梁衍鋒 尤清欣 谷青蕓 王景濤 舒濤 王鳳月 張嘉倪 宋紅瑞 王浩然 張東東

(佳木斯大學(xué) 1基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007；2臨床醫(yī)學(xué)院)

高血壓患病率呈逐年上升趨勢。中國每年由于血壓升高而導(dǎo)致過早死亡的人數(shù)高達(dá)200萬，每年直接醫(yī)療費(fèi)用達(dá)366億元人民幣，是當(dāng)今世界重大的公共衛(wèi)生問題〔1〕。中國膳食構(gòu)成以高鈉、低鉀為主，而人體鈉鹽的攝入量與高血壓患病率和機(jī)體血壓水平呈正相關(guān)〔2〕，這成為中國高血壓患者發(fā)病的重要危險(xiǎn)因素。然而，高血壓發(fā)病機(jī)制的復(fù)雜性使其臨床治療效果卻不盡如人意。研究表明，機(jī)體中氧化應(yīng)激是影響高血壓發(fā)生發(fā)展的重要機(jī)制〔3，4〕。有報(bào)道顯示，自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)血漿活性氧簇(ROS)、丙二醛(MDA)等氧化應(yīng)激指標(biāo)明顯增高，而抗氧化物質(zhì)超氧化物歧化酶(SOD)水平明顯降低〔5〕，說明降低高血壓患者體內(nèi)氧化應(yīng)激水平對高血壓的防治至關(guān)重要。玉米須是禾本科作物玉米的干燥花柱和柱頭，美國食品藥品管理局已確認(rèn)其為無毒、安全的物質(zhì)。玉米須提取物中含有多種化學(xué)成分，包括糖類、黃酮類、甾醇類、氨基酸、烷和無機(jī)元素等。玉米須多糖(PCS)是自玉米須中提取的水溶性提取物，含量達(dá)4%，具有明顯的抗氧化、降血糖、利尿、抑制腫瘤等作用〔6～8〕。本實(shí)驗(yàn)通過給予高鹽誘導(dǎo)的高血壓大鼠強(qiáng)飼PCS進(jìn)行干預(yù)，研究PCS抗氧化應(yīng)激作用對其血壓的影響，并探討其降壓機(jī)制。

1 材料和方法

1.1儀器及試劑 BP-100 無創(chuàng)血壓測量系統(tǒng)、BL-420E生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)(四川成都泰盟)；細(xì)胞超聲波破碎儀(美國Thermo Scientific公司)；高速冷凍離心機(jī)(美國Eppendorf公司)；PowerPC電泳儀、Trans-Blot轉(zhuǎn)移電泳槽(美國Bio-Rad公司)；752 型紫外分光光度計(jì)(上海光學(xué)儀器廠)等。還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶(NOX)2、NOX4抗體(英國Abcam公司)；marker(美國Thermo Scientific公司)；活體組織氧化應(yīng)激ROS初級熒光測定試劑盒(美國Genmed公司)；MDA、SOD測試盒(南京建成生物工程公司)；十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)凝膠配制試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)；聚偏氟乙烯(PVDF)膜(美國Millipore公司)。

1.2實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) Dahl鹽敏感雄性大鼠40只，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w，隨機(jī)分為正常飲食+生理鹽水(NS+vehicle)組、正常飲食+PCS(NS+PCS)組、高鹽飲食+生理鹽水(HS+vehicle)組、高鹽飲食+PCS(HS+PCS)組各10只。高鹽飲食中含8% NaCl，正常飲食中含0.3% NaCl，4 w后測量大鼠平均動(dòng)脈壓(MAP)，MAP達(dá)到120 mmHg以上視為模型建立成功；HS+PCS組在模型制備成功后強(qiáng)飼PCS(400 mg/kg)20 d，其余組強(qiáng)飼等體積生理鹽水。

1.3PCS提取 采集佳木斯地區(qū)成熟期的玉米須制備成干燥品，剪碎后利用水溶醇沉法提取PCS。利用D101大孔樹脂對粗提物進(jìn)行脫色，氯仿正丁醇(Sevage)法去除蛋白成分，再經(jīng)無水乙醇、95%乙醇、丙酮、乙醚多次進(jìn)行洗滌清除雜質(zhì)，使用透析袋進(jìn)行透析，干燥，用時(shí)采用生理鹽水現(xiàn)配現(xiàn)用。粗提率為3.21%。

1.4平均動(dòng)脈壓(MAP)測量及主動(dòng)脈采集 利用BP-100尾動(dòng)脈血壓測量儀測量清醒狀態(tài)下的大鼠的MAP，MAP=(收縮壓+2×舒張壓)/3。將清醒大鼠放入固定器，依次將阻斷器與傳感器套于大鼠的尾部，待大鼠平靜后測量血壓，取8次測量平均值。所有藥物干預(yù)結(jié)束后，采用BL-420E生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)經(jīng)頸動(dòng)脈插管測量大鼠MAP，結(jié)束后迅速采集胸主動(dòng)脈，一部分馬上進(jìn)行ROS水平檢測，另一部分-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5蛋白提取及定量 低溫狀態(tài)下取胸主動(dòng)脈研碎，洗滌，離心棄上清。加入冷存的50×蛋白酶抑制劑20 μl及蛋白裂解液1 ml，冰浴條件下放入細(xì)胞超聲破碎儀破碎，4℃下離心，13 000 r/min，15 min。取上清，使用二喹啉甲酸(BCA)法進(jìn)行蛋白質(zhì)定量檢測，-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6Western印跡檢測 按照凝膠配制試劑盒使用說明制備凝膠，將配好的凝膠按要求注入膠板空隙內(nèi)，插梳，備用。取出低溫保存的marker、樣品，使用微量上樣器將marker、樣品依次加入對應(yīng)的泳道。低溫狀態(tài)下電泳使蛋白分離。切膠，將厚濾紙、凝膠、PVDF膜、厚濾紙依次疊在一起，蓋好蓋板。接通電源，低電壓條件下轉(zhuǎn)膜。室溫封閉后，加入稀釋的一抗(NOX2、NOX4)，冰箱孵育過夜。取出過夜膜室溫下復(fù)溫，TBST洗滌，10 min/次，3次。加入相應(yīng)二抗，室溫下置于搖床孵育 1 h。 TBST 洗滌，10 min/次，3次。將洗滌好的膜置于化學(xué)發(fā)光成像儀內(nèi)，加電化學(xué)發(fā)光(ECL)液成像，拍照采集。對采集的圖像使用Quantity One軟件進(jìn)行分析。

1.7主動(dòng)脈ROS水平測定 取新鮮胸主動(dòng)脈，按照活體組織氧化應(yīng)激ROS初級熒光測定試劑盒說明操作，低溫下清理液清理后無菌濾紙吸干切碎，稀釋液充分混合勻漿，與染色工作液放入石英比色杯，激發(fā)波長490 nm，散發(fā)波長520 nm，熒光分光光度儀檢測。

1.8血漿MDA水平及SOD活力檢測 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后各組大鼠禁食12 h，采用腹腔注射10%水合氯醛麻醉，頸動(dòng)脈插管測量血壓后取血，2 000 r/min離心分離血漿。按照試劑盒的說明分別采用硫代巴比妥酸(TBA)法和水溶性四唑藍(lán)(WST)-1法檢測血漿MDA水平和SOD活力。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS17.0 軟件進(jìn)行方差分析、t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組不同給藥時(shí)間MAP變化比較 與NS+vehicle組相比，NS+PCS組無明顯差異(P>0.05)，HS+vehicle組和HS+PCS組MAP明顯增高(P<0.05)；與HS+vehicle組相比，HS+PCS組MAP從給藥第9天開始MAP明顯降低，到第20天時(shí)MAP最低(P<0.05)，見表1。

表1 各組不同給藥時(shí)間MAP比較

2.2各組主動(dòng)脈NOX2、NOX4表達(dá)、ROS、MDA水平及SOD活力比較 與NS+vehicle組相比，NS+PCS組各指標(biāo)無明顯差異(P>0.05)；HS+vehicle組和HS+PCS組主動(dòng)脈NOX2、NOX4蛋白表達(dá)、ROS及MDA水平明顯增高，而SOD活力明顯降低(均P<0.05)；與HS+vehicle組相比，HS+PCS組主動(dòng)脈NOX2、NOX4蛋白表達(dá)、ROS及MDA水平明顯降低，而SOD活力明顯增高(均P<0.05)，見圖1、表2。

圖1 各組主動(dòng)脈NOX2、NOX4表達(dá)

表2 各組主動(dòng)脈NOX2、NOX4、ROS及血漿MDA、SOD水平比較

3 討 論

高血壓作為多基因遺傳病，其發(fā)生發(fā)展受到環(huán)境和生活習(xí)慣等多種因素的影響。鈉鹽的過度攝入與高血壓發(fā)病密切相關(guān)。本研究結(jié)果進(jìn)一步證明了高鹽飲食是促進(jìn)高血壓發(fā)生的重要因素。目前對于PCS研究主要集中于其抗氧化、抗感染、降血糖和抑制腫瘤等作用〔6～8〕，其對于高血壓的影響及機(jī)制的研究尚需要更多的理論依據(jù)。本研究結(jié)果說明PCS對高鹽誘導(dǎo)的高血壓具有明顯的降壓效果，但其對于正常血壓者并未發(fā)生明顯影響，可見其治療高血壓具有安全性。這與一項(xiàng)研究中提出的PCS能明顯降低血壓的結(jié)果相一致〔9〕。

氧化應(yīng)激是氧自由基產(chǎn)生和消除失衡導(dǎo)致體內(nèi)ROS過量蓄積的過程，其與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。ROS在血管內(nèi)主要由NOX催化產(chǎn)生。人類NOX基因組包括NOX1、NOX2(即gp91phox)、NOX3、NOX4、NOX5、Duox1和Duox2共7個(gè)成員。其中NOX2和NOX4作為NADPH氧化酶的2個(gè)重要亞型，其在血管內(nèi)ROS的形成中至關(guān)重要〔10〕。SOD是體內(nèi)重要的抗氧化酶，可通過催化超氧陰離子發(fā)生歧化反應(yīng)而減少氧自由基對機(jī)體的損傷〔11〕。本研究結(jié)果說明主動(dòng)脈中NADPH氧化酶介導(dǎo)的ROS增加可能是促進(jìn)高血壓發(fā)生發(fā)展的重要機(jī)制。體內(nèi)蓄積的氧自由基能攻擊生物膜的多不飽和脂肪酸，從而引發(fā)脂質(zhì)過氧化，并形成脂質(zhì)過氧化物，如MDA。而SOD作為抗氧化酶是機(jī)體清除自由基的首要物質(zhì)，因此SOD活力測定常與MDA水平測定相互配合進(jìn)行，來反映機(jī)體清除氧自由基的能力和受自由基攻擊的嚴(yán)重程度〔12〕。本研究結(jié)果說明高血壓時(shí)機(jī)體抗氧化能力下降，血管中自由基引起的脂質(zhì)過氧化與高血壓密切相關(guān)。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果均說明血管氧化應(yīng)激反應(yīng)是高鹽誘導(dǎo)的高血壓的重要發(fā)病機(jī)制。

PCS具有明顯的抗氧化作用。研究表明，水提醇沉法制備的PCS清除超氧陰離子和羥基自由效果顯著〔7〕。本研究結(jié)果說明PCS可明顯有效抑制高血壓時(shí)血管ROS合成酶NOX2 和NOX4的表達(dá)，降低血管ROS水平，抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，同時(shí)增強(qiáng)血管抗氧化能力，從而改善高鹽誘導(dǎo)的高血壓。研究報(bào)道，高血壓時(shí)ROS水平失衡能促進(jìn)外周血管收縮，從而引起血壓進(jìn)一步升高〔13～15〕。結(jié)合PCS在本研究中對于高鹽誘導(dǎo)的高血壓的降壓作用，提示PCS可能通過降低血管氧化應(yīng)激反應(yīng)、增強(qiáng)抗氧化能力，并進(jìn)而影響血管舒縮功能，達(dá)到降低高鹽誘導(dǎo)的高血壓的作用。