陳敬林，喻青青，呼延武，朱名安，李 蓮

(1.十堰市人民醫(yī)院(湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬人民醫(yī)院) 檢驗(yàn)科，湖北 十堰 442000;2.湖北醫(yī)藥學(xué)院生物醫(yī)藥研究院,湖北 十堰 442000)

心臟衰竭是指繼發(fā)于某些心血管疾病后引起的心力衰竭，心臟功能不足正常人的三分之一，心臟泵血功能出現(xiàn)障礙，有效射血得不到保障，不能滿足人體生理代謝要求，一旦運(yùn)動(dòng)可出現(xiàn)氣短、胸悶癥狀，部分可導(dǎo)致水腫，嚴(yán)重者可出現(xiàn)劇烈咳嗽[1]。目前，臨床診斷心臟衰竭基本借助于腦鈉肽(BNP)或氨基末端pro腦鈉肽(NT-proBNP)等血液標(biāo)志物，但特異性不高[2]。診斷心臟衰竭仍需更為簡單、客觀可行的循環(huán)標(biāo)志物。

心臟衰竭過程中可出現(xiàn)心肌細(xì)胞死亡、過度免疫反應(yīng)、心室肥大等病理變化[3]。有關(guān)研究表明[4]，microRNA(miRNA)采取旁分泌及自分泌方式可進(jìn)入體循環(huán)中，采取不同形式參與，以類激素方式調(diào)節(jié)細(xì)胞的各種生理功能，在分子水平影響著心臟衰竭的病程與預(yù)后。在miRNA家族中，極具代表意義的一員為miR-155，因其最初在腫瘤類患者血清中被發(fā)現(xiàn)，故被當(dāng)成致癌分子[5]。而后證實(shí)[6]，miR-155與免疫細(xì)胞等關(guān)系密切，可表達(dá)在多種免疫細(xì)胞上，調(diào)節(jié)各類免疫炎癥反應(yīng)。近年來發(fā)現(xiàn)[7]，miR-155可定向抑制白血病-6基因(Bcl-6)或B細(xì)胞淋巴瘤的表達(dá)而促使動(dòng)脈內(nèi)皮斑塊的產(chǎn)生，并以分子通道形式對(duì)血管內(nèi)皮產(chǎn)生調(diào)節(jié)作用。相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[8]，miRNA具備診斷疾病生物標(biāo)志物的穩(wěn)定性及特異性，與 BNP 相比具有一定的優(yōu)越性，可能成為心臟衰竭診斷的循環(huán)標(biāo)志物。然而，對(duì)于心臟衰竭而言，miR-155能否成為其診斷的標(biāo)志物仍需論證。本課題就此出發(fā)，分析miR-155在心臟衰竭患者血清中的表達(dá)及其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

本研究已獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，選擇2019年1月-2020年12月在心血管內(nèi)科住院的心臟衰竭患者 40 例為心衰組，納入標(biāo)準(zhǔn)：①均已根據(jù)臨床檢查和癥狀確診為心臟衰竭者；②紐約心臟協(xié)會(huì)(NYHA)心功能分級(jí)[9]Ⅱ-Ⅳ者；③所有研究對(duì)象均自愿參與并簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①嚴(yán)重器官組織疾病者；②合并惡性腫瘤及無法正常溝通者；③心臟瓣膜病、高血壓、肺心病、冠心病、代謝性疾病患者。

心衰組男性23例，女性17例，平均年齡(59.142±6.412)歲，平均體質(zhì)指數(shù)(BMI)為(21.426±1.134)kg/m2，其中NYHA心功能Ⅱ級(jí)14例、Ⅲ級(jí)15例、Ⅳ級(jí)11例。選取同期健康志愿者40例為對(duì)照組，其中男性24例，女性16例，平均年齡(58.945±6.371)歲，平均BMI為(21.412±1.135)kg/m2。兩組研究對(duì)象在年齡、性別、BMI上比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，可作進(jìn)一步比較。

1.2 方法

1.2.1PBMC分離及miR-155表達(dá)檢測(cè)

采集兩組研究對(duì)象清晨空腹靜脈血5 ml于EDTA-K2抗凝管中，采用Ficoll-Hypaque密度梯度離心法在1 h內(nèi)分離PBMC。從PBMC中用TRIzol試劑提取總RNA，具體操作參見試劑盒說明書。紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA樣品在波長260 nm和280 nm處的吸光度(A)值，A260/A280在1.8-2.0表示RNA純度較好。逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，檢測(cè)miR-155相對(duì)表達(dá)量用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法。miR-155、U6的逆轉(zhuǎn)錄和PCR引物均由上海生工合成。miR-155上游引物：5’- GGA GGT TAA TGC TAA TCG TGA TAG-3’，下游引物：5’-GTG CAG GGT CCG AGG T-3’，擴(kuò)增長度60 bp；以U6為內(nèi)參，上游引物：5’-GCT TCG GCA GCA CAT ATA CTA AAA T-3’，下游引物：5’-CGC TTC ACG AAT TTG CGT GTC AT-3’，擴(kuò)增長度94 bp。PCR反應(yīng)體系50 μl：2×PCR Master Mix 25 μl，5 μmol/L的上、下游引物各0.5 μl，cDNA 5 μl，去離子水加至50 μl。PCR反應(yīng)條件：95℃ 10 s，95℃ 15s，60℃ 60 s，循環(huán)40次。通過Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)起始模板進(jìn)行定量分析，用2-ΔΔCt表示miR-155相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)用淋巴細(xì)胞分離液購于美國GE公司，TRIzol試劑購于美國 Invitrogen公司，紫外分光光度計(jì)購于日本Shimadzu公司，Reverse Transcription System購于美國Promega公司，SYBR Green PCR Master Mix Kit、實(shí)時(shí)定量PCR儀購于美國Applied Biosystems公司。

1.2.2生化指標(biāo)檢測(cè)

采集兩組研究對(duì)象清晨空腹肘靜脈血3 ml，離心分離出血清，血清肌酐(Cr)用Beckman LX20全自動(dòng)生化分析儀采用酶法測(cè)定，超敏C反應(yīng)蛋白(hs-CRP)用Beckman LX20全自動(dòng)生化分析儀采用免疫透色比濁法測(cè)定，BNP用Beckman Coulter Unicel Dxi 800采用化學(xué)發(fā)光法測(cè)定，所有項(xiàng)目均使用該儀器的配套試劑盒，并按說明書規(guī)范操作。

1.2.3心功能指標(biāo)檢查

兩組研究對(duì)象均行彩色多普勒超聲檢查(彩色多普勒超聲診斷儀，荷蘭Philips公司)，記錄左心室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)和左心室舒張末期內(nèi)徑(LVEDd)，同時(shí)測(cè)量其收縮壓(SBP)、舒張壓(DBP)。

1.3 觀察指標(biāo)

①比較對(duì)照組患者、心衰組患者、心功能Ⅱ級(jí)、Ⅲ級(jí)及Ⅳ級(jí)患者的血清miR-155相對(duì)表達(dá)量、生化指標(biāo)(Cr、hs-CRP、BNP)及心功能指標(biāo)(LVEF、LVEDd、SBP、DBP)水平；②采用Pearson相關(guān)性分析心衰組miR-155相對(duì)表達(dá)量與Cr、hs-CRP、BNP水平相關(guān)性；③采用Pearson相關(guān)性分析心衰組miR-155相對(duì)表達(dá)量與LVEF、LVEDd、SBP、DBP的相關(guān)性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)均由SPSS21.0專業(yè)統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，并采用獨(dú)立樣本的t和F檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率表示，兩組間比較采用χ2檢驗(yàn)；變量間的關(guān)系采用Pearson線性相關(guān)分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 對(duì)照組與心衰組的血清miR-155相對(duì)表達(dá)量、生化指標(biāo)、心功能指標(biāo)比較

心衰組患者血清miR-155相對(duì)表達(dá)量、Cr水平、hs-CRP水平、BNP水平及LVEDd均顯著高于對(duì)照組(P均<0.05)，心衰組患者的LVEF明顯低于對(duì)照組(P<0.05)，兩組研究對(duì)象SBP、DBP比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

表1 兩組患者的miR-155、Cr、hs-CRP、BNP、LVEF、LVEDd、SBP、DBP比較

2.2 不同心功能分級(jí)患者的血清miR-155相對(duì)表達(dá)量、生化指標(biāo)、心功能指標(biāo)比較

Ⅳ級(jí)組心臟衰竭患者的血清miR-155相對(duì)表達(dá)量、Cr水平、hs-CRP水平、BNP水平及LVEDd均顯著高于Ⅲ級(jí)組(P均<0.05)和Ⅱ級(jí)組(P均<0.05)，同時(shí)Ⅲ級(jí)組均明顯高于Ⅱ級(jí)組(P均<0.05)；Ⅳ級(jí)組心臟衰竭患者的LVEF及SBP水平明顯低于Ⅲ級(jí)組(P均<0.05)和Ⅱ級(jí)組(P均<0.05)，同時(shí)Ⅲ級(jí)組明顯低于Ⅱ級(jí)組(P均<0.05)，不同心功能分級(jí)患者DBP水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

表2 不同心功能分級(jí)患者間miR-155、Cr、hs-CRP、BNP、LVEF、LVEDd、SBP、DBP水平比較

2.3 miR-155與各生化指標(biāo)的Pearson相關(guān)性分析

Pearson相關(guān)性分析顯示，miR-155與Cr、hs-CRP、BNP呈正相關(guān)(r=0.221,0.685,0.746，P均<0.001)，見表3。

表3 miR-155與各生化指標(biāo)Pearson相關(guān)性分析

2.4 miR-155與心功能各指標(biāo)的Pearson相關(guān)性分析

Pearson相關(guān)性分析，miR-155與LVEF、SBP呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.637,-0.248,P均<0.001)，與LVEDd呈顯著正相關(guān)(r=0.458,P<0.001)，與DBP無相關(guān)性(P>0.05)，見表4。

表4 miR-155與心功能各指標(biāo)的Pearson相關(guān)性分析

3 討論

隨著心臟衰竭病程的進(jìn)展，機(jī)體各器官組織的供血長期得不到滿足，可造成組織器官細(xì)胞缺血缺氧，導(dǎo)致細(xì)胞程序性死亡，嚴(yán)重影響組織器官的正常功能，甚至發(fā)生休克[10]。由此可見，提高心臟衰竭早期診斷的準(zhǔn)確性尤為重要。目前，臨床通過血清標(biāo)志物水平、心電圖、心臟彩超、超聲心動(dòng)圖、胸部X線等檢查結(jié)果作為心臟衰竭的常用評(píng)估方式[11]。但對(duì)于結(jié)果及體征不典型的患者，通常無法對(duì)病情進(jìn)行準(zhǔn)確評(píng)估，因此急需更為簡單、客觀可行的循環(huán)標(biāo)志物，為心臟衰竭患者提供高效的治療[12]。

miRNA生物學(xué)作用是以抑制翻譯或降解目標(biāo)mRNA為主，多種生理、病理反應(yīng)均可參與調(diào)節(jié)，如組織發(fā)育，細(xì)胞的繁殖、分化及程序性死亡，在心血管疾病中發(fā)揮多種調(diào)節(jié)機(jī)制，在其病程進(jìn)展中起著關(guān)鍵影響[13]。然而，miR-155屬于家族miRNA中的一員，廣泛表達(dá)于各類細(xì)胞中，多種免疫調(diào)節(jié)反應(yīng)都有參與，如促進(jìn)肺纖維化的進(jìn)程，抑制癌細(xì)胞表達(dá)，可調(diào)動(dòng)巨噬程序性死亡，并影響心臟衰竭的發(fā)生，對(duì)其病程的進(jìn)展起指導(dǎo)作用[14]。又有報(bào)道[15]，miR-155與免疫炎性因子關(guān)系緊密，可通過免疫反應(yīng)加快冠心病病程的進(jìn)展。本研究發(fā)現(xiàn)，心臟衰竭患者miR-155相對(duì)含量明顯增多，并隨心功能分級(jí)的增加而增多，相比對(duì)照組具有顯著差異，證實(shí)了miR-155在心臟衰竭患者體內(nèi)呈現(xiàn)高表達(dá)，其相對(duì)含量增多的程度與心臟衰竭的程度密切相關(guān)，并對(duì)診斷心臟衰竭有重要意義，說明miR-155可考慮作為其診斷指標(biāo)及病情程度判斷的標(biāo)準(zhǔn)，并提示在心臟衰竭病程發(fā)展中，miR-155可能在多方面都有參與，可能嚴(yán)重影響其病情進(jìn)展。

本研究結(jié)果顯示，心臟衰竭患者Cr、hs-CRP、BNP表達(dá)水平明顯高于同期健康志愿者，且隨心臟衰竭患者心功能分級(jí)而升高，證實(shí)了心臟衰竭發(fā)生后，miR-155可通過調(diào)節(jié)多種免疫反應(yīng)，促進(jìn)hs-CRP的分泌，同時(shí)機(jī)體由于長期的供血不足及免疫炎癥反應(yīng)的加劇，心室壓力增大等，最后導(dǎo)致Cr、hs-CRP、BNP水平升高，且血清Cr、hs-CRP、BNP水平的升高程度對(duì)判斷心臟衰竭的程度提供重要依據(jù)。同時(shí)Pearson相關(guān)性分析顯示，miR-155相對(duì)含量與血清Cr、hs-CRP、BNP水平呈正相關(guān)，提示心臟衰竭患者隨著miR-155相對(duì)含量的增多，血清Cr、hs-CRP、BNP水平也隨之升高。分析原因如下：①Cr作為腎功能的指標(biāo)之一，當(dāng)發(fā)生心臟衰竭時(shí)，血液循環(huán)障礙嚴(yán)重影響腎臟功能的正常運(yùn)行，可導(dǎo)致Cr水平的不斷升高[16]；②hs-CRP通過激活補(bǔ)體，血管內(nèi)膜被損傷，增加了心血管疾病的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，其水平變化對(duì)監(jiān)測(cè)心血管疾病病情程度有重要意義[17]；③BNP具有擴(kuò)血管、抗容量負(fù)荷、利尿等作用，是心室壓力及容積改變時(shí)產(chǎn)生的一種物質(zhì)，成為心血管疾病突發(fā)的一個(gè)危險(xiǎn)因素，同時(shí)也是其重要診斷指標(biāo)[18]。本次研究結(jié)果還顯示，心臟衰竭患者LVEF顯著低于同期健康志愿者；LVEDd顯著高于同期健康志愿者；兩組研究對(duì)象SBP、DBP比較，無明顯差異；LVEF、SBP水平隨心功能分級(jí)升高而降低，LVEDd隨心功能分級(jí)增高而增大，不同心功能分級(jí)患者DBP水平并無明顯差異。證實(shí)了心臟衰竭患者心臟結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，心臟收縮功能受損嚴(yán)重，引起血液循環(huán)障礙，同時(shí)也說明LVEF、LVEDd、SBP可作為心臟衰竭程度的評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)。通過Pearson相關(guān)性分析，心臟衰竭患者miR-155與LVEF、SBP呈負(fù)相關(guān)，與LVEDd呈正相關(guān)，與DBP無相關(guān)性。說明心臟衰竭患者隨著miR-155相對(duì)含量的增多，心臟功能的衰減，LVEF、SBP水平反而越低，反之，LVEDd越大。究其原因，分析如下：①心臟彩超檢查指標(biāo)LVEF為心臟收縮期和舒張期之比，對(duì)心室功能可準(zhǔn)確反應(yīng)，其比值低于50%，提示左心室功能出現(xiàn)異常，且其比值越低，表示心臟衰竭程度越嚴(yán)重[19]；②LVEDd表示其值越大，其收縮功能越差，心功能分級(jí)越高[20]。本研究的創(chuàng)新之處在于分析miR-155對(duì)于診斷心臟衰竭的臨床意義及其相對(duì)表達(dá)量與生化指標(biāo)、心功能指標(biāo)的相關(guān)性，對(duì)未來臨床診療工作有一定指導(dǎo)意義，但由于本次研究標(biāo)本量較小，且研究對(duì)象為同一單位，其結(jié)果可能存在地區(qū)性偏差，后期可增大標(biāo)本量多地區(qū)同時(shí)研究。

綜上所述，血清miR-155在心臟衰竭患者體內(nèi)呈高表達(dá)，其相對(duì)表達(dá)量變化與患者心功能及部分生化指標(biāo)密切相關(guān)，可考慮其作為診斷心臟衰竭的循環(huán)標(biāo)志物。