圖3 GP預(yù)處理對(duì)PC12細(xì)胞中炎性因子TNF-α、IL-1β和IL-6 mRNA水平的影響

*P<0.05 compared with control; #P<0.05 compared with LPS treatment alone圖4 絞股藍(lán)皂苷預(yù)處理對(duì)LPS誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞內(nèi)NF-κB信號(hào)通路的影響Fig 4 Effect of GP on the activity of NF-κB signaling pathway in PC12 cells stimulated by LPS n=3)

LPS作為一種細(xì)菌內(nèi)毒素可以激活許多與炎性反應(yīng)發(fā)生相關(guān)的細(xì)胞，引起炎性因子的合成以及釋放，最終導(dǎo)致生物體全身炎性反應(yīng)的發(fā)生。LPS首先與細(xì)胞膜表面的Toll樣受體-4(Toll-like receptor 4, TLR4)結(jié)合，然后激活胞質(zhì)內(nèi)IKK/NF-κB信號(hào)通路，進(jìn)而調(diào)節(jié)多種細(xì)胞因子的表達(dá)[10]。在LPS誘導(dǎo)的大鼠炎性反應(yīng)和記憶障礙模型中，絞股藍(lán)皂苷預(yù)處理能夠降低海馬中促炎因子的水平，該作用與其降低誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS)和 TLR4水平有關(guān)[11]。在本研究中，發(fā)現(xiàn)絞股藍(lán)皂苷能夠抑制PC12細(xì)胞內(nèi)LPS所誘導(dǎo)的NF-κB信號(hào)通路，同時(shí)降低TNF-α、IL-1β和IL-6等炎性因子的mRNA水平，從而產(chǎn)生抗炎活性。

神經(jīng)炎性反應(yīng)是多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的主要原因，例如腦外傷、缺血性中風(fēng)和阿爾茨海默病。炎性小體誘導(dǎo)先天性免疫應(yīng)答、建立腦內(nèi)慢性炎性反應(yīng)環(huán)境、引起神經(jīng)元功能障礙并最終導(dǎo)致神經(jīng)變性[12]。因此，新型抗炎藥物的研究成為當(dāng)前有關(guān)神經(jīng)退行性疾病的研究熱點(diǎn)。本研究證實(shí)了絞股藍(lán)皂苷預(yù)處理能夠拮抗LPS導(dǎo)致的PC12細(xì)胞炎性損傷，表現(xiàn)在一是LPS所導(dǎo)致的細(xì)胞活力下降得到了恢復(fù)，二是LPS誘導(dǎo)的TNF-α、IL-1β和IL-6等炎性細(xì)胞因子表達(dá)上升得到了抑制。此外，絞股藍(lán)皂苷對(duì)低氧性腦損傷具有保護(hù)作用[13]。以上研究結(jié)果表明絞股藍(lán)皂苷在神經(jīng)系統(tǒng)疾病的防治中具有良好的應(yīng)用前景。

志謝：感謝中國(guó)科學(xué)院蘭州化學(xué)物理研究所楊軍麗教授提供的絞股藍(lán)皂苷。