周小鈺，王曉月

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院 生物化學(xué)與分子生物學(xué)系，北京 100005)

在已知的人類致病遺傳變異中，約50%是由單個核苷酸突變引起的[1]，因此，開發(fā)高效的點突變糾正工具是人類遺傳疾病研究和治療的重要目標。目前，單堿基編輯技術(shù)將Cas9蛋白與脫氨酶結(jié)合，可以在sgRNA的引導(dǎo)下對基因組靶位點進行單核苷酸突變[2]，其中腺嘌呤堿基編輯器(ABE)能將靶位點的腺嘌呤(A)轉(zhuǎn)變?yōu)轼B嘌呤(G)[3]。該技術(shù)不會引起DNA雙鏈斷裂[2]，具有更高的安全性。

然而單堿基編輯技術(shù)也存在一定的局限性：首先，最常用的SpCas9蛋白識別靶位點時必須首先識別NGG PAM序列[4]，極大的限制了其應(yīng)用范圍。其次，編輯效率較低也是阻礙該技術(shù)在基因治療領(lǐng)域發(fā)揮作用的重要因素[5]。本研究所采用的PAM-less ABE[6]在SpCas9蛋白上進行了突變使其幾乎不受PAM序列的限制，擴大了在基因組的編輯范圍。在此基礎(chǔ)上通過對ABE其他元件如脫氨酶和連接肽進行替換改造，在基因組上非NGG PAM的位點進行編輯效率驗證實驗，從中初步評估ABE的編輯效率。

1 材料與方法

1.1 材料

HEK 293T人胚腎細胞系(國家生物醫(yī)學(xué)實驗細胞資源庫)；DMEM高糖培養(yǎng)基(Hyclone公司)；gRNA序列(擎科生物科技公司)；NeofectTM轉(zhuǎn)染試劑(零客創(chuàng)智公司)；lentiGuide-Puro 載體、pCMV-T7-ABEmax(7.10)-SpRY-P2A-EGFP載體(簡稱為SpRY-ABEmax)(Addgene公司)；胎牛血清(Gibco公司)；Opti-MEM(Life公司)；Tryptone、Yeast Extract(OXOIO公司)；Agar(鼎國昌盛公司)；Trans5α 化學(xué)感受態(tài)細胞(全式金生物技術(shù)公司)； FastAP、MluⅠ、BglⅡ、BsmBⅠ(Thermo Scientific公司)；T4 DNA Ligase、T4 PNK、Gibson Assembly? Master Mix、NEBNext? UltraTMⅡ Q5? Master Mix(NEB公司)； 瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、DNA maker D2000、質(zhì)粒提取試劑盒、基因組DNA提取試劑盒(上海天根生化科技公司)。

1.2 方法

1.2.1 PAM-less ABE的改造：首先利用MluⅠ和BglⅡ雙酶切SpRY-ABEmax載體,膠回收大片段為載體骨架，然后通過克隆突變得到Tad-8e，退火合成PAPAPA連接肽。利用重疊延伸 PCR將各片段連接，通過Gibson 組裝將片段和載體骨架連接成環(huán)并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細胞，挑單克隆進行Sanger 測序驗證組裝是否正確，提取成功組裝的質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染HEK 293T細胞， 48 h后觀察綠色熒光蛋白表達情況以檢驗ABE在細胞中是否表達。

1.2.2 sgRNA 表達載體克隆構(gòu)建：將lentiGuide-Puro 載體的scaffold部分改造以提升sgRNA轉(zhuǎn)錄效率，具體方法見參考文獻[7]。使用BsmBⅠ酶切l(wèi)entiGuide-Puro，保留大片段作為載體骨架，將sgRNA的兩條oligo退火和磷酸化，使用T4連接酶lentiGuide-Puro載體骨架與sgRNA片段連接，轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細胞并挑單克隆進行Sanger測序，提取成功連接sgRNA的質(zhì)粒(表1)。

表1 不同基因組位點的sgRNA序列Table 1 sgRNA sequences at different genomic sites

1.2.3 ABE和sgRNA表達質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK 293T細胞：取60萬HEK 293T細胞鋪于6孔板，第2天觀察當(dāng)細胞匯合至90%時進行下一步實驗。在1.5 mL EP管內(nèi)添加 200 μL Opti-MEM培養(yǎng)基，每管加入2.5 μg ABE表達質(zhì)粒和1.5 μg sgRNA表達質(zhì)粒并加入4 μL NeofectTM轉(zhuǎn)染試劑，混勻室溫放置30 min后加入6孔板。轉(zhuǎn)染24 h后加入1.5μg/mL的嘌呤霉素并于72 h后流式分選表達綠色熒光蛋白的細胞，將其凍存于負80或立即進行實驗。

1.2.4 提取細胞基因組并使用PCR擴增技術(shù)在預(yù)期產(chǎn)生編輯的位點進行擴增和Sanger測序：使用BEAT工具[8]對Sanger測序的.ab1格式文件進行分析預(yù)估各版本ABE在同一編輯位點的編輯效率，每組設(shè)置兩次或3次重復(fù)實驗(表2)。

表2 PCR所用引物的序列Table 2 Sequence of primers used in PCR

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 PAM-less ABE轉(zhuǎn)染HEK 293T細胞的編輯效果

在基因組上PAM序列為GCTG的位點進行A到G的編輯，Sanger測序結(jié)果顯示在第3位和第5位(前間隔序列protospacer的第1位至第20位為sgRNA與基因組DNA互補序列)的編輯效率分別為32.5%、70.5%(圖1)。

2.2 PAM-less ABE的改造及驗證

以SpRY-ABEmax為初始版本，在此基礎(chǔ)上替換Tad-8e脫氨酶和PAPAPA連接肽分別構(gòu)建SpRY-ABE8e和SpRY-ABE8e-PAPAPA(圖2A)，將各版本PAM-less ABE分別轉(zhuǎn)染HEK 293T細胞，48 h后熒光顯微鏡下觀察，帶有綠色熒光的細胞即為表達PAM-less ABE的細胞(圖2B)。

2.3 改造各版本PAM-less ABE編輯效率的比較

與對照組SpRY-ABEmax相比：1)SpRY-ABE8e在PAM序列為GACT和CAAC位點的編輯效率提升，編輯窗口也擴大；2)SpRY-ABE8e-PAPAPA提升了這兩個基因組位點的中心位置(GACT-6A或CAAC-5A)的編輯效率，同時編輯窗口內(nèi)的旁編輯情況相較于SpRY-ABE8e降低(圖3)；3)SpRY-ABE8e-PAPAPA在基因組PAM序列為GACG的兩個位點的整體編輯效率更高(圖4)。

2.4 PAM-less ABE對Clinvar致病突變位點的編輯效果

SpRY-ABEmax在Clinvar數(shù)據(jù)庫中BRCA1:p.L1705P和BRCA2:p.D189G兩個位點的編輯效率分別為53%和26%，SpRY-ABE8e-PAPAPA在對應(yīng)兩個位點的編輯效率分別為60%和35%(圖5)。

protospacer (black and red) and PAM (blue) sequences are located above the histogram; target As are indicated in redwithin the protospacer

圖2 各版本PAM-less ABE的構(gòu)建 (A)和轉(zhuǎn)染HEK 293T細胞的綠色熒光蛋白表達驗證(B)

protospacer (black and red) and PAM (blue) sequences are located above the histogram; target As are indicated in red within the protospacer;*P<0.05 compared with SpRY-ABEmax

protospacer (black and red) and PAM (blue) sequences are located above the histogram; target As are indicated in red within the protospacer;*P<0.05 compared with SpRY-ABEmax

*P<0.05 compared with SpRY-ABEmax圖5 PAM-less ABEs 在BRCA1和BRCA2基因上構(gòu)造致病突變的編輯效率Fig 5 Base editing efficiency of PAM-less ABEs to construct pathogenic mutations in BRCA1

3 討論

基于CRISPR-Cas系統(tǒng)的單堿基編輯技術(shù)可以直接在細胞基因組內(nèi)實現(xiàn)單個堿基的轉(zhuǎn)換類突變，這種方式避免了DNA雙鍵斷裂可能對細胞基因組造成的損傷[8]。但由于PAM序列識別位點的限制，目前主流的堿基編輯器受到NGG PAM序列的限制，只有當(dāng)靶位點下游13～17 bp范圍內(nèi)存在NGG PAM序列時才能進行編輯，限制了應(yīng)用范圍[4]。本研究中的SpCas9變體SpRY幾乎不受PAM序列限制，擴大了基因組的編輯范圍[6]。然而ABEmax編輯效率較低[9]，因此需要對其進行改造來提升編輯效率以實現(xiàn)更多的應(yīng)用。

本研究首先驗證了SpRY-ABEmax能對非NGG PAM的基因組位點進行編輯，然后嘗試替換活性較高的腺嘌呤脫氨酶來改造新版本的PAM-less ABE。根據(jù)已有研究顯示，最新的ABE8e 進行脫氨的速率快了大約1 100倍[10]，在本研究中將ABE8e與SpRY進行組合構(gòu)建SpRY-ABE8e并與sgRNA表達質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK 293T細胞，通過對幾個非NGG PAM的基因組位點進行編輯效率驗證實驗發(fā)現(xiàn)：相較于SpRY-ABEmax，SpRY-ABE8e提升了對應(yīng)基因組位點的編輯效率，但ABE-8e的高活性導(dǎo)致了編輯窗口擴大，從而產(chǎn)生更多的旁編輯，考慮到這個問題，根據(jù)之前的一項研究，縮短連接肽會在一定程度上限制編輯窗口[11]，因此本研究采用了PAPAPA連接肽構(gòu)建SpRY-ABE8e-PAPAPA，在一定程度上保持了中心位點編輯效率的同時限制了ABE8e的編輯范圍，進一步將該版本ABE應(yīng)用在ClinVar致病位點的編輯上[12]，結(jié)果顯示相較于對照組，SpRY-ABE8e-PAPAPA提升了對應(yīng)位點的編輯效率。本研究所改造的PAM-less ABE有助于進一步對人類單核苷酸變異位點進行研究，由于突破了PAM序列的限制，可以在更多基因組位點進行疾病模型的構(gòu)建或疾病治療模型的構(gòu)建，在基因治療領(lǐng)域有廣闊的前景。

綜上所述，本研究證實通過替換活性更高的脫氨酶Tad8e可提升編輯效率；進一步可縮短脫氨酶與SpRY蛋白之間的連接肽來限制編輯窗口。該研究為今后基礎(chǔ)研究和基因治療應(yīng)用提供了更多選擇的堿基編輯工具。