張苗苗 ，陳書濤 *，丁司丞，王瑾，章堃

1.南京信息工程大學江蘇省農業(yè)氣象重點實驗室，江蘇 南京 210044；2.南京信息工程大學應用氣象學院，江蘇 南京 210044

全球變暖是人們廣泛關注的全球性環(huán)境問題，全球變暖對生態(tài)系統(tǒng)具有一系列影響（Ostberg et al.，2013）。農田生態(tài)系統(tǒng)不僅受人類農業(yè)管理措施影響，而且對全球變暖也會產生響應。在全球變暖背景下，作物生長條件的變化會影響土壤過程，而種植不同作物的農田土壤對變暖會產生不同的響應規(guī)律（Wall et al.，2011；Qin et al.，2013）。

人們以往通過增溫試驗研究變暖對農田生態(tài)系統(tǒng)的影響，而增溫對農田生態(tài)系統(tǒng)的影響可能會對土壤微生物產生影響。溫度是影響包括真菌在內的土壤微生物的重要環(huán)境因素（Castro et al.，2010），溫度升高一方面直接影響微生物活性和類群（DeAngelis et al.，2015），另一方面通過影響植物生長進而影響微生物（Morrison et al.，2019）。培養(yǎng)實驗研究表明，增溫增加了赤殼科（Nectriaceae）真菌的相對豐度，但減少了被孢霉科（Mortierellaceae）和毛球殼科（Lasiosphaeriaceae）真菌的相對豐度（Habtewold et al.，2021）。以往研究表明苔原土壤真菌多樣性對增溫表現為正反饋響應模式（Feng et al.，2020）。不同生態(tài)系統(tǒng)土壤真菌群落結構對增溫的響應模式存在差異，特定的植被和土壤條件影響土壤真菌群落結構對增溫的響應程度（Wang et al.，2022），然而以往關于增溫如何影響農田土壤真菌群落組成及多樣性的研究還相對較少，以往的研究也主要集中在草地、苔原、森林等自然生態(tài)系統(tǒng)（Schindlbacher et al.，2011；Streit et al.，2014；Johnston et al.，2019）。

農田生態(tài)系統(tǒng)中，秸稈施用是常見的農業(yè)管理措施，秸稈含有的營養(yǎng)物質為微生物生存提供了物質條件。以往關于秸稈施用對真菌群落影響的研究結果存在差異，有研究表明，秸稈施用增加了稻田土壤真菌豐度，但對真菌α多樣性無顯著影響（Yuan et al.，2013）；Wang et al.（2021）也報道秸稈施用對玉米田耕層土壤真菌α多樣性無顯著影響；Yang et al.（2020）發(fā)現秸稈施用降低了稻麥輪作農田土壤優(yōu)勢真菌目格孢腔菌目（Pleosporales）相對豐度，并使土壤真菌物種數和Shannon指數增大；Huang et al.（2019）研究表明，添加秸稈降低了玉米田土壤優(yōu)勢真菌門子囊菌門（Ascomycota）的相對豐度，并降低了真菌Chao1指數。在施用秸稈條件下，增溫對農田土壤真菌的影響規(guī)律可能會比單因素的影響規(guī)律更為復雜，關于秸稈施用會增強還是減弱增溫影響土壤真菌群落組成及多樣性的效應這一問題還未能研究明確。

本研究設置了增溫及秸稈施用田間試驗，采用高通量測序對不同增溫及秸稈施用處理下大豆(GlycinemaxL.)-冬小麥 (TriticumaestivumL.) 田土壤真菌群落組成及多樣性進行分析，研究增溫及秸稈施用如何影響大豆、冬小麥田土壤真菌門、綱、目水平上的組成及 α、β多樣性，以期為探討全球變暖和農業(yè)管理措施改變條件下農田土壤真菌群落的變異規(guī)律提供基礎數據和理論支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗地點

田間試驗地點位于南京信息工程大學農業(yè)氣象試驗站（32°12'N，118°42'E）。試驗地為北亞熱帶季風氣候，多年平均溫度 15.4 ℃，多年平均降水量1090.6 mm，多年平均日照時數1902.5 h，無霜期237 d。土壤類型為黃棕壤，質地為壤質粘土。耕層（0—20 cm）土壤 pH 為 6.30，容重 1.54 g·cm?3，田間持水量25.6%，土壤有機質15.36 g·kg?1，全氮0.81 g·kg?1。

1.2 田間試驗處理

增溫及秸稈施用的長期試驗開始于2014年11月（陳書濤等，2016），試驗地采用大豆-冬小麥輪作。試驗地設置3個區(qū)組（3個重復，分別以1、2、3標識），每個區(qū)組設置4個處理，分別為對照、增溫、秸稈施用、增溫及秸稈施用，處理代碼分別為CK、WA、SA、WS，共12個小區(qū)，每個小區(qū)面積2.5 m×2.5 m。采用紅外輻射加熱管進行增溫，這種增溫方式為主動式增溫，可同時改變顯熱和潛熱（Bridgham et al.，1999；Luo et al.，2001）。在每個增溫小區(qū)設置4根紅外輻射加熱管，每根加熱管功率為250 W，加熱管均勻分布于小區(qū)中，加熱管懸掛于距離土壤50 cm（略低于作物最高冠層高度）的小區(qū)上方，每根加熱管上方覆蓋1個不銹鋼擋雨板，擋雨板邊緣向下傾斜。紅外輻射加熱管對每個增溫小區(qū)以及增溫及秸稈施用小區(qū)進行晝夜不間斷加熱。

向每個秸稈施用小區(qū)以及增溫及秸稈施用小區(qū)分別添加2.86 kg秸稈，在大豆生長季施用冬小麥秸稈，在冬小麥生長季施用大豆秸稈。添加等量秸稈一方面是為了比較僅添加秸稈的 SA處理與CK處理土壤真菌群落組成的差異，并分析增溫及秸稈施用對土壤真菌群落組成的復合影響規(guī)律；另一方面是為驗證在不同生長季添加等量秸稈對土壤真菌群落組成是否會產生不同影響。將秸稈切成10 cm長小段，于翻耕前均勻施入每個小區(qū)。

大豆播種日期為2017年5月27日，于2017年10月9日收獲；冬小麥播種日期為2017年10月28日，于2018年5月16日收獲。在2017年6月—2018年5月期間（本研究中的大豆-冬小麥輪作年），CK、WA、SA、WS處理的年平均土壤溫度分別為 (24.53± 0.04)、(25.58±0.04)、(24.66±0.04)、(25.78± 0.03) ℃。在每個大豆和冬小麥生長季之前以復合肥形式向各個小區(qū)施加 7.7 g·m?2N，7.7 g·m?2P2O5，7.7 g·m?2K2O，并在冬小麥生長季的 1月以尿素形式施用越冬肥，越冬肥為24.7 g·m?2N。

1.3 土壤樣品采集及高通量測序

在 2017—2018大豆-冬小麥輪作年采集 0—20 cm土壤樣品，在大豆生長中后期（2017年9月23日）采集大豆田土壤樣品，在冬小麥生長中后期（2018年4月21日）采集冬小麥田土壤樣品。在作物生長中后期采集土壤樣品的原因為此時增溫及秸稈施用的處理效應已經有一定時間的積累且作物此時仍具有較強生命活動。在各個取樣小區(qū)以對角線法取樣，將土鉆插入20 cm深土層中，取出的樣品進行混合，按四分法棄去多余樣品，留取50 g樣品裝入塑料無菌自封袋。以高通量測序分析采集土壤樣品的真菌群落組成。

利用 Illumina HiSeq測序平臺進行土壤真菌ITS測序，構建小片段文庫進行雙末端測序。ITS（內轉錄間隔區(qū)）包括ITS1和ITS2，分別位于真核生物核糖體rDNA序列18S和5.8S之間及5.8S和28S之間。土壤樣品進行冷凍研磨，以E.Z.N.A.?DNA 提取試劑盒（Omega Biotek，Norcross，GA，USA）提取土壤DNA，引物為ITS1F（5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′）和 ITS1R（5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′），檢測 DNA濃度及總量是否合格。提取合格的真菌基因以PCR（實時熒光定量聚合酶鏈式反應）進行擴增（95 ℃下反應5 min，95 ℃下反應30 s并進行27個循環(huán)，55 ℃下反應30 s，72 ℃下反應45 s，最后在72 ℃下擴增 10 min）（Rinke et al.，2013）。下機數據進行預處理，以 QIIME（微生物生態(tài)學定量研究）（Lozupone et al.，2011）進行質量控制，并進行OTUs（操作分類單元）聚類和注釋，在過濾和篩查后以97%相似臨界點進行 OUTs聚類（Edgar，2013），從而獲得環(huán)境樣品中真菌的物種組成及豐度信息，進一步進行多樣性分析。

1.4 數據分析

對每個處理下 3個重復小區(qū)門水平上排名前10位土壤真菌類群相對豐度求平均值，并比較綱、目水平上相對豐度排前16位土壤真菌類群，應用Excel 2016中的柱狀圖表征4個處理的真菌相對豐度，以SPSS 19.0軟件的單因素方差分析和多重比較分析不同處理下優(yōu)勢真菌門、綱、目的差異顯著性。對于門水平上的微生物分類而言，一般選取相對豐度排前10位左右的類群（Wang et al.，2021；Cao et al.，2022），排在其后的微生物類群相對豐度一般很低。對于綱、目水平上的微生物分類而言，一般選取相對豐度較高的15—20種類群（Zhou et al.，2021；Ji et al.，2022），本研究中第 16種真菌綱、目相對豐度已低于1%，因而排在其后的真菌在圖中不再表征。以箱線圖分析大豆田和冬小麥田土壤不同處理下的真菌 α多樣性指數（覆蓋度、物種數、Shannon指數、Simpson指數、Chao1指數），采用一元回歸分析冬小麥田土壤真菌α多樣性指數與大豆田真菌 α多樣性指數之間的關系。以熱圖和加權單比例（Weighted Unifrac）距離分析大豆田和冬小麥田土壤β多樣性（即不同處理間物種的差異程度），若兩處理距離越大，則物種差異性越大。

2 結果

2.1 真菌群落門、綱、目水平上的組成

在門水平上，大豆田相對豐度最高的前10種土壤真菌門分別為子囊菌門、擔子菌門（Basidiomycota）、接合菌門（Zygomycota）、纖毛亞門（Ciliophora）、壺菌門（Chytridiomycota）、球囊菌門（Glomeromycota）、類原生動物門（Rozellomycota）、綠藻門（Chlorophyta）、絲足蟲門（Cercozoa）、芽枝霉門（Blastocladiomycota）（圖 1a），這10種真菌門在CK、WA、SA、WS處理中的總相對豐度分別為 (81.0%±2.8%)、(49.8%±8.6%)、(81.0%±1.4%)、(74.3%±3.4%)。WA處理子囊菌門相對豐度顯著低于CK（P=0.023）及SA（P=0.007）處理，且與WS處理存在邊緣顯著差異（P=0.063，表1）。CK與 WS處理接合菌門相對豐度存在顯著（P=0.038）差異。不同處理間壺菌門、球囊菌門、綠藻門、絲足蟲門也存在顯著（P<0.05）或邊緣顯著（0.050.10）差異，這表明增溫減少了糞殼菌綱的相對豐度，但秸稈施用抵消了增溫的這種效應。SA處理散囊菌綱相對豐度顯著高于CK（P<0.001）、WA（P=0.001）、WS（P=0.047）處理，WS處理散囊菌綱相對豐度顯著高于 CK（P=0.011）、WA（P=0.014）處理，CK與WA處理散囊菌綱相對豐度之間無顯著（P=0.854）差異。各處理座囊菌綱、毛霉菌亞門未定名綱之間存在顯著差異（P<0.05）或邊緣顯著差異（0.05

在門、綱、目水平上，冬小麥田與大豆田均存一些類似的土壤真菌類群。冬小麥田相對豐度最高的真菌門、綱、目分別為子囊菌門、糞殼菌綱、炭角菌目，與大豆田相同，但在其余類別組成上既存在相同類群又存在不同類群（圖2a—c）。冬小麥田相對豐度最高的10種真菌門在CK、WA、SA、WS處理中的總相對豐度分別為 (80.8%±2.8%)、(77.7%±2.2%)、(77.0%±2.1%)、(69.5%±5.1%)。冬小麥田相對豐度最高的16種真菌綱在CK、WA、SA、WS處理中的總相對豐度分別為(67.0%±3.3%)、(55.7%±3.9%)、(62.6%±3.3%)、(53.3%±3.7%)。冬小麥田相對豐度最高的16種真菌目在CK、WA、SA、WS處理中的總相對豐度分別為 (44.2%±4.5%)、(38.1%±7.6%)、(43.6%±4.7%)、(37.4%±5.4%)。冬小麥田相對豐度最高的真菌門（子囊菌門）的相對豐度高于大豆田，在各個處理中的占比均超過50%。如表2所示，冬小麥田不同處理油壺菌門、球囊菌門、油壺菌綱、炭角菌目、糞殼菌目之間存在顯著差異（P<0.05）或邊緣顯著差異（0.05

表2 冬小麥田存在顯著差異的真菌門、綱、目相對豐度Table 2 Relative abundance of soil fungi at the phylum, class and order levels in the winter wheat crop field %

圖2 增溫及秸稈施用對冬小麥田土壤真菌門、綱、目相對豐度的影響Figure 2 Effects of warming and straw application on the relative abundance of soil fungi at the phylum, class and order levels in the winter wheat crop field

2.2 真菌群落α多樣性

測序結果表明大豆田不同處理的不同α多樣性指標之間的差異不同。各處理之間真菌群落覆蓋度無顯著差異（P>0.10，圖3a）。4個處理中WA處理的物種數顯著小于 WS處理（P=0.012），CK處理的物種數與WS處理存在邊緣顯著差異（P=0.052，圖 3b）。SA（P=0.032）和 WS（P=0.014）處理 Shannon指數均顯著高于WA處理（圖3c），WA處理與SA（P=0.063）和WS（P=0.061）處理Simpson指數均存在邊緣顯著差異（圖3d），各處理之間Chao1指數無顯著差異（P>0.10，圖 3e）?？傮w而言，大豆田WA處理物種數最少，且具有最低的多樣性。

圖3 不同增溫及秸稈施用處理下大豆田土壤真菌α多樣性箱線圖Figure 3 Box and whisker plot of the α diversity of soil fungi under the different warming and straw application treatments in the soybean crop field

冬小麥田各處理真菌群落覆蓋度無顯著差異（P>0.10，圖4a）。CK與SA處理真菌物種數存在邊緣顯著差異（P=0.087），WA與WS處理物種數也存在邊緣顯著差異（P=0.089，圖4b）。WA和SA處理Shannon指數存在邊緣顯著差異（P=0.088，圖4c）。各處理Simpson指數之間無顯著差異（P>0.10，圖4d）。與物種數相似，CK與SA處理Chao1指數存在邊緣顯著差異（P=0.088，圖4e），WA與WS處理Chao1指數也存在邊緣顯著差異（P= 0.091，圖4e）。與大豆田類似，冬小麥田WA處理物種數相對最少，且具有最低的多樣性。冬小麥田SA處理比CK處理具有更多的物種數和更大的多樣性。大豆田土壤真菌覆蓋度低于冬小麥田（圖 5a），物種數、Shannon指數、Simpson指數、Chao1指數均高于冬小麥田（圖5b—e）。一元回歸分析表明，冬小麥田與大豆田真菌物種數之間存在顯著自然對數回歸關系（P=0.047），冬小麥田與大豆田Shannon指數之間存在邊緣顯著線性回歸關系（P=0.057），表明冬小麥田與大豆田各處理之間物種數及Shannon指數的相對增減規(guī)律類似，在大豆生長季具有較高物種數和 Shannon指數的處理在冬小麥生長季兩個指標的數值也相對較高。從冬小麥田和大豆田物種數及 Shannon指數具有正相關性的規(guī)律來看，在大豆和冬小麥田增溫及秸稈施用對土壤真菌群落物種數和Shannon指數均有類似的影響規(guī)律。

圖4 不同增溫及秸稈施用處理下冬小麥田土壤真菌α多樣性箱線圖Figure 4 Box and whisker plot of the α diversity of soil fungi under the different warming and straw application treatments in the winter wheat crop field

圖5 大豆田與冬小麥田土壤真菌α多樣性指數之間的關系Figure 5 Relationships between the α diversity indexes in the soybean cropland and those in the winter wheat crop field

2.3 真菌群落β多樣性

土壤真菌β多樣性以加權單比例距離衡量，距離越大，則兩處理間的物種差異性越大。圖6a表明，大豆田CK1、CK2、CK3（1、2、3代表3個重復的編號）與SA3、SA3、SA3之間的距離相對較大，例如，CK1與SA3之間的加權單比例距離為0.782；WA1、WA2、WA3與WS1、WS2、WS3之間的加權單比例距離相對較小，表明兩處理間差異相對較小。圖6b表明，冬小麥田CK1、CK2、CK3與WS1、WS2、WS3之間的距離相對較大，表明兩處理間的物種具有較大差異。圖6a、b表明，大豆田土壤真菌β多樣性總體上大于冬小麥田土壤，大豆田各處理間土壤真菌物種差異性相對更大。

圖6 大豆田與冬小麥田土壤真菌加權單比例距離熱圖Figure 6 Heatmap of weighted Unifrac distance of soil fungi in the soybean and winter wheat crop fields

3 討論

3.1 增溫及秸稈施用對真菌群落多樣性的影響

以往關于增溫如何影響土壤真菌群落多樣性的研究存在差異，例如王軍等（2018）研究表明，短期增溫對紫花針茅草原土壤真菌豐度（真菌數量）無顯著影響，分子鑒定技術結果表明增溫對土壤叢枝菌根[球囊菌門 (Glomeromycota)]多樣性無顯著影響（Jiang et al.，2017；Wei et al.，2021）；李欣等（2017）研究發(fā)現，增溫增加了土壤高寒草甸真菌數量；Rinnan et al.（2007，2009）研究表明，增溫降低了土壤真菌豐度；Feng et al.（2009）也發(fā)現增溫減少了土壤真菌數量。本研究中WA處理具有最低的物種數和α多樣性，但差異未達顯著水平。本研究以及以往關于增溫影響土壤真菌多樣性的研究表明，增溫對土壤真菌的影響可能因植物類型、氣候條件而不同（Wang et al.，2022）。在農田中增溫對真菌群落多樣性的影響規(guī)律不同于其他生態(tài)系統(tǒng)，這可能與種植作物的作用更明顯有關，大豆田物種數、Shannon指數、Chao1指數均高于冬小麥田，大豆作物更強的供氮能力更有利于真菌群落的多樣性。

秸稈施用增加了微生物生存所需的含碳底物（Chahal et al.，2018；Thangarajan et al.，2013），改善了土壤的養(yǎng)分條件（Bakht et al.，2009；Sun et al.，2020），有利于真菌等微生物的生存。然而，在種植不同作物的農田中，由于作物類型、水分管理方式、秸稈施用方式等不同，秸稈施用對真菌α多樣性會產生不同的影響規(guī)律。有研究表明，秸稈施用降低了玉米田土壤真菌的α多樣性（Huang et al.，2019；Zhang et al.，2021）；但對水稻田土壤真菌α多樣性無顯著影響（Wang et al.，2021）。Wang et al.（2021）發(fā)現秸稈施用對玉米田耕層土壤真菌 α多樣性無顯著影響，但顯著增加了深層土壤真菌α多樣性。本研究表明，在施用秸稈條件下冬小麥田土壤真菌物種數和Chao1指數增加，且大豆田WS處理物種數高于CK，與Huang et al.（2019）和Zhang et al.（2021）的研究結果一致，說明在本研究中的大豆和冬小麥田秸稈施用為土壤真菌的生存提供的養(yǎng)分條件有利于增加真菌多樣性。

在秸稈施用條件下，增溫對土壤真菌群落多樣性的影響規(guī)律變得更為復雜。大豆和冬小麥田WA處理土壤真菌物種數均最低，且具有最小的Shannon指數，但秸稈施用抵消了這種效應。圖3、4還表明增溫及秸稈施用對土壤真菌的影響具有交互效應，這種交互效應在大豆和冬小麥田均存在。不僅增溫及秸稈施用對土壤真菌α多樣性的影響存在生長季間的差異，而且不同生長季土壤真菌α多樣性也不同。種植豆科作物的農田可向土壤中供給更多氮源，與冬小麥田相比，提供了更多營養(yǎng)源，因此，與α多樣性類似，大豆田土壤真菌β多樣性總體上大于冬小麥田土壤，大豆田各處理間土壤真菌物種差異性相對更大。

3.2 增溫及秸稈施用對真菌群落組成的影響

子囊菌門是真菌界中種類最多的一個門，也是具有代表性的真菌類群，姚世庭等（2021）研究表明增溫與對照條件下排名前3的優(yōu)勢真菌門均為子囊菌門、擔子菌門、接合菌門，這與本研究中的 3種優(yōu)勢真菌門完全相同。本研究中，增溫及秸稈施用改變了土壤真菌群落組成，在門水平上，大豆田WA處理子囊菌門相對豐度顯著低于 CK，秸稈施用部分抵消了增溫對子囊菌門相對豐度的減少效應，而秸稈施用本身對優(yōu)勢門的影響不顯著，這與Zhang et al.（2021）的研究結果類似。與門水平上類似，秸稈施用抵消了增溫對糞殼菌綱相對豐度的減少效應，秸稈施用還提高了散囊菌目的相對豐度。在冬小麥田，WS比CK也減少了子囊菌門相對豐度。在溫度升高條件下，相對豐度最高的優(yōu)勢門和優(yōu)勢綱的真菌數量減少，表明增溫導致真菌中優(yōu)勢門的減少。向田間施用的秸稈中包含了碳、氮等多種可供給真菌生存的營養(yǎng)物質，從而為優(yōu)勢門的生存提供了養(yǎng)分條件（Govaerts et al.，2007；Zhen et al.，2009），這與增溫對優(yōu)勢門的脅迫效應相抵消。在大豆田，WA處理前10種相對豐度最高的真菌門和前 16種相對豐度最高的真菌綱、目的總相對豐度在4個處理中最少，而冬小麥田的這種規(guī)律不明顯，這表明增溫對真菌優(yōu)勢門、綱、目的影響因不同作物類型而異。冬小麥田種類最多的門（子囊菌門）的相對豐度高于大豆田，這可能與大豆田真菌物種數相對更多有關。此外，大豆田土壤真菌門、綱、目水平上存在差異的類群明顯比冬小麥田多（表1、2），這說明大豆田真菌類群受增溫及秸稈施用處理的影響相對更大。豆科作物根瘤具有固氮能力，對土壤具有自然供氮能力，大豆田土壤可為多種真菌類群的存在提供合適的場所以及營養(yǎng)條件（Strom et al.，2020；Guo et al.，2021），這其中的某些真菌類群易受增溫及秸稈施用的影響。

4 結論

（1）大豆田增溫處理土壤真菌物種數最少，且具有最低的α多樣性。冬小麥田秸稈施用處理比對照增加了土壤真菌物種數和α多樣性。大豆田土壤真菌物種數和Chao1指數遠高于冬小麥田，且具有更高的Shannon指數和Simpson指數。大豆田土壤真菌β多樣性總體上大于冬小麥田，前者不同處理之間的物種差異性相對更大。

（2）增溫及秸稈施用改變了大豆-冬小麥輪作農田的土壤真菌群落組成。在大豆田，增溫降低了相對豐度最高的優(yōu)勢真菌門子囊菌門相對豐度；在綱水平上，增溫降低了大豆田相對豐度最高的優(yōu)勢真菌綱糞殼菌綱相對豐度；在目水平上，秸稈施用提高了大豆田散囊菌目相對豐度。在冬小麥田，增溫及秸稈施用降低了油壺菌門相對豐度，各處理優(yōu)勢真菌綱糞殼菌綱相對豐度之間無顯著差異，增溫及秸稈施用降低了炭角菌目相對豐度。

（3）大豆田自身的供氮作用使其具有更大的真菌物種數和α、β多樣性，大豆田在不同增溫及秸稈施用處理下存在差異的真菌門、綱、目類群也多于冬小麥田。種植大豆有利于改善土壤真菌群落結構。