李 晶,劉 敏,苗華明,劉麗霞,徐曉蕾

(迪沙藥業(yè)集團(tuán)國(guó)家認(rèn)定企業(yè)技術(shù)中心,威海 264200)

坎地沙坦酯是一種新型降壓藥,屬于選擇性血管緊張素Ⅱ受體(ATI)拮抗劑。疊氮化鈉和四丁基溴化銨作為坎地沙坦酯傳統(tǒng)工藝路線中的關(guān)鍵催化劑,在坎地沙坦酯的合成過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。疊氮化鈉是劇毒物質(zhì),可抑制細(xì)胞色素氧化酶和其他酶,造成電子傳遞過(guò)程中斷,從而損害神經(jīng)系統(tǒng)[1]。四丁基溴化銨對(duì)皮膚、眼睛和呼吸系統(tǒng)有刺激性作用,且具有基因毒性警示結(jié)構(gòu)。為了保障藥物的質(zhì)量安全,中華人民共和國(guó)藥典(2015年版)和相關(guān)指導(dǎo)原則[2]規(guī)定,要嚴(yán)格控制兩者在藥物中的殘留量。由于未查到這兩種雜質(zhì)的具體毒性數(shù)據(jù),參照國(guó)際人用藥品注冊(cè)技術(shù)協(xié)調(diào)會(huì)(ICH)M7指導(dǎo)原則[3-4],兩種雜質(zhì)的每日最大服用量不得超過(guò)1.5μg,而坎地沙坦酯的日最大服用量為32 mg,可計(jì)算得到四丁基溴化銨和疊氮化鈉的質(zhì)量分?jǐn)?shù)不得超過(guò)0.004 7%。而疊氮化鈉和四丁基溴化銨在藥物中殘留量較低,對(duì)檢測(cè)靈敏度要求高,因此開(kāi)發(fā)一種高靈敏度的分析方法至關(guān)重要。

目前,測(cè)定疊氮化鈉和四丁基溴化銨的方法有液相色譜-質(zhì)譜法[5-7]、離子色譜法[8]。其中液相色譜-質(zhì)譜法操作復(fù)雜,對(duì)儀器要求高;四丁基溴化銨、疊氮化鈉均為離子型化合物,水解后會(huì)生成Br－、N 3－,經(jīng)陰離子淋洗系統(tǒng)(氫氧化鉀體系)淋洗后,可用附電導(dǎo)檢測(cè)器的離子色譜法檢測(cè)[9-10]。

鑒于此,本工作用水提取樣品中的兩種目標(biāo)化合物,用HyperSep C18固相萃取小柱消除坎地沙坦酯的影響,采用附電導(dǎo)檢測(cè)器的離子色譜法進(jìn)行抑制電導(dǎo)檢測(cè)。該方法操作簡(jiǎn)便、靈敏度高、回收率好,可用于坎地沙坦酯原料藥中疊氮化鈉和四丁基溴化銨殘留量的測(cè)定。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

ICS-5000型離子色譜儀,配電導(dǎo)檢測(cè)器;DL-1000D 型智能超聲儀;HC2062 型高速離心機(jī);MS105DU 型電子天平;Milli-Q 型超純水儀;HyperSep C18固相萃取小柱(200 mg/3 mL)。

疊氮化鈉對(duì)照品儲(chǔ)備溶液:7.25 mg·L－1,取疊氮化鈉對(duì)照品14.5 mg,用水溶解并定容至100 mL,分取5 mL置于100 mL容量瓶中,用水稀釋至刻度,搖勻。

Br－對(duì)照品 儲(chǔ)備溶 液:1.00 mg·L－1,取1 000 mg·L－1Br－對(duì)照品溶液1 mL置于100 mL容量瓶中,用水稀釋至刻度。分取1 mL 置于10 mL容量瓶中,加水稀釋至刻度,搖勻。

NO3－對(duì)照品 儲(chǔ)備溶 液:1.00 mg·L－1,取1 000 mg·L－1NO3－對(duì)照品溶液1 mL 置 于100 mL容量瓶中,加水稀釋至刻度。分取1 mL置于10 mL容量瓶中,加水稀釋至刻度,搖勻。

系統(tǒng)適用性溶液:分別取1 mL 疊氮化鈉對(duì)照品儲(chǔ)備溶液、1.2 mL Br－對(duì)照品儲(chǔ)備溶液和4.7 mL NO3－對(duì)照品儲(chǔ)備溶液,置于同一10 mL容量瓶中,加水稀釋至刻度,搖勻,即得含0.725 mg·L－1疊氮化鈉、0.12 mg·L－1Br－和0.47 mg·L－1NO3－的系統(tǒng)適用性溶液。

疊氮化鈉對(duì)照品純度為99.6%;1 000 mg·L－1Br－對(duì)照品溶液;1 000 mg·L－1NO3－對(duì)照品溶液;四丁基溴化銨為分析純;試驗(yàn)用水為超純水(電阻率為18.2 MΩ·cm)。

坎地沙坦酯原料藥樣品由本公司自制。

1.2 儀器工作條件

IonPac AS18陰離子交換色譜柱(250 mm×4 mm,7.5μm);柱溫35℃;檢測(cè)方式為抑制電導(dǎo)檢測(cè),抑制電流99 m A;電導(dǎo)池溫度35 ℃;進(jìn)樣體積200μL;淋洗液為氫氧化鉀溶液,流量1.0 mL·min－1。梯度淋洗程序:0～25 min時(shí),氫氧化鉀溶液濃度為9 mmol·L－1;25～38 min時(shí),氫氧化鉀溶液濃度由9 mmol·L－1升至40 mmol·L－1;38～45 min 時(shí),氫氧化鉀溶液濃度由40 mmol·L－1降至9 mmol·L－1。

1.3 試驗(yàn)方法

取坎地沙坦酯原料藥樣品約100 mg,加入10 mL水,超聲15 min(每隔5 min強(qiáng)力振搖30 s)。分取約5 mL 置于10 mL 離心管中,以轉(zhuǎn)速10 000 r·min－1離心10 min。上清液過(guò)0.22μm濾膜,濾液過(guò)HyperSep C18固相萃取小柱(使用前先用3 mL甲醇活化,再用6 mL水沖洗干凈),收集洗脫液,經(jīng)0.22μm 濾膜過(guò)濾,濾液即為供試品溶液,按照儀器工作條件測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 固相萃取步驟的影響

在樣品檢測(cè)時(shí),發(fā)現(xiàn)供試品溶液中含量較高的坎地沙坦酯會(huì)吸附在色譜柱上且很難被洗脫掉,這將導(dǎo)致色譜柱柱壓變化,柱效降低。為了延長(zhǎng)色譜柱使用壽命,試驗(yàn)選擇在進(jìn)樣前增加固相萃取步驟,以降低坎地沙坦酯對(duì)色譜柱的損害。

2.2 色譜條件的選擇

2.2.1 檢測(cè)器

離子色譜常用的檢測(cè)器有電導(dǎo)檢測(cè)器和電化學(xué)檢測(cè)器,其中電導(dǎo)檢測(cè)器主要適用于離子型化合物,而四丁基溴化銨和疊氮化鈉均為離子型化合物,因此試驗(yàn)選擇附電導(dǎo)檢測(cè)器的離子色譜進(jìn)行抑制電導(dǎo)檢測(cè)。在此檢測(cè)條件下,背景電導(dǎo)以及基線噪聲較低,檢測(cè)靈敏度大大提高[11-14]。

2.2.2 色譜柱和柱溫

試驗(yàn)考察了規(guī)格相同的不同陰離子色譜柱Ion-Pac AS11和Ion Pac AS18對(duì)Br－和N3－分離效果的影響。結(jié)果顯示:IonPac AS11 柱不能實(shí)現(xiàn)Br－和N3－的基線分離;而采用IonPac AS18 柱時(shí),色譜峰峰形對(duì)稱,分離度良好。因此,試驗(yàn)選擇的陰離子色譜柱為IonPac AS18柱。

試驗(yàn)進(jìn)一步考察了柱溫分別為30,35 ℃時(shí)對(duì)Br－和N3－分離效果的影響。結(jié)果顯示,兩種溫度下Br－和N3－均能完全分開(kāi),考慮到35℃時(shí)儀器壓力較小,試驗(yàn)選擇的柱溫為35 ℃。

2.2.3 淋洗液濃度和淋洗方式

試驗(yàn)考察了淋洗液氫氧化鉀溶液初始濃度分別為5,9 mmol·L－1時(shí)對(duì)Br－和N3－分離效果的影響。結(jié)果顯示,當(dāng)淋洗液初始濃度為9 mmol·L－1時(shí),N3－前后雜質(zhì)峰不干擾其出峰,因此試驗(yàn)選擇淋洗液氫氧化鉀溶液的初始濃度為9 mmol·L－1。

水中常見(jiàn)的陰離子有NO2－、SO42－、HCO3－、NO3－、HCOO－,其中NO3－色譜峰位置和Br－、N3－的距離較近,可能影響B(tài)r－和N3－檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確度。為保證Br－、N3－和NO3－能完全分離,試驗(yàn)選擇梯度淋洗程序,即先采用較低濃度淋洗液淋洗25 min,保證Br－、N3－和NO3－完全出峰,然后用較高濃度淋洗液沖洗13 min,保證樣品帶進(jìn)去的離子都被洗脫出來(lái),最后平衡7 min,詳見(jiàn)1.2節(jié)。

2.3 四丁基溴化銨離子化程度的影響

四丁基溴化銨是一種有機(jī)鹽,其離子化程度會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確度。為了考察四丁基溴化銨離子化程度對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響,分別配制0.82 mg·L－1四丁基 溴化銨溶液(Br－的質(zhì)量 濃度約0.20 mg·L－1)和0.20 mg·L－1Br－對(duì)照品溶液,按照儀器工作條件測(cè)定。結(jié)果顯示,兩種溶液中Br－的保留時(shí)間分別為19.843,19.797 min,峰面積分別為0.147,0.155μS·min,兩者保留時(shí)間和峰面積基本一致,以線性回歸方程計(jì)算得四丁基溴化銨溶液中Br－的質(zhì)量濃度為0.19 mg·L－1,所得Br－的回收率約為95.0%,說(shuō)明四丁基溴化銨的離子化程度比較完全,檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確度較高。

2.4 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

按照儀器工作條件測(cè)定空白溶劑、供試品溶液和系統(tǒng)適用性溶液,色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 空白溶劑、系統(tǒng)適用性溶液和供試品溶液的色譜圖Fig.1 Chromatograms of blank solvent,system suitability solution and test solution

結(jié)果顯示:Br－、N3－和NO3－均可實(shí)現(xiàn)基線分離,NO3－與N3－分離度為2.42;空白溶劑對(duì)Br－、N3－的檢測(cè)無(wú)干擾,供試品溶液中其他雜質(zhì)對(duì)Br－、N3－的檢測(cè)無(wú)干擾,說(shuō)明該方法專屬性較好。

對(duì)系統(tǒng)適用性溶液連續(xù)進(jìn)樣6 次,計(jì)算雜質(zhì)NO3－保留時(shí)間和峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD),所得保留時(shí)間的RSD 不大于0.010%,小于1.0%,峰面積RSD 不大于0.5%,小于2.0%,滿足規(guī)定的檢測(cè)要求。

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限和測(cè)定下限

以3倍信噪比(S/N)計(jì)算檢出限(3S/N),N3－和Br－的檢出限分別為0．00070,0．0014 mg·L－1。以10倍信噪比計(jì)算測(cè)定下限(10S/N),N3－和Br－的測(cè)定下限分別為0．00233,0．0048 mg·L－1。

用水逐級(jí)稀釋Br－對(duì)照品儲(chǔ)備溶液和疊氮化鈉對(duì)照品儲(chǔ)備溶液,以測(cè)定下限作為第一個(gè)濃度點(diǎn),分別以0．466mg·L－1和0．120mg·L－1作為N3－和Br－的100%雜質(zhì)限度,再分別配制25%,50%,100%,150%,200% 雜質(zhì)限度的濃度點(diǎn),即得0.002 33,0.116,0.233,0.466,0.699,0.932 mg·L－1的N3－對(duì)照品 溶液系列和0.0048,0.030,0.060,0.120,0.180,0.240 mg·L－1的Br－對(duì)照品溶液系列。按照儀器工作條件測(cè)定,以N3－和Br－的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),其對(duì)應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果顯示:N3－和Br－的標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍分別為0.002 33～0.932 mg·L－1和0.004 8～0.240 mg·L－1,線性回 歸方程 分別為y＝1.336x＋6.600×10－3和y＝8.006×10－1x－2.500×10－3,相關(guān)系數(shù)均為0.999 8。

2.6 精密度和回收試驗(yàn)

按照試驗(yàn)方法對(duì)空白樣品進(jìn)行低、中、高等3個(gè)濃度水平的加標(biāo)回收試驗(yàn),各濃度水平分別平行測(cè)定3,6,3次,計(jì)算回收率和中濃度水平下測(cè)定值的RSD,結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 精密度和回收試驗(yàn)結(jié)果Tab.1 Results of tests for precision and recovery

由表1可知,N3－和Br－的回收率分別為88.2%～93.5%和101%～104%,測(cè)定值的RSD 分別為2.6%和0.55%,說(shuō)明方法的準(zhǔn)確度和精密度均較好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

將加標(biāo)供試品溶液(N3－和Br－的加標(biāo)量分別為4.668 5,1.200 0μg)分別在室溫下放置0,2,4,6,8 h,按照儀器工作條件測(cè)定,計(jì)算峰面積的RSD。結(jié)果顯示,N3－和Br－峰面積的RSD 分別為2.3%和1.1%,說(shuō)明供試品溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 耐用性試驗(yàn)

略微調(diào)整淋洗液濃度、柱溫、流量參數(shù),比較了在不同色譜條件下系統(tǒng)適用性溶液中Br－、N3－和NO3－分離度的變化,結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 耐用性試驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Results of test for durability

由表2 可知,略微調(diào)整色譜參數(shù)后,Br－與NO3－、N3－與NO3－之間的分離度均大于1.50,說(shuō)明方法耐用性較好。

2.9 樣品分析

按照試驗(yàn)方法分析坎地沙坦酯原料藥小試、中試以及批量生產(chǎn)產(chǎn)品各3批,分析結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 樣品分析結(jié)果Tab.3 Analytical results of the samples

結(jié)果表明,開(kāi)發(fā)的檢測(cè)方法可以滿足生產(chǎn)檢測(cè)的需求,同時(shí)樣品中的其他雜質(zhì)亦不干擾Br－、N3－的測(cè)定。

本工作采用離子色譜法同時(shí)測(cè)定坎地沙坦酯原料藥中疊氮化鈉和四丁基溴化銨的含量,原料藥以及溶劑水中其他雜質(zhì)離子對(duì)Br－、N3－干擾小。方法專屬性和靈敏度較好,準(zhǔn)確度、穩(wěn)定性、耐用性均較好,可用于坎地沙坦酯原料藥質(zhì)量的監(jiān)控。