路冉 王爽 王斌

(青島大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，山東 青島 266071)

先天性免疫系統(tǒng)在機(jī)體受到病原體感染時(shí)會(huì)快速啟動(dòng)，并產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，同時(shí)激活適應(yīng)性免疫系統(tǒng)，這是保護(hù)機(jī)體的第一道重要免疫防線[1]。先天免疫細(xì)胞還可以通過(guò)靶向激活受體或者通過(guò)阻斷抑制通路，或者與適應(yīng)性免疫的相互作用來(lái)實(shí)現(xiàn)抗腫瘤功能[2]。鑒于先天免疫的重要性，關(guān)于如何激活先天免疫，以及尋找新的抗原提呈細(xì)胞(APCs)的激活劑成為抗腫瘤相關(guān)研究的熱點(diǎn)[3-4]。黃酮類是一類具有C6-C3-C6結(jié)構(gòu)的天然多酚類化合物，且具有多種生物活性，如抗腫瘤、抗炎、抗氧化、防治神經(jīng)紊亂以及免疫調(diào)節(jié)等作用[5-6]；而且由于其毒副作用小、易獲取等特點(diǎn)[7]，具有作為疫苗佐劑的條件和潛力，因此也是目前佐劑研究的熱點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)，黃酮類化合物白楊素、蔓荊子黃素、刺芒柄花素和北美圣草素均具有免疫調(diào)節(jié)作用[8-10]，但關(guān)于這4種中藥單體激活A(yù)PCs的能力的相關(guān)研究目前報(bào)道較少，因此本研究旨在通過(guò)檢測(cè)這4種中藥單體在細(xì)胞水平上對(duì)APCs的激活作用，以篩選出具有免疫激活作用的中藥單體，為腫瘤相關(guān)疫苗佐劑研發(fā)提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、儀器與試劑

白楊素(純度≥98%)、蔓荊子黃素(純度≥98%)、刺芒柄花素(純度≥98%)和北美圣草素(純度≥98%)均購(gòu)自大連美侖生物科技有限公司；流式抗體PE anti-mouse CD80、PE anti-mouse CD86、PE anti-mouse主要組織相容性復(fù)合體Ⅰ(MHCⅠ)及PE anti-mouse I-A/I-E均購(gòu)自美國(guó)Biolegend公司；小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞系購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞資源中心；小鼠骨髓來(lái)源樹(shù)突狀細(xì)胞DC2.4細(xì)胞系由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

RAW264.7細(xì)胞和DC2.4細(xì)胞分別接種于含體積分?jǐn)?shù)0.10胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，置于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)0.05的CO2培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)，待細(xì)胞培養(yǎng)2～3代狀態(tài)穩(wěn)定后，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 藥物的溶解和配制

蔓荊子黃素、刺芒柄花素和北美圣草素分別以二甲基亞砜進(jìn)行溶解，制備成濃度為20、25、40 g/L的母液，白楊素以乙醇進(jìn)行溶解，制備成濃度4 g/L的母液。將每種中藥單體的母液再以含體積分?jǐn)?shù)為0.10胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行稀釋，分別配制成低、中、高3個(gè)濃度，白楊素的終濃度為10、20、40 mg/L，蔓荊子黃素為0.1、1、10 mg/L，刺芒柄花素為0.25、2.5、25 mg/L，北美圣草素則為0.4、4、40 mg/L。將脂多糖(LPS)溶解于含體積分?jǐn)?shù)0.10胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基當(dāng)中，并配制成終濃度為6 mg/L。

1.4 細(xì)胞的分組和免疫刺激活性的檢測(cè)

將傳代后的RAW264.7細(xì)胞和DC2.4細(xì)胞分別接種于96孔板中，置于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)0.05的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，待細(xì)胞貼壁穩(wěn)定，處于旺盛生長(zhǎng)期，細(xì)胞形態(tài)正常，融合度為60%～70%時(shí)，棄掉96孔板中原培養(yǎng)基。每孔細(xì)胞中分別加入上述配制好的不同濃度的4種中藥單體，分別為蔓荊子黃素組、刺芒柄花素組、北美圣草素組和白楊素組，再根據(jù)濃度不同分為低、中、高3個(gè)亞組，同時(shí)每組藥物再分別設(shè)置陰性對(duì)照亞組和陽(yáng)性對(duì)照亞組；其中陰性對(duì)照亞組為每孔細(xì)胞中分別加入含體積分?jǐn)?shù)0.10胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基100 μL，陽(yáng)性對(duì)照亞組為每孔細(xì)胞中分別加入濃度為6 mg/L的LPS溶液100 μL。然后均置于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)0.05的CO2培養(yǎng)箱中共同孵育48 h[11]以后，分別向RAW264.7細(xì)胞以及DC2.4細(xì)胞中加入PE anti-mouse CD80、PE anti-mouse CD86、PE anti-mouse MHCⅠ和PE anti-mouse I-A/I-E 4種抗體，在4 ℃無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基中避光孵育30 min后，用Beckman CytoFLEX流式細(xì)胞儀檢測(cè)2種細(xì)胞表面CD80、CD86、MHCⅠ和MHCⅡ的表達(dá)情況。每組細(xì)胞設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，結(jié)果取均值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 4種中藥單體對(duì)RAW264.7細(xì)胞的免疫激活作用比較

兩因素析因設(shè)計(jì)方差分析結(jié)果顯示，藥物、濃度以及藥物與濃度交互作用均對(duì)RAW264.7細(xì)胞中CD80、CD86、MHCⅠ和MHCⅡ4種表面標(biāo)志物的表達(dá)具有顯著影響(F藥物=19.44～168.97，F(xiàn)濃度=4.74～2 715.65，F(xiàn)藥物*濃度=4.37～196.42，P<0.05)。單獨(dú)效應(yīng)分析結(jié)果顯示，4種中藥單體的高濃度亞組間RAW264.7細(xì)胞中4種表面標(biāo)志物表達(dá)水平比較差異均有顯著性(F=5.40～44.18，P<0.05)，低濃度和中濃度亞組間，4種表面標(biāo)志物的表達(dá)水平比較差異均無(wú)顯著性(P>0.05)。另外，白楊素組的各亞組間RAW264.7細(xì)胞之中CD80、CD86、MHCⅠ和MHCⅡ表達(dá)水平比較差異均有顯著性(F=17.54～51.54，P<0.05)；蔓荊子黃素組和刺芒柄花素組的各亞組間RAW264.7細(xì)胞之中CD80、CD86、MHCⅠ表達(dá)水平比較差異有顯著性(F=38.02～1 543.14，P<0.05)，但MHCⅡ的表達(dá)水平比較差異無(wú)顯著性(P>0.05)；北美圣草素組的各亞組間RAW264.7細(xì)胞中CD80和CD86表達(dá)水平比較差異均具有顯著性(F=331.91、1 543.14，P<0.05)，但MHCⅠ和MHCⅡ的表達(dá)水平比較差異無(wú)顯著性(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 4種中藥單體對(duì)RAW264.7細(xì)胞的免疫激活作用比較

2.2 4種中藥單體對(duì)DC2.4細(xì)胞的免疫激活作用比較

析因設(shè)計(jì)方差分析結(jié)果顯示，藥物、濃度以及藥物與濃度交互作用均對(duì)DC2.4細(xì)胞中CD80、CD86、MHCⅠ和MHCⅡ4種表面標(biāo)志物表達(dá)有顯著的影響(F藥物=25.52～68.43，F(xiàn)濃度=37.62～300.95，F(xiàn)藥物*濃度=15.26～77.89，P<0.05)。單獨(dú)效應(yīng)分析結(jié)果顯示，4種中藥單體的中、高濃度亞組間DC2.4細(xì)胞中4種表面標(biāo)志物表達(dá)水平比較差異均有顯著性(F=3.82～170.14，P<0.05)，低濃度亞組DC2.4細(xì)胞中CD80、CD86和MHCⅠ表達(dá)水平比較差異均有顯著性(F=3.86～10.80，P<0.05)，但MHCⅡ的表達(dá)水平比較差異無(wú)顯著性(P>0.05)。另外，白楊素組和北美圣草素組各亞組間DC2.4細(xì)胞中4種表面標(biāo)志物表達(dá)水平比較差異均具有顯著性(F=3.89～144.44，P<0.05)；蔓荊子黃素組和刺芒柄花素組的各亞組間DC2.4細(xì)胞中CD80、CD86、MHCⅡ表達(dá)水平比較差異有顯著性(F=34.52～240.18，P<0.05)，但MHCⅠ的表達(dá)水平差異無(wú)顯著性(P>0.05)。見(jiàn)表2。

表2 4種中藥單體對(duì)DC2.4細(xì)胞的免疫激活作用比較

3 討 論

疫苗佐劑是指摻入疫苗中以增強(qiáng)免疫原性的化合物，可提高高度純化的疫苗抗原的免疫原性，增強(qiáng)疫苗的效力，且不影響疫苗安全性[12-13]。疫苗佐劑的作用方式包括抗原的緩釋、免疫細(xì)胞的募集、炎癥小體的激活、MHC分子增強(qiáng)抗原提呈以及免疫調(diào)節(jié)[14]。疫苗添加佐劑的優(yōu)勢(shì)在于可以節(jié)省疫苗劑量，并能更加快速、廣泛和強(qiáng)力地誘導(dǎo)免疫反應(yīng)[15]。目前為止，獲得許可的人類疫苗中使用的佐劑和僅在實(shí)驗(yàn)室或臨床試驗(yàn)中進(jìn)行研究的佐劑都有引起全身或局部不良反應(yīng)的可能，因此，疫苗佐劑的開(kāi)發(fā)和研制具有重要的臨床意義[16-20]。激活機(jī)體的先天性免疫機(jī)制，是目前研發(fā)更安全有效的新一代疫苗佐劑的新方向[21]。

研究顯示，先天免疫在抗腫瘤等方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。在腫瘤免疫防御和監(jiān)測(cè)中，自然殺傷細(xì)胞作為先天免疫細(xì)胞可以充分發(fā)揮其細(xì)胞毒性作用直接殺傷腫瘤細(xì)胞，巨噬細(xì)胞的吞噬功能在針對(duì)某些腫瘤的免疫防御中也有一定作用。另外先天免疫細(xì)胞在抗體誘導(dǎo)后也可以發(fā)揮效應(yīng)功能，例如依賴于Fc受體表達(dá)的抗體依賴性細(xì)胞毒作用。因此，先天免疫細(xì)胞在腫瘤進(jìn)展中起著重要的防御和調(diào)節(jié)作用[22]。此外，針對(duì)抗腫瘤的有效免疫反應(yīng)通常涉及先天免疫系統(tǒng)和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)細(xì)胞之間的相互協(xié)調(diào)[23]，如可通過(guò)APCs在腫瘤條件下激活腫瘤抗原特異性CD8+T細(xì)胞功能來(lái)實(shí)現(xiàn)[24]。APCs對(duì)腫瘤抗原的攝取導(dǎo)致交叉呈遞——MHCⅠ分子呈遞外源性抗原，從而誘導(dǎo)腫瘤特異性CD8+T細(xì)胞的啟動(dòng)和該細(xì)胞群體的增殖[25]。

中藥提取物可通過(guò)不同途徑作用于先天免疫和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)，其中黃芪多糖等這些傳統(tǒng)補(bǔ)益類藥物中的多糖，調(diào)節(jié)免疫功能的作用較為突出，可通過(guò)增加樹(shù)突狀細(xì)胞等APCs的數(shù)量，或促進(jìn)其表面細(xì)胞因子的表達(dá)，加強(qiáng)抗原提呈能力，增強(qiáng)機(jī)體免疫[26-27]。黃酮類中藥單體對(duì)機(jī)體的細(xì)胞免疫和體液免疫功能也具有調(diào)節(jié)作用，主要類型有二氫黃酮、二氫黃酮醇、黃酮、黃酮醇、花色素、異黃酮等。

本研究通過(guò)探討白楊素、蔓荊子黃素、刺芒柄花素和北美圣草素4種中藥單體在體外對(duì)巨噬細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞分子表達(dá)的調(diào)控，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)藥物誘導(dǎo)先天免疫細(xì)胞活化的能力，篩選出對(duì)APCs免疫激活潛能最強(qiáng)的中藥單體。結(jié)果顯示，白楊素組的各亞組之間RAW264.7和DC2.4細(xì)胞表面的CD80、CD86、MHCⅠ和MHCⅡ表達(dá)水平比較差異均有顯著性；蔓荊子黃素組和刺芒柄花素組的各亞組間RAW264.7細(xì)胞中CD80、CD86和MHCⅠ的表達(dá)水平比較差異有顯著性，DC2.4細(xì)胞中CD80、CD86和MHCⅡ的表達(dá)水平比較差異有顯著性；北美圣草素組的各亞組間RAW264.7細(xì)胞和DC2.4細(xì)胞中CD80和CD86的表達(dá)水平比較差異有顯著性，DC2.4細(xì)胞的MHCⅠ和MHCⅡ表達(dá)水平比較差異有顯著性。在低濃度的4種中藥單體刺激下，各藥物間DC2.4細(xì)胞中CD80、CD86和MHCⅠ表面標(biāo)志物表達(dá)水平比較差異有顯著性，RAW264.7細(xì)胞中4種表面標(biāo)志物表達(dá)水平比較差異無(wú)顯著意義；在中濃度的4種中藥單體刺激下，各藥物間DC2.4細(xì)胞中4種表面標(biāo)志物表達(dá)水平比較差異有顯著性，RAW264.7細(xì)胞中4種表面標(biāo)志物表達(dá)水平比較差異無(wú)顯著性；在高濃度的4種中藥單體刺激下，各藥物間RAW264.7和DC2.4細(xì)胞中CD80、CD86、MHCⅠ和MHCⅡ表達(dá)水平比較差異均有顯著性，其中白楊素在高濃度時(shí)刺激RAW264.7和DC2.4細(xì)胞中4種表面標(biāo)志物表達(dá)水平最高。由此可以提示，高濃度時(shí)4種中藥單體均對(duì)RAW264.7和DC2.4細(xì)胞具有免疫激活作用，白楊素免疫的激活能力最強(qiáng)，蔓荊子黃素和刺芒柄花素次之，北美圣草素最弱。

研究顯示，APCs攝取和加工抗原后，將抗原以抗原肽-MHCⅡ類分子復(fù)合物的形式表達(dá)在細(xì)胞膜上并提呈給CD4+T細(xì)胞。MHC分子由一組不同的多態(tài)基因編碼[28]，MHC分子首先與T細(xì)胞受體相結(jié)合，然后將抗原呈遞給T細(xì)胞受體，提供初始T細(xì)胞活化的啟動(dòng)信號(hào)(第一信號(hào))，同時(shí)還能夠以抗原肽-MHCⅠ類分子復(fù)合物的形式將抗原肽提呈給CD8+T細(xì)胞并將其激活。另外APCs高表達(dá)CD80、CD86等共刺激分子，從而為T(mén)細(xì)胞充分活化提供了第二信號(hào)[29]。APCs分泌的細(xì)胞因子進(jìn)一步誘導(dǎo)活化T細(xì)胞增殖和分化，從而啟動(dòng)免疫應(yīng)答。本研究中，白楊素在體外刺激RAW264.7和DC2.4細(xì)胞的MHCⅠ和MHCⅡ分子的表達(dá)水平升高，增強(qiáng)了初始T細(xì)胞活化的起始信號(hào)(第一信號(hào))；同時(shí)刺激RAW264.7和DC2.4細(xì)胞表面的共刺激分子CD80和CD86表達(dá)水平的升高，增強(qiáng)了T細(xì)胞活化的第二信號(hào)。因此，白楊素具有激活先天免疫，進(jìn)而啟動(dòng)適應(yīng)性免疫以及發(fā)揮抗腫瘤作用的潛力。目前，開(kāi)發(fā)疫苗佐劑的重點(diǎn)是，找到一種能夠保證其安全性且定義明確的化合物，它們應(yīng)具有激活先天免疫反應(yīng)并且增強(qiáng)或改變疫苗誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答的能力[30-31]。研究結(jié)果顯示，白楊素作為一種黃酮類化合物，其安全性較高，而且定義明確、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單[32-33]，體外激活A(yù)PCs的能力也較強(qiáng)，具有做為疫苗佐劑的潛力，但后續(xù)還需要進(jìn)一步的體內(nèi)試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

綜上所述，白楊素對(duì)APCs具有免疫激活作用，其中高濃度的白楊素對(duì)APCs的免疫激活潛能最強(qiáng)，未來(lái)有望作為一種候選藥物在抗腫瘤治療和疫苗佐劑研發(fā)等領(lǐng)域發(fā)揮作用。