曾周 龔拯 劉麗麗 柯丁心 王斌， 張萬明，

(1 青島大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，山東 青島 266071； 2 青島大學(xué)華賽醫(yī)學(xué)細(xì)胞和蛋白質(zhì)藥物研究院)

胃癌是目前癌癥相關(guān)死亡的第三大原因，2020年全球新增胃癌病例超過100萬[1]。由于傳統(tǒng)治療手段(如手術(shù)、放療和化療)在晚期胃癌患者中的治療效果不佳，因此迫切需要新的治療方式。近年來，免疫治療顯著改善了胃癌患者的預(yù)后[2-3]，但也只有少部分患者能夠從中受益[4]。研究發(fā)現(xiàn)黑色素瘤、胃癌和非小細(xì)胞肺癌患者的腫瘤突變負(fù)荷(TMB)與免疫治療反應(yīng)性及更好的預(yù)后相關(guān)[5-7]。而胃癌某些基因突變與患者預(yù)后的相關(guān)性尚不清楚。因此，需要了解更多胃癌基因突變對(duì)患者預(yù)后的影響。本研究從TCGA和ICGC數(shù)據(jù)庫中下載胃癌患者的體細(xì)胞突變基因，通過R軟件篩選出與患者生存率和預(yù)后密切相關(guān)的共同高頻突變基因，然后使用GSEA軟件進(jìn)行基因富集分析，運(yùn)用CIBERSORT算法計(jì)算腫瘤浸潤免疫細(xì)胞(TIICs)的相對(duì)豐度，探究共同高頻突變基因?qū)颊逿IICs的影響，旨在為胃癌患者的免疫治療提供理論和數(shù)據(jù)參考?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 資料和方法

1.1 資料來源

從TCGA數(shù)據(jù)庫(https://portal.gdc.cancer.gov)中下載433例胃癌患者的體細(xì)胞基因突變數(shù)據(jù)及其臨床信息，時(shí)間截至2020年11月20日。排除某些臨床信息缺失者，最后389例胃癌患者納入本研究。從ICGC數(shù)據(jù)庫(http://dcc.icgc.org/releases/current/Projects) 中下載523例胃癌患者的體細(xì)胞基因突變數(shù)據(jù)。

1.2 高頻突變基因的篩選及其與患者預(yù)后和TMB的相關(guān)性分析

通過R軟件分析TCGA和ICGC數(shù)據(jù)庫中胃癌患者的體細(xì)胞突變數(shù)據(jù)[8]，對(duì)兩個(gè)數(shù)據(jù)庫中突變頻率位于前30位的基因取交集，獲得共同高頻突變基因，通過R軟件對(duì)共同高頻突變基因與患者預(yù)后的相關(guān)性進(jìn)行Kaplan-Meier生存分析和Cox風(fēng)險(xiǎn)回歸分析，獲得與患者預(yù)后密切相關(guān)的突變基因。通過蛋白編碼區(qū)的非同義突變位點(diǎn)總數(shù)除以蛋白編碼區(qū)的總長度來計(jì)算每例患者的TMB[9]。最后利用Mann-Whitney檢驗(yàn)分析共同高頻突變基因與TMB評(píng)分的相關(guān)性。

1.3 生物信息學(xué)分析

使用GSEA軟件4.1.0中的兩個(gè)基因集(c2.cp.kegg.v7.2.symbols.gmt和c7.all.v7.2.symbols.gmt)對(duì)與預(yù)后密切相關(guān)的突變基因進(jìn)行基因富集分析[10]，通過標(biāo)準(zhǔn)化富集分?jǐn)?shù)(NES)比較上述共同高頻突變基因在兩個(gè)基因集中的富集程度，以P<0.05和錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(FDR)<0.25為顯著富集。使用CIBERSORT反褶積算法計(jì)算每例胃癌患者組織樣本TIICs的相對(duì)豐度[11]，并使用R軟件分析突變基因與TIICs的相關(guān)性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用R軟件4.0.2版本對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用Kaplan-Meier法和對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn)估計(jì)患者總生存率。采用單變量Cox回歸分析確定患者總生存率的危險(xiǎn)因素。以P<0.05為差異有顯著性。

2 結(jié) 果

2.1 胃癌突變基因與患者TMB評(píng)分及生存預(yù)后的關(guān)系

使用R軟件分析顯示，對(duì)TCGA和ICGC數(shù)據(jù)庫中突變頻率前30位的基因取交集后獲得21個(gè)共同高頻突變基因。Kaplan-Meier生存分析和Cox風(fēng)險(xiǎn)回歸分析顯示，21個(gè)共同高頻突變基因中，僅FAT4及MUC16突變與胃癌患者的總生存率相關(guān)，由于MUC16基因突變與胃癌的相關(guān)性已有相關(guān)研究報(bào)道[12]，故本研究后續(xù)只針對(duì)FAT4進(jìn)行分析。Mann-Whitney檢驗(yàn)分析顯示FAT4突變患者的TMB評(píng)分顯著升高(P<0.001)。

2.2 FAT4基因突變的富集分析

GSEA軟件分析顯示，F(xiàn)AT4基因突變患者主要富集于TMB評(píng)分相關(guān)的通路，例如KEGG堿基切除修復(fù)、KEGG DNA復(fù)制、KEGG錯(cuò)配修復(fù)(圖1A)以及MEMORY-CD4-TCELL-VS-TH2-DN通路(圖1B);FAT4基因未突變的患者則主要富集于FOXP3-FUSION-GFP-TREG-UP通路(圖1B)。

2.3 高頻突變基因與TIICs的相關(guān)性分析

通過CIBERSORT反褶積算法計(jì)算結(jié)果顯示，每例胃癌患者的組織樣本中都含有22種TIICs，這些TIICs的種類名稱及其表達(dá)水平如圖2A所示。FAT4基因突變與TIICs的相關(guān)性分析的結(jié)果顯示，F(xiàn)AT4基因突變患者的組織樣本中活化的記憶性CD4+T細(xì)胞和濾泡輔助性T細(xì)胞浸潤豐度較高(P<0.05)，但Treg細(xì)胞和初始B細(xì)胞浸潤豐度較低(P<0.05)。見圖2B。

3 討 論

由于胃癌惡性程度高、異質(zhì)性強(qiáng)，手術(shù)切除仍然是目前臨床常用的治療方法。但胃癌晚期患者往往術(shù)后預(yù)后較差。隨著分子生物學(xué)在腫瘤免疫治療中的應(yīng)用，近年來晚期癌癥患者的治療取得了一定進(jìn)展。一項(xiàng)針對(duì)胃癌患者的隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)顯示，接受Nivolumab治療患者的總生存期較安慰劑組患者顯著延長[13]，提示免疫治療有望改善胃癌患者的治療效果。但目前免疫治療的受益群體有限。因此，尋找胃癌患者的預(yù)后生物標(biāo)志物來指導(dǎo)免疫治療，具有重要的臨床價(jià)值。

本研究首先通過R軟件對(duì)TCGA數(shù)據(jù)庫以及ICGC數(shù)據(jù)庫中胃癌患者的體細(xì)胞突變情況進(jìn)行分析并篩選出21個(gè)共同高頻突變基因。通過Kaplan-Meier生存分析方法和Cox風(fēng)險(xiǎn)回歸分析方法對(duì)這21個(gè)共同高頻突變基因進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，F(xiàn)AT4及MUC16突變與胃癌患者的總生存率及更高的TMB評(píng)分密切相關(guān)。FAT4是編碼原鈣黏蛋白家族的成員之一，在平面細(xì)胞極性的調(diào)節(jié)中起著重要作用。有研究發(fā)現(xiàn)FAT4在胃癌中高頻突變[14]，但具體機(jī)制尚不清楚。MUC16基因編碼一種膜系黏蛋白，該黏蛋白在其氨基末端包含一個(gè)胞外域、一個(gè)大串聯(lián)重復(fù)域和一個(gè)具有短胞質(zhì)域的跨膜域。已有研究發(fā)現(xiàn)MUC16是胃癌中最常發(fā)生突變的基因之一，且其突變與胃癌患者更高的TMB評(píng)分、更強(qiáng)的抗腫瘤免疫反應(yīng)及更好的臨床預(yù)后相關(guān)[15]。也有研究發(fā)現(xiàn)MUC16突變與免疫應(yīng)答、抗原處理、細(xì)胞周期檢查點(diǎn)和DNA復(fù)制與修復(fù)相關(guān)的信號(hào)通路上調(diào)有關(guān)[16]。本研究對(duì)MUC16基因突變的后續(xù)分析與上述研究高度重復(fù)，因此本研究后續(xù)主要針對(duì)FAT4進(jìn)行分析。TMB評(píng)分在基于腫瘤新抗原的表達(dá)來預(yù)測多種類型腫瘤的免疫檢查點(diǎn)阻斷反應(yīng)中起重要作用。研究顯示，TMB評(píng)分是機(jī)體免疫反應(yīng)的預(yù)測因子[17]，針對(duì)膀胱癌、黑色素瘤、腎細(xì)胞癌和頭頸部鱗狀細(xì)胞癌等研究發(fā)現(xiàn)，TMB評(píng)分升高的患者預(yù)后更好[18]。在本研究中，通過GSEA軟件針對(duì)FAT4基因突變的富集結(jié)果分析顯示，F(xiàn)AT4突變與錯(cuò)配修復(fù)、DNA復(fù)制和堿基切除修復(fù)密切相關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)錯(cuò)配修復(fù)、DNA復(fù)制和堿基切除修復(fù)是TMB評(píng)分升高的主要原因[19]。此外，高TMB評(píng)分與淋巴細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的識(shí)別關(guān)系密切[20]，這提示FAT4突變可能增強(qiáng)了淋巴細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的識(shí)別作用，從而提高了抗腫瘤免疫反應(yīng)。本研究GSEA富集分析結(jié)果還顯示，在FAT4基因未突變的胃癌患者中，與FOXP3-FUSION-GFP-TREG-UP相關(guān)的信號(hào)通路上調(diào)。FOXP3蛋白是維持Treg細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的重要轉(zhuǎn)錄因子[21]。Treg細(xì)胞是一種抑制性免疫細(xì)胞，維持免疫耐受，并下調(diào)過度的免疫反應(yīng)[22]。因此，F(xiàn)AT4突變可能破壞Treg細(xì)胞介導(dǎo)的免疫耐受，進(jìn)而促進(jìn)抗腫瘤免疫反應(yīng)。本研究通過CIBERSORT算法和R軟件針對(duì)FAT4突變與TIICs的相關(guān)性進(jìn)行分析顯示，在FAT4突變患者中，活化的記憶性CD4+T細(xì)胞和濾泡輔助性T細(xì)胞浸潤豐度較高，Treg細(xì)胞浸潤豐度較低。有研究顯示，活化的記憶CD4+T細(xì)胞在腫瘤進(jìn)展的早期階段發(fā)揮抗腫瘤免疫的主導(dǎo)作用[23]；在高TMB評(píng)分的乳腺癌患者中，濾泡輔助性T細(xì)胞通過激活B細(xì)胞使患者對(duì)免疫檢查點(diǎn)阻斷的反應(yīng)更強(qiáng)[24]。在多種腫瘤中，例如乳腺癌、腎癌和非小細(xì)胞肺癌中，Treg細(xì)胞浸潤增加與患者較差的臨床預(yù)后情況有關(guān)[25-27]。在本研究中FAT4突變患者中活化的記憶CD4+T細(xì)胞和濾泡輔助性T細(xì)胞比例升高，提示FAT4突變可通過改變TIICs的比例來增強(qiáng)抗腫瘤免疫反應(yīng)，延長患者的生存期。

A:KEGG通路的富集分析，B:免疫通路的富集分析

A:每例患者組織樣本中TIICs的相對(duì)豐度，B:FAT4基因突變患者(紅色)和FAT4基因未突變患者(藍(lán)色)與TIICs的相關(guān)性

綜上所述，本研究結(jié)果顯示，胃癌患者FAT4突變頻率較高，且與患者更好的臨床預(yù)后及較高的TMB評(píng)分有關(guān)。此外，F(xiàn)AT4突變可引起TIICs浸潤程度的改變，并增強(qiáng)抗腫瘤免疫功能。本研究對(duì)評(píng)估胃癌患者的預(yù)后有重要意義，可為胃癌患者的免疫治療提供理論和數(shù)據(jù)參考。