于 莉，張 敏，張小華，李麗華（儋州市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，海南儋州 571799）

膿毒癥是由感染、創(chuàng)傷、手術(shù)等引起的全身炎癥反應(yīng)綜合征，在老年人中有著極高的發(fā)病率和死亡率，是目前世界范圍內(nèi)威脅人類(lèi)健康的主要疾病之一[1]。微小核糖核酸（microRNA，miRNA）作為一類(lèi)長(zhǎng)度為18～24bp的非編碼RNA分子，參與組織炎癥損傷等病理過(guò)程，在膿毒癥的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后判斷中發(fā)揮著重要的作用[2-3]。近年來(lái)有研究指出，miR-206及miR-451通過(guò)多種方式調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答，對(duì)膿毒癥的發(fā)生發(fā)展有重要影響，有望為膿毒癥的治療提供新方向[4-5]。然而，目前還沒(méi)有老年膿毒癥決定性的診斷或預(yù)后生物標(biāo)志物。為此，本研究通過(guò)檢測(cè)老年膿毒癥患者第1，3和7天血清miR-206及miR-451表達(dá)水平變化，分析其對(duì)老年膿毒癥患者嚴(yán)重程度及預(yù)后判斷的價(jià)值，為了解miR-206及miR-45是否可能是老年膿毒癥的有用生物標(biāo)志物。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2018年1月～2020年12月儋州市人民醫(yī)院收治的158例老年膿毒癥患者，其中男性93例，女性65例，年齡60～82（70.83±9.52）歲。根據(jù)國(guó)際嚴(yán)重膿毒癥及膿毒性休克診療指南[6]，將158例膿毒癥患者分為膿毒癥非休克組（n=94）和膿毒癥休克組（n=64）。以158例膿毒癥患者住院當(dāng)天為研究起始點(diǎn)，根據(jù)患者28天的生存情況，將其分為存活組（n=115）和死亡組（n=43）。死亡時(shí)間為15.30±10.20天，死亡原因?yàn)樾菘?、多器官功能衰竭、腎衰竭、心力衰竭及呼吸衰竭。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合國(guó)際嚴(yán)重膿毒癥及膿毒性休克診療指南；②住院時(shí)間≥7天。排除標(biāo)準(zhǔn)：①并發(fā)血液系統(tǒng)疾病、自身免疫性疾病及惡性腫瘤者；②不能配合研究者。膿毒癥非休克組和膿毒癥休克組的性別、年齡及基礎(chǔ)疾病等一般資料比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。

1.2 儀器與試劑 7300型熒光定量PCR儀（美國(guó)ABI公司），PCR試劑盒、RNeasy試劑盒、miRNA Easy試劑盒和Trizol試劑盒均購(gòu)自北京奧科生物有限公司。

1.3 方法 所有患者于住院第1，3和7天采集靜脈血3 ml離心分離血清，使用ABI 7300型熒光定量PCR儀進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(RTPCR)。以U6為實(shí)驗(yàn)內(nèi)參，PCR總反應(yīng)體系為20 μl：1μl 引物及探針Mix（20×），10μl TaqMan通用混合物溶液（2×），1.33 μl反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA，7.67μl雙蒸水；反應(yīng)條件：95℃變性15 s，60℃退火60 s，72℃延伸60s，進(jìn)行45個(gè)循環(huán)。采用2-△△Ct法計(jì)算結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)。應(yīng)用受試者工作特征（ROC）曲線分析miR-206及miR-451預(yù)測(cè)老年膿毒癥患者死亡的價(jià)值。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 膿毒癥休克組和膿毒癥非休克組血清miR-206及miR-451表達(dá)水平比較 見(jiàn)表1。膿毒癥休克組第1，3，7天血清miR-206及miR-451表達(dá)水平均明顯高于膿毒癥非休克組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）。

表1 膿毒癥休克組和非休克組血清miR-206及miR-451表達(dá)水平比較（±s）

表1 膿毒癥休克組和非休克組血清miR-206及miR-451表達(dá)水平比較（±s）

項(xiàng)目 膿毒癥非休克組（n=94） 膿毒癥休克組（n=64） t P miR-206 第1天 2.62±1.05 4.28±1.60 13.512 ＜0.01第3天 3.15±1.40 5.63±2.19 16.715 ＜0.01第7天 2.96±1.27 6.05±2.58 19.630 ＜0.01 miR-451 第1天 1.93±0.86 3.08±1.42 10.417 ＜0.01第3天 2.46±1.02 4.27±1.53 14.615 ＜0.01第7天 2.30±0.95 4.93±1.80 16.804 ＜0.01

2.2 膿毒癥死亡組和膿毒癥存活組血清miR-206及miR-451表達(dá)水平比較 見(jiàn)表2。死亡組第1，3，7天血清miR-206及miR-451表達(dá)水平均明顯高于存活組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）。

表2 膿毒癥死亡組和存活組血清miR-206及miR-451表達(dá)水平比較（±s）

表2 膿毒癥死亡組和存活組血清miR-206及miR-451表達(dá)水平比較（±s）

項(xiàng)目 存活組（n=115） 死亡組（n=43） t P miR-206 第1天 2.50±0.97 4.45±1.66 14.730 ＜0.01第3天 2.90±1.35 6.12±2.64 20.153 ＜0.01第7天 2.83±1.31 6.37±2.71 22.814 ＜0.01 miR-451 第1天 1.80±0.81 3.35±1.48 12.506 ＜0.01第3天 2.17±0.92 4.70±1.72 16.375 ＜0.01第7天 2.05±0.86 5.37±1.80 20.748 ＜0.01

2.3 miR-206及miR-451預(yù)測(cè)老年膿毒癥患者死亡的價(jià)值 見(jiàn)表3和圖1，圖2，圖3。在單項(xiàng)指標(biāo)中，第3天miR-206最佳截值取4.52時(shí)，其預(yù)測(cè)老年膿毒癥患者死亡的敏感度和特異度較好，分別為82.7%和88.0%。第3天miR-206及miR-451兩項(xiàng)聯(lián)合預(yù)測(cè)老年膿毒癥患者死亡的曲線下面積（0.936，95%CI ：0.877～0.994）明顯高于單項(xiàng)miR-206（0.853，95% CI ：0.794～0.915）及miR-451（0.828，95%CI ：0.770～0.884），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其敏感度和特異度為97.2%和86.0%。

圖3 miR-206及miR-451兩項(xiàng)聯(lián)合預(yù)測(cè)老年膿毒癥患者死亡的ROC曲線

表3 miR-206及miR-451預(yù)測(cè)老年膿毒癥患者死亡的價(jià)值 （%）

圖1 血清miR-206表達(dá)水平預(yù)測(cè)老年膿毒癥患者死亡的ROC曲線

3 討論

膿毒癥是一種免疫反應(yīng)失調(diào)的危重癥，影響全球人類(lèi)生命健康。miRNA是一類(lèi)基因表達(dá)的重要調(diào)控因子，參與調(diào)控細(xì)胞增生、凋亡、免疫炎性反應(yīng)等多種機(jī)體生物學(xué)過(guò)程，在膿毒癥相關(guān)性炎癥反應(yīng)以及器官損傷過(guò)程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用[7-8]。LI等[9]研究證實(shí)，miRNA表達(dá)水平的變化與膿毒癥病程發(fā)展密切相關(guān)，監(jiān)測(cè)分析miRNA水平有助于輔助診斷膿毒癥，判斷疾病預(yù)后，有望作為膿毒癥治療的潛在靶點(diǎn)。ROGOBETE等[10]研究認(rèn)為，miRNA是一類(lèi)內(nèi)源性非編碼RNA，通過(guò)調(diào)控炎癥信號(hào)通路中關(guān)鍵分子的表達(dá)，參與調(diào)控膿毒癥的炎癥反應(yīng)及免疫抑制，在膿毒癥診斷和預(yù)后評(píng)估中具有較大的潛力。

本研究膿毒癥休克組第1，3，7天血清miR-206及miR-451表達(dá)水平均明顯高于膿毒癥非休克組；死亡組第1，3，7天血清miR-206及miR-451表達(dá)水平均明顯高于存活組。說(shuō)明血清miR-206及miR-451表達(dá)水平在膿毒癥休克患者早期即可明顯升高，其水平變化可在一定程度上反映膿毒癥患者的病情嚴(yán)重程度，死亡患者引起的炎癥反應(yīng)無(wú)法得到有效地控制，血清miR-206及miR-451表達(dá)水平顯著升高。提示miR-206及miR-451高表達(dá)的患者，病情較為嚴(yán)重，臨床上應(yīng)及時(shí)采取有效的治療措施。GUI等[11]研究顯示，隨著膿毒癥患者病情加重，miRNA表達(dá)水平逐漸升高，提示miRNA表達(dá)與膿毒癥患者病情嚴(yán)重程度相關(guān)，是反映膿毒癥患者病情嚴(yán)重程度的新型指標(biāo)。SZILáGYI等[12]研究表明，miRNA的異常表達(dá)與膿毒癥的臨床特征和預(yù)后相關(guān)，可以作為膿毒癥潛在的診斷和預(yù)后的生物標(biāo)志物，為膿毒癥基因水平治療提供新的思路。

本研究ROC曲線顯示，不同時(shí)間點(diǎn)血清miR-206及miR-451表達(dá)水平預(yù)測(cè)老年膿毒癥患者死亡的曲線下面積不同，第3天miR-206及miR-451兩項(xiàng)聯(lián)合預(yù)測(cè)老年膿毒癥患者死亡的曲線下面積最大，對(duì)預(yù)測(cè)老年膿毒癥患者死亡的價(jià)值較高。LIANG等[13]研究指出，與健康人相比，膿毒癥患者miR-206顯著上調(diào)，血清miR-206的表達(dá)與膿毒癥的嚴(yán)重程度及預(yù)后呈正相關(guān)，可能是評(píng)估膿毒癥嚴(yán)重程度和預(yù)后的潛在生物標(biāo)志物。WANG等[14]研究發(fā)現(xiàn)，血清miR-451a升高與膿毒癥嚴(yán)重程度和炎癥反應(yīng)相關(guān)，可作為膿毒癥的診斷生物標(biāo)志物和判斷疾病嚴(yán)重程度的潛在指標(biāo)。另有研究認(rèn)為，miRNA表達(dá)水平升高與膿毒癥患者病情嚴(yán)重和預(yù)后不良相關(guān)，可以作為評(píng)估膿毒癥患者病情嚴(yán)重程度和預(yù)后的一個(gè)有用的生物學(xué)指標(biāo)[15]。

綜上所述，血清miR-206及miR-451表達(dá)水平在老年膿毒癥患者中明顯升高，其高表達(dá)與老年膿毒癥的病情嚴(yán)重程度及預(yù)后相關(guān)，動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)第3天血清miR-206及miR-451表達(dá)水平對(duì)預(yù)測(cè)老年膿毒癥患者死亡具有較好的價(jià)值。