趙鈺珊，冀夢(mèng)蝶，董昱誠(chéng)，郭 鑫，宋博淵，陳 陽(yáng)

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院 生物化學(xué)與分子生物學(xué)系醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京 100005)

肝癌是一種具有高致死率的侵襲性惡性腫瘤，是世界多地區(qū)癌相關(guān)死亡的主要原因之一[1]。據(jù)中國(guó)癌癥中心數(shù)據(jù)顯示，肝癌占中國(guó)2015年新發(fā)惡性腫瘤的9.4%，中國(guó)肝癌患者的生存期在23個(gè)月左右，是嚴(yán)重影響中國(guó)國(guó)民健康的惡性腫瘤之一[2]。

肝細(xì)胞癌是中國(guó)原發(fā)性肝癌中最常見(jiàn)的一類[3]。隨著測(cè)序成本的降低和對(duì)肝細(xì)胞癌研究的逐漸深入，越來(lái)越多的肝細(xì)胞癌公共數(shù)據(jù)可供使用，為基于生物信息學(xué)方法開(kāi)展肝細(xì)胞癌發(fā)病機(jī)制與診治靶點(diǎn)研究建立基礎(chǔ)。近期已有研究使用TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中的公共數(shù)據(jù)對(duì)肝細(xì)胞癌中特定基因的預(yù)后進(jìn)行詳細(xì)分析[4]，也有研究通過(guò)多組學(xué)數(shù)據(jù)分析肝細(xì)胞癌的分子驅(qū)動(dòng)因素和潛在生物標(biāo)志物[5]。然而，對(duì)于肝細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中表觀遺傳調(diào)控改變的機(jī)制仍有待深入研究。

Zeste 同源蛋白2 增強(qiáng)子(enhancer of zeste homolog 2，EZH2)基因編碼一種組蛋白賴氨酸N-甲基轉(zhuǎn)移酶，主要參與組蛋白甲基化，與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[6]。因此，本研究首先基于TCGA公共數(shù)據(jù)分析了EZH2基因表達(dá)與肝細(xì)胞癌進(jìn)展及預(yù)后之間的關(guān)系；隨后，在細(xì)胞水平檢測(cè)了EZH2抑制劑對(duì)癌細(xì)胞活性和增殖的影響；之后，分析了TCGA肝細(xì)胞癌公共數(shù)據(jù)中EZH2高表達(dá)組和低表達(dá)組之間的差異表達(dá)基因；最后，結(jié)合表觀遺傳數(shù)據(jù)和生物學(xué)實(shí)驗(yàn)研究了EZH2介導(dǎo)基因組表觀遺傳改變、影響下游基因表達(dá)的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 肝細(xì)胞癌相關(guān)公共數(shù)據(jù)收集：從TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)(https://portal.gdc.cancer.gov/)中下載肝細(xì)胞癌樣本數(shù)據(jù)374例，包括轉(zhuǎn)錄物組信息和臨床信息。所需肝細(xì)胞癌細(xì)胞系HepG2 RNA-seq數(shù)據(jù)來(lái)源：ENCOD(https://portal.gdc.cancer.gov/)數(shù)據(jù)號(hào)ENCFF008CDN和ENCFF816EIE。所需肝細(xì)胞癌細(xì)胞系HepG2的ChIP-seq數(shù)據(jù)來(lái)源均為ENCODE，EZH2ChIP-seq數(shù)據(jù)號(hào)：ENCFF559YWA；H3K27me3 ChIP-seq 數(shù)據(jù)號(hào)：ENCFF893XHX；H3K4me3 ChIP-seq 數(shù)據(jù)號(hào)：ENCFF500VAH；H3K27ac ChIP-seq 數(shù)號(hào)：ENCFF764VYK；EZH2ChIP-seq narrowPeak bed數(shù)據(jù)號(hào)：ENCFF521AKL。

1.1.2 細(xì)胞系：人肝細(xì)胞癌細(xì)胞系HepG2(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞資源中心)。

1.1.3 試劑及試劑盒：EZH2抑制劑GSK343(Selleck公司)；CellTiter-Glo?發(fā)光法細(xì)胞活力檢測(cè)試劑盒(Promega公司，G7570)；所需引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 臨床特征統(tǒng)計(jì)、基因表達(dá)與預(yù)后分析：將從 TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中下載的肝細(xì)胞癌樣本數(shù)據(jù)根據(jù)其性別、年齡和分期等臨床特征進(jìn)行分類統(tǒng)計(jì)，用K-W檢驗(yàn)分析EZH2基因表達(dá)與肝細(xì)胞癌不同腫瘤分期之間的關(guān)系。根據(jù)EZH2基因的中位表達(dá)值，將數(shù)據(jù)庫(kù)中的肝細(xì)胞癌臨床樣本分為EZH2高表達(dá)組(n=187)和EZH2低表達(dá)組(n=187)，用Log Rank檢驗(yàn)分析EZH2高表達(dá)組和EZH2低表達(dá)組與預(yù)后之間的關(guān)系。

1.2.2 差異表達(dá)基因篩選和功能分析：用Limma生物信息軟件[7]，比較EZH2高表達(dá)和EZH2低表達(dá)組之間的差異表達(dá)基因。當(dāng)差異表達(dá)基因同時(shí)滿足P<0.05且log2(FC)的絕對(duì)值>1 時(shí)，定義為EZH2高表達(dá)組和EZH2低表達(dá)組之間的差異表達(dá)基因，同時(shí)選取差異表達(dá)最顯著的前20個(gè)上調(diào)基因和前20個(gè)下調(diào)基因制成熱圖。用Clusterprofiler生物信息軟件分析得到GO功能富集KEGG通路[8]。

1.2.3 細(xì)胞活性和細(xì)胞增殖能力檢測(cè)：常規(guī)培養(yǎng)肝細(xì)胞癌細(xì)胞系HepG2，實(shí)驗(yàn)組加入EZH2抑制劑GSK343(10 μmol/L)，空白對(duì)照組加入0.9% NaCl，每組重復(fù)3次。用三磷酸腺苷檢測(cè)法(ATP法)檢測(cè)加入GSK343后12、24、36、48 h的細(xì)胞活性，每組重復(fù)3次。用結(jié)晶紫染色法檢測(cè)加入GSK343后48 h的細(xì)胞系增殖情況，每組重復(fù)3次。

1.2.4EZH2基因相關(guān)的表觀遺傳特征分析：從ENCODE數(shù)據(jù)庫(kù)中下載肝細(xì)胞癌細(xì)胞系HepG2的EZH2ChIP-seq數(shù)據(jù)，從narrow Peak bed文件中獲得EZH2在基因組上的結(jié)合位置，其中有1 431個(gè)編碼基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(transcription start site，TSS)上下游5 kb存在EZH2的信號(hào)峰。之后進(jìn)一步分析這1 431個(gè)編碼基因是否在EZH2高表達(dá)組和EZH2低表達(dá)組之間存在基因差異表達(dá)。用deepTools軟件[9]可視化EZH2和組蛋白修飾的TSS共定位情況。用python軟件包trackC工具分析與EZH2相關(guān)的表達(dá)下調(diào)基因ADRA1A的表觀遺傳特征。

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析基因表達(dá)：為驗(yàn)證EZH2是否影響下游靶基因ADRA1A的表達(dá)，在肝細(xì)胞癌細(xì)胞系HepG2中加入EZH2抑制劑后，用Trizol法提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，用RT-qPCR檢測(cè)EZH2及其下游靶基因ADRA1A的表達(dá)，每組重復(fù)3次，RT-qPCR引物見(jiàn)表1。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列Table 1 Primer sequences of real-time quantitative PCR

2 結(jié)果

2.1 EZH2基因表達(dá)與肝細(xì)胞癌臨床數(shù)據(jù)聯(lián)合分析及抑制實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

本研究使用生物信息學(xué)方法分析發(fā)現(xiàn)在TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)的肝細(xì)胞癌臨床樣本中，EZH2基因表達(dá)量在1～3期逐漸升高(P<0.05)，在4期中表達(dá)量相對(duì)降低(圖1A)。依據(jù)EZH2的基因表達(dá)量將TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)的肝細(xì)胞癌臨床樣本分組為EZH2高表達(dá)組和低表達(dá)組(表2)。生存分析發(fā)現(xiàn)EZH2基因高表達(dá)組患者的生存期顯著低于EZH2低表達(dá)組(P<0.05)(圖1B)。

表2 TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中374個(gè)肝細(xì)胞癌患者臨床特征

A.EZH2 gene expression levels in different stages of hepatocellular carcinoma(P<0.05); B.prognostic correlation of EZH2 expression in different stages of hepatocellular carcinoma patients，*P<0.05 compared with EZH2-Low; C.detection of cell activity in normal control group and inhibitor group，*P<0.05 compared with violet staining of cells in normal control group and inhibitor group(×60，scale bar=1 mm)

在生物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證中，使用EZH2抑制劑GSK343(10 μmol/L)處理肝細(xì)胞癌細(xì)胞系HepG2。藥物處理36 h后抑制劑組的細(xì)胞活性顯著低于對(duì)照組(P<0.05)(圖1C)。結(jié)晶紫實(shí)驗(yàn)表明，藥物處理48 h后實(shí)驗(yàn)組的HepG2細(xì)胞數(shù)量降低(圖1D)。

2.2 EZH2表達(dá)水平相關(guān)的肝細(xì)胞癌差異表達(dá)基因

使用生物信息學(xué)分析方法，將TCGA樣本中EZH2高表達(dá)組與低表達(dá)組相比，從中篩選出1 848個(gè)顯著差異表達(dá)基因，其中1 721個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，127個(gè)基因表達(dá)下調(diào)(圖2A)。熱圖中顯示了差異表達(dá)最顯著的前20個(gè)上調(diào)基因和前20個(gè)下調(diào)基因的表達(dá)(圖2B)。對(duì)這些基因的功能富集分析發(fā)現(xiàn)，它們主要富集在應(yīng)答外源刺激、細(xì)胞周期調(diào)控等功能和信號(hào)通路上(圖2C～D)。

2.3 肝細(xì)胞癌中EZH2相關(guān)的表觀遺傳修飾特征

使用ENCODE公共數(shù)據(jù)和生物信息學(xué)分析方法，本研究發(fā)現(xiàn)在全基因組水平EZH2有2 979個(gè)信號(hào)位于1 431個(gè)TSS的上下游5 kb內(nèi)。在全基因組水平隨機(jī)選取1 431個(gè)TSS上下游5 kb內(nèi)沒(méi)有EZH2結(jié)合，但H3K27ac、H3K4me3、H3K27me3三者中至少有一個(gè)信號(hào)的TSS區(qū)域，與EZH2結(jié)合的TSS進(jìn)行表觀遺傳修飾特征對(duì)比分析，發(fā)現(xiàn)有EZH2結(jié)合的TSS附近富集H3K27me3信號(hào)，同時(shí)缺少H3K27ac信號(hào)(圖3A)；上下游5 kb沒(méi)有EZH2結(jié)合的TSS附近H3K27me3信號(hào)顯著降低(圖3B)。

2.4 EZH2介導(dǎo)基因組表觀遺傳改變影響下游基因表達(dá)

通過(guò)生物信息學(xué)分析，本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)在上述1 431個(gè)有EZH2結(jié)合在轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)附近的基因中，有163個(gè)基因也同時(shí)在TCGA樣本的EZH2高表達(dá)組和EZH2低表達(dá)組之間差異表達(dá)。其中在基因ADRA1A的TSS附近存在顯著的EZH2結(jié)合信號(hào)和較高的H3K27me3信號(hào)(圖4A)。

A.differential gene expression volcano plot between EZH2 high expression group and EZH2 low expression group (P< 0.05, log2 (FC)>1); B.the heatmap shows the top 20 EZH2 differentially associated up-regulated genes and the top 20 down-regulated genes, with red indicating high expression group and green indicating low expression group; C.GO functional analysis of differentially expressed genes; D.analysis of differentially expressed genes KEGG signaling pathway

通過(guò)生物實(shí)驗(yàn)，本研究發(fā)現(xiàn)使用EZH2抑制劑GSK343處理HepG2細(xì)胞48 h后，EZH2的mRNA水平與對(duì)照組相比沒(méi)有顯著變化，但ADRA1A的mRNA水平與對(duì)照組相比顯著上升(P<0.05)(圖4B～C)。

3 討論

EZH2作為組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶，可以通過(guò)組蛋白甲基化的表觀遺傳修飾影響染色質(zhì)結(jié)構(gòu)，抑制下游靶基因表達(dá)[10]，調(diào)節(jié)肝臟代謝和肝纖維化，調(diào)控肝細(xì)胞癌發(fā)病過(guò)程，在肝細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要的作用[11]。本研究通過(guò)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)EZH2在肝細(xì)胞癌1～3期中異常高表達(dá)，生物學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明EZH2抑制劑GSK343可以在體外抑制HepG2的細(xì)胞活性和細(xì)胞增殖。上述結(jié)果有助于為肝細(xì)胞癌靶向治療提供一定實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

本研究通過(guò)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)EZH2可以介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)附近組蛋白H3K27me3修飾增加，從而發(fā)揮表觀遺傳調(diào)控作用，影響下游基因表達(dá)。同時(shí)，近期也有研究表明ADRA1A基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的高甲基化會(huì)促進(jìn)肝細(xì)胞癌的發(fā)生，是肝細(xì)胞癌診斷過(guò)程中的潛在生物標(biāo)志物[12]。因此， 在后續(xù)研究中將進(jìn)一步探討EZH如何通過(guò)介導(dǎo)組蛋白H3K27me3修飾，影響ADRA1A基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的DNA甲基化。

A.histone modification ±5 kb of the TSS of 1 431 genes with EZH2 binding sites; B.histone modification ±5 kb of the TSS of 1431 genes without EZH2 binding sites

A.ChIP-seq and RNA-seq signal of ADRA1A gene; B.EZH2 mRNA expression levels in normal control(NC) and inhibitor GSK343 groups; C.ADRA1A mRNA expression levels in normal control(NC) and inhibitor GSK343 groups; *P<0.05 compared with NC group

綜上所述， 本研究結(jié)合肝細(xì)胞癌公共多組學(xué)數(shù)據(jù)分析和生物實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)了EZH2基因表達(dá)水平可以為肝細(xì)胞癌病程進(jìn)展和預(yù)后判斷提供一定依據(jù)；EZH2能夠通過(guò)特異的表觀遺傳調(diào)控機(jī)制影響下游基因表達(dá)，研究結(jié)果為進(jìn)一步篩選肝細(xì)胞癌生物標(biāo)志物、開(kāi)發(fā)治療方法提供了一定實(shí)驗(yàn)依據(jù)。