胡博 劉妍慧 張兆鵬 于子晴 張茹 郭軍鵬 (長春中醫(yī)藥大學(xué)，吉林 長春 130117)

女性更年期后雌激素減少，成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞功能均處于亢進(jìn)狀態(tài)，由于骨吸收過程相對簡單、時(shí)間較短而成骨過程復(fù)雜、時(shí)間較長，導(dǎo)致骨量丟失而形成骨質(zhì)疏松(OP)。隨著中國步入老齡化社會(huì)，絕經(jīng)后OP(PMOP)已成為我國圍絕經(jīng)期婦女常見疾病〔1，2〕。世界衛(wèi)生組織(WHO)將高血壓、OP和冠心病列為三大老年病。目前全世界每年因OP并發(fā)骨折的人數(shù)達(dá)到900萬人，二十一世紀(jì)中葉骨折發(fā)生率會(huì)增加2～3倍，而PMOP患者又在其中占四分之三左右〔3〕。由此給患者的肉體和精神帶來極大痛苦，同時(shí)也給社會(huì)造成巨大的負(fù)擔(dān)。

PMOP屬慢性退行性疾病，發(fā)病隱匿，以雌激素減少為主要原因，還與氧化應(yīng)激、炎癥等因素有關(guān)〔4〕。其治療周期長，對藥物依從性有較高要求，目前并未找到較為理想的治療方案。雌激素替代療法(HRT)仍是治療PMOP首選方案，但單純使用雌激素僅能緩解癥狀，并不能治愈PMOP，而且長期服用有引起心肌梗死、肺栓塞、陰道出血、子宮內(nèi)膜癌、乳腺癌的危險(xiǎn)性，毒副作用堪憂〔5，6〕。中藥如左歸丸、右歸丸、六味地黃丸、大補(bǔ)陰丸等地黃丸類方已應(yīng)用于臨床治療OP，療效好，副作用少〔7〕，但未有學(xué)者就桂附地黃丸是否能治療PMOP進(jìn)行深討。本研究通過手術(shù)摘除雙側(cè)卵巢建立卵巢去勢OP小鼠模型，觀察桂附地黃丸水煎液對OP小鼠骨強(qiáng)度、骨鈣、炎癥介質(zhì)、氧化應(yīng)激和骨代謝指標(biāo)的影響，并通過蘇木素-伊紅(HE)染色觀察骨小梁用藥前后形態(tài)學(xué)變化，探索桂附地黃丸對PMOP小鼠的治療作用。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及試劑 雌性C57BL/6小鼠40只，體重20～22 g，購自遼寧長生生物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(沈)2020-0001。桂附地黃丸：桂枝、黑附子、熟地等，購自長春中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院。戊酸雌二醇(補(bǔ)佳樂)(1 mg/片，國藥準(zhǔn)字：J20171038)。骨鈣素(BGP)、白細(xì)胞介素(IL)-6、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)試劑盒，由北京華英生物技術(shù)研究所提供。

1.2主要儀器 小動(dòng)物骨骼強(qiáng)度測定儀(型號(hào)為YLS-16A)、低溫高速臺(tái)式離心機(jī)(德國賀利式公司)、奧林巴斯BX40顯微鏡(尼康)、Agilent 5100 ICP-OES(安捷倫科技有限公司)。

1.3分組建模及給藥 小鼠隨機(jī)分組：正常組、模型組、桂附地黃丸水煎液(桂附)組。采用水合氯醛腹腔麻醉后，無菌環(huán)境下從背部施行雙側(cè)卵巢切除術(shù)，除正常組外，模型組、桂附組均摘除雙側(cè)卵巢。術(shù)后3 d開始藥物干預(yù)，正常組、模型組自由飲水、進(jìn)食，桂附組以水煎液0.035 ml/(g·d)灌胃，每天1次，連續(xù)干預(yù)13 w后采集標(biāo)本進(jìn)行分析。

1.4骨強(qiáng)度檢測 右側(cè)脛骨標(biāo)本放置于小動(dòng)物骨骼強(qiáng)度儀測量支架上(跨距=10 mm)，以1 mm/min速度推壓小鼠脛骨中段至斷裂，記錄數(shù)值。實(shí)驗(yàn)過程中，保持脛腓骨均完整，且檢測過程處于同一水平受力面，以減少測量誤差。

1.5骨鈣含量測定 將干凈的左側(cè)股骨放入恒溫干燥箱中，溫度(110℃)烘干2 h，觀察骨頭狀態(tài)，以完全干燥為準(zhǔn)。將干燥完全的骨頭樣品放入搗藥罐中搗碎，稱量0.2 g放入消解罐中，隨即加入3 ml硝酸和0.5 ml過氧化氫。將消解罐按序號(hào)放入儀器中消解60 min，開蓋后放入趕酸儀中，溫度設(shè)置130℃，在通風(fēng)櫥中進(jìn)行趕酸，至剩余0.5 ml后冷卻。定容至100 ml。采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法，測定骨鈣含量〔8〕。

1.6血清指標(biāo)檢測 取離心后的上清液，按照說明書規(guī)范操作，以酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測血清BGP、IL-6、MDA、SOD水平。

1.7切片及染色 小鼠右側(cè)脛骨放入4%多聚甲醛固定1 w，流水沖洗干凈，加入4%乙二胺四乙酸(EDTA)脫鈣液2 w。樣本完全浸沒于脫鈣液中，24 h保持輕度搖晃，每24 h更換脫鈣液，14 d后完成脫鈣。沿矢狀面制成5 μm厚度切片，HE染色觀察股骨組織形態(tài)學(xué)變化。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS25.0軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1桂附地黃丸水煎液對骨強(qiáng)度的影響 模型組骨強(qiáng)度〔(1.07±0.06)kg〕較正常組〔(1.22±0.02)kg〕顯著降低(P<0.05)；與模型組相比，桂附組骨強(qiáng)度顯著增高〔(1.43±0.04)kg,P<0.01〕。

2.2桂附地黃丸水煎液對骨鈣含量的影響 模型組股骨鈣含量〔(11.22±0.30)mg/g〕顯著低于正常組〔(13.30±0.44)mg/g,P<0.01〕，桂附組股骨鈣含量〔(12.84±0.20)mg/g〕顯著高于模型組(P<0.01)。

2.3桂附地黃丸水煎液對血清細(xì)胞因子的影響 模型組BGP、IL-6和MDA水平均較正常組顯著升高(均P<0.05)。桂附組BGP、IL-6和MDA水平均較模型組顯著降低(均P<0.05)。模型組SOD水平較正常組顯著降低(P<0.05)，桂附組較模型組SOD水平顯著增高(P<0.05)。見表1。

表1 桂附地黃丸水煎液對血清細(xì)胞因子的影響

2.4桂附地黃丸水煎液對骨組織形態(tài)學(xué)影響 模型組脛骨骨小梁面積減少，排列紊亂，相互交接減少，骨干厚度變薄。與模型組相比，桂附組骨小梁面積增加，排列整齊，間隙變窄，骨干厚度增加。見圖1。

3 討 論

正常情況下人體骨骼處于骨吸收與骨形成的重構(gòu)，破骨細(xì)胞吸收的骨量與成骨細(xì)胞新形成的骨量處于動(dòng)態(tài)平衡。骨組織重構(gòu)包括三個(gè)階段：(1)破骨細(xì)胞在骨表面形成環(huán)形圍堤的溶骨微環(huán)境，消化和吸收骨組織，形成凹陷；(2)成骨細(xì)胞形成類骨質(zhì)，填補(bǔ)陷窩；(3)骨基質(zhì)礦化，鈣鹽沉積至細(xì)胞周圍基質(zhì)中。成年人骨吸收與骨形成持平，骨量保持著恒定狀態(tài)。女性絕經(jīng)后雌激素水平下降，破骨細(xì)胞的骨吸收作用增強(qiáng)，與成骨細(xì)胞的骨形成不平衡，繼而導(dǎo)致高轉(zhuǎn)化代謝性O(shè)P。PMOP以骨量減低、骨微結(jié)構(gòu)破壞為主要病理特征，并以全身骨痛及易發(fā)生骨折為臨床特點(diǎn)。

《黃帝內(nèi)經(jīng)》《千金方》中有OP相關(guān)記載，如“骨痿”“骨枯”“骨痹”“腎痹”等。手不能舉，腫痛而逆為骨痹，為冬季外感寒濕邪氣，流連骨髓，疼痛甚而影響活動(dòng)。骨髓減腰脊不舉為骨痿，為進(jìn)展階段，由外而內(nèi)迫臟腑，尻以代踵。脊以代頭為腎痹，是疾病危重階段，骨質(zhì)發(fā)生嚴(yán)重變形。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，“骨應(yīng)足少陰，少陰氣絕則骨枯”，OP病因多歸于腎，根本病機(jī)為腎精不足?！鹅`樞·本神》有云：“精傷則骨酸痿厥?！蹦I為先天之本，主骨生髓，主藏精，腎精是人體重要的精微物質(zhì)，稟受于父母，上古天真論以女七男八為一個(gè)階段，從人體生長壯老的整體觀闡釋人體腎精充盈情況在生命過程中的重要作用。腎精充足，則骨髓生化有源，骨骼得骨髓充養(yǎng)濡潤而堅(jiān)固有力，即筋骨勁強(qiáng)，肌肉滿壯；腎精虛少，則骨髓生化乏源，不能濡養(yǎng)骨骼，便會(huì)出現(xiàn)骨質(zhì)失養(yǎng)，骨枯不榮，影響骨的代謝。由此可見，早在古代醫(yī)家對OP的病因、病機(jī)和臨床表現(xiàn)就已有較為詳細(xì)和深入的觀察和研究。發(fā)展至今大家公認(rèn)：天癸為腎中所藏，父母賦予先天精氣，為至陰之精，有至陽之氣，陰中含陽，而后天化成形，可以調(diào)節(jié)生殖、內(nèi)分泌、充骨養(yǎng)髓的精微物質(zhì)，主導(dǎo)腎-天癸-沖任-胞宮軸。天癸竭，陰精、陽精均竭〔9，10〕。

研究發(fā)現(xiàn)，地黃丸家族通過多種途徑對PMOP發(fā)揮作用，在臨床和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中都取得良好療效。李微等〔11〕研究發(fā)現(xiàn)，右歸丸為大補(bǔ)命門火、溫補(bǔ)腎陽、填精益髓的方劑，可以調(diào)節(jié)垂體-腎上腺軸的功能狀態(tài)，抑制由雌激素下降引起的異常骨吸收。左歸丸滋補(bǔ)腎中真陰，通過調(diào)節(jié)β2腎上腺素受體(AR)介導(dǎo)的人核因子κB受體活化因子(RANK)配體(RANKL)/骨保護(hù)素(OPG)信號(hào)通路發(fā)揮作用。OPG一方面競爭性結(jié)合RANK，抑制RANK與RANKL結(jié)合，削弱RANKL促進(jìn)骨吸收；另一方面OPG受雌激素調(diào)控，作用于破骨細(xì)胞抑制骨吸收。另外，左歸丸通過上調(diào)雌激素受體的表達(dá)，繼而激活人骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)2/RUNT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(RUNX)2信號(hào)通路而參與骨代謝過程，增加骨礦含量和骨密度，增加雌激素分泌，明顯改善OP模型鼠的骨生物力學(xué)作用，實(shí)現(xiàn)對卵巢摘除OP模型小鼠的骨保護(hù)作用。于雪冰等〔12〕研究發(fā)現(xiàn)，滋補(bǔ)腎陰的經(jīng)典方劑六味地黃丸可能調(diào)節(jié)Janus激酶(JAK)/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活子(STAT)信號(hào)通路，促進(jìn)BGP合成，有效升高骨密度而改善PMOP。李玉星〔13〕研究發(fā)現(xiàn)，六味地黃丸對PMOP模型大鼠有早期干預(yù)作用，與模型組比較，六味地黃丸組可提高模型組大鼠骨密度及雌激素、鈣、磷水平，明顯減少骨小梁斷裂和髓腔內(nèi)脂肪細(xì)胞的比例，減少模型組肥胖的發(fā)生，最終延緩PMOP發(fā)生發(fā)展。張倩等〔14〕研究發(fā)現(xiàn)金匱腎氣丸可通過影響堿性磷酸酶、IL-6、OPG的表達(dá)，從而抑制破骨細(xì)胞活性，促進(jìn)骨形成，繼而改善骨組織微結(jié)構(gòu)，提高骨密度，改善OP。 陳一洲等〔15〕研究發(fā)現(xiàn)金匱腎氣丸通過調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin信號(hào)通路及下游Osterix、堿性磷酸酶成骨基因表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化，有效防治去勢小鼠OP。

桂附地黃丸源于《金匱要略》，是地黃丸類祖方，具有陰陽雙補(bǔ)之功效〔16〕。方中地黃、山茱萸歸肝腎經(jīng)，補(bǔ)益肝腎陰而攝精氣；山藥、茯苓性味甘平，入脾，健脾滲濕，澤瀉傾泄腎中水邪；丹皮清肝膽相火；桂枝、附子補(bǔ)火助陽，逐血痹、溫補(bǔ)命門真火。上述諸藥合用，集寒熱補(bǔ)瀉藥之大成，共奏平補(bǔ)腎陰腎陽之效。

雙側(cè)卵巢切除術(shù)造模使實(shí)驗(yàn)動(dòng)物雌激素減少，骨吸收增強(qiáng)，骨代謝呈負(fù)平衡，骨量逐漸丟失，形成OP。由于性激素的分泌減少，引起炎癥因子、活性氧分子增加及加速鈣磷代謝紊亂導(dǎo)致的骨丟失也是PMOP重要原因。研究表明，炎癥與OP存在明顯關(guān)系〔17〕。炎癥因子如IL-1、IL-4、IL-6等都能通過調(diào)節(jié)骨吸收的途徑影響OP。破骨細(xì)胞前體位于骨髓中，屬于單核巨噬細(xì)胞家族成員。許多炎癥因子有促進(jìn)破骨細(xì)胞分化和成熟的功能，在此過程中通過多條途徑對成骨細(xì)胞的凋亡和增殖分化進(jìn)行調(diào)控。結(jié)果導(dǎo)致破骨細(xì)胞分裂增殖，成骨細(xì)胞凋亡，從而直接促進(jìn)骨吸收導(dǎo)致OP發(fā)生。IL-6是由T細(xì)胞、B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞和破骨、成骨細(xì)胞分泌，以旁分泌形式作用于鄰近靶細(xì)胞，促進(jìn)破骨細(xì)胞形成并抑制成骨細(xì)胞分化〔18〕。 IL-6在靶細(xì)胞膜上與跨膜的IL-6受體形成受體復(fù)合物后〔19〕，進(jìn)一步招募gp130同源二聚體，通過gp130向下發(fā)出信號(hào)激活JAK2/STAT3等信號(hào)通路，從而促進(jìn)RANKL并抑制OPG表達(dá)，進(jìn)而間接地增強(qiáng)破骨細(xì)胞的骨吸收，加速骨丟失。IL-6作為免疫系統(tǒng)的重要細(xì)胞因子，可直接激活破骨細(xì)胞活性，導(dǎo)致骨吸收活動(dòng)增加，促進(jìn)OP發(fā)生發(fā)展。本研究結(jié)果說明桂附地黃丸可能通過調(diào)控體內(nèi)炎癥水平、抑制破骨分化而抗OP。研究表明〔20，21〕，氧化應(yīng)激與骨形成率下降及成骨細(xì)胞和骨細(xì)胞凋亡增加密切相關(guān)。SOD是體內(nèi)重要的抗氧化酶，能夠有效清除過氧化產(chǎn)生各種活性自由基，減輕氧化應(yīng)激損傷。MDA是體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物，能夠間接反映氧化應(yīng)激的程度〔22〕。本研究結(jié)果說明桂附地黃丸可能通過調(diào)節(jié)炎性反應(yīng)和氧化應(yīng)激反應(yīng)共同發(fā)揮抑制破骨細(xì)胞分化、維持骨穩(wěn)態(tài)的作用。BGP是由成骨細(xì)胞合成及分泌到骨組織中調(diào)節(jié)和維持骨鈣的非膠原蛋白，占骨基質(zhì)蛋白5%，其中70% BGP同羥基磷灰石結(jié)合后沉積于骨基質(zhì)中，余下30%分布于血液中，血清中BGP含量反映成骨細(xì)胞礦化功能及活性，是骨組織維持正常礦化速度的關(guān)鍵〔23〕。

骨重建過程中鈣、磷代謝在體內(nèi)維持動(dòng)態(tài)平衡是保證骨代謝正常進(jìn)行的物質(zhì)基礎(chǔ)。骨中的無機(jī)鹽稱之為骨鹽，主要成分為磷酸鈣鹽，是由鈣和磷共同形成的磷灰石結(jié)晶，占骨鹽成分的84%。研究顯示，OP大鼠骨鈣丟失的同時(shí)，血清中鈣含量也同步變化，兩者之間有一定的相關(guān)性〔24〕。

綜上，絕經(jīng)后婦女體內(nèi)雌激素合成減少，炎癥因子分泌增加，抗氧化作用減弱，破骨細(xì)胞增殖、分化和成熟增多，造成骨量丟失，最終導(dǎo)致OP。桂附地黃丸能抑制PMOP小鼠骨組織的炎癥與氧化應(yīng)激反應(yīng)，改善骨組織鈣磷代謝而發(fā)揮防治PMOP作用。