趙蔓嘉，范世光，趙愛(ài)農(nóng)，梁再賦，傅煒昕

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，沈陽(yáng) 110122）

P物質(zhì)（substance P，SP）最初被認(rèn)為是感覺(jué)神經(jīng)遞質(zhì)，廣泛分布于中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)，可參與機(jī)體多種生理病理過(guò)程，包括疼痛感知，免疫細(xì)胞增殖、趨化及炎癥等，并在心血管、呼吸和消化系統(tǒng)中發(fā)揮作用［1-3］。許多免疫細(xì)胞也可產(chǎn)生SP，SP在免疫系統(tǒng)中以旁分泌和自分泌的形式調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞功能，如促進(jìn)免疫細(xì)胞增殖和分化，影響免疫球蛋白的合成及細(xì)胞因子分泌等［4-5］。SP還通過(guò)調(diào)節(jié)趨化因子和黏附分子的表達(dá)，對(duì)免疫細(xì)胞的遷移發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用［5-6］。SP的生物學(xué)功能由3種受體NK-1R、NK-2R、NK-3R介導(dǎo)，其中NK-1R與SP的親和力最高，故NK-1R為主要介導(dǎo)者［7-8］。研究［9］表明，NK-1R信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是T細(xì)胞活化的最佳Ca2+通量所必需的。CD4和CD8 T細(xì)胞都表達(dá)功能性NK-1R，在同源T細(xì)胞活化過(guò)程中自分泌/旁分泌的SP激活NK-1R信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，從而增加T細(xì)胞受體（T cell receptor，TCR）信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)后的Ca2+通量，這種作用對(duì)于后續(xù)的啟動(dòng)白細(xì)胞介素-2（interleukin-2，IL-2）合成、T細(xì)胞存活以及輔助性T（helper T，Th）細(xì)胞1和Th17細(xì)胞極化的下游信號(hào)通路是必需的。

自然殺傷（natural killer，NK）細(xì)胞是固有免疫的主要承擔(dān)者，在機(jī)體早期抗感染、抗腫瘤免疫中發(fā)揮重要作用［10-11］。NK細(xì)胞識(shí)別靶細(xì)胞后激活，受控于自身共表達(dá)的活化性受體和抑制性受體的動(dòng)態(tài)信號(hào)平衡［11-13］。研究［14-15］證明，SP對(duì)NK細(xì)胞功能具有調(diào)節(jié)作用，SP可刺激NK細(xì)胞遷移及細(xì)胞毒活性［6，15］。另有研究［16］發(fā)現(xiàn)，某些病理狀態(tài)下，循環(huán)SP濃度升高可損傷NK細(xì)胞功能，抑制NK細(xì)胞殺傷活性。說(shuō)明SP在不同條件下對(duì)NK細(xì)胞的作用不同，提示SP對(duì)NK細(xì)胞的調(diào)控作用具有復(fù)雜性和多樣性，SP主要通過(guò)NK-1R調(diào)節(jié)NK細(xì)胞功能［16-17］，但確切的信號(hào)通路及機(jī)制還不十分明確。本研究選用NK92-MI細(xì)胞作為研究體系，體外研究SP對(duì)NK92-MI細(xì)胞增殖、殺傷活性的影響，并探討SP受體NK-1R在SP調(diào)控NK細(xì)胞活性中的作用及可能的信號(hào)分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

NK92-MI細(xì)胞為非IL-2依賴的NK92細(xì)胞株，購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)。SP購(gòu)自美國(guó)Sigma公司?？筃K-1R單克隆抗體、抗環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)元件結(jié)合蛋白（cyclic adenosine monophosphate response element binding protein，CREB）/p-CREB單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。FITC標(biāo)記的二抗購(gòu)自北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)：用含12.5%胎牛血清和12.5%馬血清的α-MEM培養(yǎng)基（不含RNA和DNA），在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)NK92-MI細(xì)胞。

1.2.2 MTT釋放法檢測(cè)SP對(duì)NK92-MI細(xì)胞增殖的影響：NK92-MI細(xì)胞（1×105/mL）接種于96孔培養(yǎng)板（100 μL/孔），加入10-12mol/L的SP（100 μL/孔），于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育；分別于孵育24、48和72 h加入MTT液，繼續(xù)孵育4 h；加入DMSO和甘氨酸緩沖液溶解甲臜結(jié)晶，用酶標(biāo)儀于570 nm處測(cè)定吸光度（optical density，OD）值。用特異性NK-1R拮抗劑［D-Arg1，D-Phe5，D-Trp7，D-Trp9，Leu11］ SP（10-7mol/L）預(yù)處理NK92-MI細(xì)胞30 min，再用10-12mol/L SP作用48 h，MTT法檢測(cè)NK92-MI細(xì)胞的增殖活性。

1.2.3 MTT釋放法檢測(cè)SP對(duì)NK92-MI殺傷活性的影響：（1）將4×105/mL的NK92-MI細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞接種至96孔培養(yǎng)板（100 μL/孔），加入10-12mol/L SP（100 μL/孔）作用24 h；將1×105/mL的K562細(xì)胞作為靶細(xì)胞，接種至實(shí)驗(yàn)孔（100 μL/孔），使效靶細(xì)胞比為4 ∶1；效靶細(xì)胞共同孵育4 h后，加入MTT液孵育4 h；加入DMSO和甘氨酸緩沖液，振蕩15～20 min后，用酶標(biāo)儀測(cè)定570 nm OD值。計(jì)算NK-92MI細(xì)胞對(duì)K562細(xì)胞的殺傷率，殺傷率（%）=［1-（殺傷實(shí)驗(yàn)組OD值-效應(yīng)細(xì)胞對(duì)照組OD值）/靶細(xì)胞對(duì)照組OD值］×100。（2）用特異性NK-1R拮抗劑預(yù)處理NK92-MI細(xì)胞30 min，再用10-12mol/L SP作用24 h，MTT法檢測(cè)NK92-MI細(xì)胞對(duì)K562細(xì)胞的殺傷活性。

1.2.4 熒光定量PCR：采用TRIzol法提取NK92-MI細(xì)胞總RNA，經(jīng)37 ℃、15 min反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)體系10 μL［5×Prime ScriptTMBuffer 4.0 μL，Prime ScriptTMEnzyme MixⅠ 0.5 μL，50 μmol/L Oligo dT primer 0.5 μL，100 μmol/L random 6 mers 0.5 μL，total RNA（﹤500 ng）1.0 μL，RNase Free dH2O 3.5 μL］。PCR反應(yīng)為兩步法，95 ℃30 s預(yù)變性；95 ℃5 s，60 ℃34 s，40個(gè)循環(huán)。PCR反應(yīng)體系20 μL ［SYBY Primix Ex TaqTM（2×）10 μL，PCR上下游引物（10 μmol/L）各0.4 μL，ROX Reference Dye Ⅱ（50×）0.4 μL，模版cDNA 2.0 μL，dH2O 6.8 μL］。用Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)NK-1R引物，由金思特科技有限公司（南京）合成。引物序列，正向5’-TCCACTAACACCTCGGAACC-3’，反向5’-ACA GGCCGTAGTACCATTGG-3’。應(yīng)用ABI PRISM 7500 Real-Time PCR System進(jìn)行檢測(cè)，以18SrRNA作為參照基因，用2-ΔΔCt法比較實(shí)驗(yàn)組相對(duì)表達(dá)量與對(duì)照組的倍數(shù)差異［18］，ΔΔCt=實(shí)驗(yàn)組ΔCt-對(duì)照組ΔCt。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)NK-1R的膜表達(dá)：用10-12mol/L SP處理NK-92MI細(xì)胞24 h，收集、洗滌細(xì)胞，加入無(wú)標(biāo)記的抗NK-1R單克隆抗體，4 ℃孵育40 min；洗滌細(xì)胞后，再加入FITC標(biāo)記的二抗，4 ℃繼續(xù)孵育40 min，洗滌細(xì)胞后應(yīng)用FACScan流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)分析。

1.2.6 Fura-2/AM熒光探針?lè)z測(cè)NK92-MI細(xì)胞胞質(zhì)鈣濃度：用10-12mol/L SP處理NK-92MI細(xì)胞1 h，收集、洗滌細(xì)胞，加入Fura-2/AM/DMSO液（終濃度為5 μmol/L），37 ℃避光振蕩孵育30 min；洗滌細(xì)胞后于25 ℃放置30 min，使Fura-2/AM完全去酯化；上機(jī)測(cè)定熒光強(qiáng)度F，加入10%Triton X-100（10 μL），測(cè)定飽和Ca2+溶液的熒光強(qiáng)度Fmax；各管加入EGTA 10 μL，測(cè)定零Ca2+溶液的熒光強(qiáng)度Fmin。按下列雙波長(zhǎng)探針測(cè)定的計(jì)算公式計(jì)算胞質(zhì)Ca2+濃度，鈣含量［Ca2+］=Kd×（R-Rmin）/（R-Rmax）×F2min/F2max，R=Fλ1/ Fλ2，Rmin=F1min/F2min，Rmax=F1max/F2max。Fλ1和 Fλ2分別為在波長(zhǎng)λ1與λ2時(shí)的熒光強(qiáng)度；F1min和F2min分別為零Ca2+溶液在波長(zhǎng)λ1與λ2時(shí)的熒光強(qiáng)度；F1max和F2max分別為飽和Ca2+溶液在波長(zhǎng)λ1與λ2時(shí)的熒光強(qiáng)度。

1.2.7 Western blotting測(cè)定CREB磷酸化水平：用10-12mol/L SP作用NK-92MI細(xì)胞1 h，收集1×107個(gè)細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白并定量，行聚丙烯酰胺凝膠電泳。室溫、50 V（100 mA）轉(zhuǎn)印PVDF膜3 h。轉(zhuǎn)印膜漂洗后，加入封閉液（10%牛奶）于4 ℃搖床封閉過(guò)夜。加入抗CREB/p-CREB單克隆抗體（1 ∶1 000稀釋），室溫孵育2.5 h；漂洗后，加入二抗（1 ∶2 000稀釋）孵育1 h。以β-actin作為內(nèi)參照。用ECL試劑顯影、檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。數(shù)據(jù)以表示，組間比較采用單因素方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SP促進(jìn)NK92-MI細(xì)胞增殖活性

MTT結(jié)果顯示，10-12mol/L SP可促進(jìn)NK92-MI細(xì)胞的增殖活性，且作用48 h促增殖活性最強(qiáng)（圖1A）。NK-1R拮抗劑可完全阻斷SP的促增殖活性（圖1B）。提示SP通過(guò)NK-1R發(fā)揮其對(duì)NK細(xì)胞的促增殖活性。

圖1 SP對(duì)NK-92MI細(xì)胞增殖活性的影響Fig.1 Effects of SP on NK-92MI cell proliferation

2.2 SP對(duì)NK92-MI細(xì)胞殺傷活性的影響

MTT結(jié)果顯示，經(jīng)10-12mol/L SP作用24 h后，NK92-MI細(xì)胞對(duì)K562細(xì)胞的殺傷活性（效靶細(xì)胞比為4 ∶1）明顯增強(qiáng)（P<0.01），且NK-1R拮抗劑可大部分阻斷SP的增強(qiáng)作用（圖2）。

圖2 SP對(duì)NK92-MI細(xì)胞殺傷活性的影響Fig.2 Effects of SP on NK-92MI cell killing activity

2.3 SP啟動(dòng)NK-1R受體及Ca2+信號(hào)通路

熒光定量PCR結(jié)果顯示，10-12mol/L SP作用1 h即可促進(jìn)NK92-MI細(xì)胞的NK-1RmRNA表達(dá)，作用4 h使NK-1RmRNA表達(dá)上調(diào)至最高水平；至24 h時(shí)，NK-1RmRNA表達(dá)水平回落至正常（圖3A）。10-12mol/L SP作用1～4 h，NK92-MI細(xì)胞的NK-1R膜表達(dá)無(wú)明顯變化，作用至24 h，NK-1R的膜表達(dá)明顯增加（圖3B、3D）。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，SP作用1 h即可引起NK92-MI細(xì)胞胞質(zhì)Ca2+濃度明顯升高，而作用至24 h，Ca2+濃度回落至基礎(chǔ)水平（圖3C）。上述結(jié)果表明，SP通過(guò)增加NK-1R的表達(dá)及激活Ca2+信號(hào)通路，發(fā)揮對(duì)NK92-MI細(xì)胞活性的調(diào)節(jié)作用。

圖3 SP對(duì)NK-1R及Ca2+信號(hào)通路的作用Fig.3 Effects of SP on NK-1R and Ca2+ signaling pathway

2.4 SP誘導(dǎo)NK92-MI細(xì)胞CREB磷酸化

選擇NK-1RmRNA表達(dá)水平和Ca2+濃度均增高的時(shí)間點(diǎn)，檢測(cè)CREB的磷酸化狀態(tài)。結(jié)果顯示，未受SP作用的NK92-MI細(xì)胞p-CREB水平較低，10-12mol/L SP作用1 h后p-CREB的水平明顯增高，表明SP可誘導(dǎo)CREB磷酸化而活化CREB。

圖4 SP誘導(dǎo)NK-92MI細(xì)胞CREB磷酸化Fig.4 SP induces CREB phosphorylation in NK-92MI cells

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，SP可有效促進(jìn)NK92-MI細(xì)胞的增殖和殺傷活性，且該促進(jìn)作用可被SP受體（NK-1R）拮抗劑完全阻斷和大部分阻斷。另一方面，SP可誘導(dǎo)NK92-MI細(xì)胞NK-1R的表達(dá)增加，說(shuō)明SP可通過(guò)NK-1R的表達(dá)來(lái)介導(dǎo)其對(duì)NK92-MI細(xì)胞活性的促進(jìn)作用。

NK-1R廣泛分布于神經(jīng)系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)，且在免疫系統(tǒng)中主要參與介導(dǎo)調(diào)節(jié)功能［6，19］。NK-1R為G蛋白耦聯(lián)受體（G protein-coupled receptors，GPCRs），與高親和性配體相互作用，通過(guò)不同的G蛋白產(chǎn)生不同的第二信使而發(fā)揮作用。主要有2條下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，環(huán)磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）信號(hào)途徑和磷脂酰肌醇信號(hào)途徑。NK-1R與Gαq蛋白作用誘導(dǎo)磷酯酶C活化，導(dǎo)致胞內(nèi)三磷酸肌醇（inositol triphosphate，IP3）和甘油二酯迅速產(chǎn)生，并增加胞質(zhì)Ca2+作為第二信使［9，11，20］。cAMP則被與NK-1R結(jié)合的Gαs蛋白激活［5，11］。NK-1R與SP結(jié)合活化可激活幾種第二信使，包括鈣（Ca2+）、IP3、蛋白激酶C、促分裂原活化蛋白激酶和轉(zhuǎn)錄因子核因子κB及CREB等［20-21］。SP與NK-1R結(jié)合通過(guò)Gαs激活腺苷環(huán)化酶，使cAMP水平升高，而激活依賴于cAMP的蛋白激酶A（protein kinase A，PAK）；活化的PAK進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，使轉(zhuǎn)錄因子CREB磷酸化，從而具有轉(zhuǎn)錄活性，啟動(dòng)下游基因的轉(zhuǎn)錄，完成信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑［21-22］。

前期研究［17］結(jié)果顯示，SP通過(guò)NK-1R介導(dǎo)胞質(zhì)Gαs的上調(diào)和Cαi信號(hào)通路參與了其增強(qiáng)NK92-MI細(xì)胞殺傷活性及對(duì)殺傷介質(zhì)穿孔素和顆粒酶B表達(dá)的促進(jìn)作用。本研究結(jié)果表明，SP可促進(jìn)NK92-MI細(xì)胞胞質(zhì)Ca2+濃度迅速升高，提示Ca2+依賴的信號(hào)通路啟動(dòng)了NK-1R，或部分參與了NK-1R介導(dǎo)的SP活化NK92-MI細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。

本研究結(jié)果顯示，SP通過(guò)增加CREB的磷酸化而活化CREB。CREB是一種堿性亮氨酸拉鏈轉(zhuǎn)錄因子，可由細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶、Ca2+和應(yīng)急刺激等信號(hào)通過(guò)Ser133位點(diǎn)的磷酸化來(lái)激活，繼而選擇性活化一系列下游基因［23-24］。前期研究數(shù)據(jù)表明，SP可在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)NK細(xì)胞的活性，即上調(diào)殺傷介質(zhì)穿孔素、顆粒酶B以及受體NCRs、NKG2D和NKG2A的mRNA水平。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)cAMP通路參與了NK-1R介導(dǎo)的SP對(duì)NK92-MI細(xì)胞的活化，且Ca2+和CREB是關(guān)鍵信號(hào)分子，這些結(jié)果有助于更好地了解SP調(diào)控NK細(xì)胞功能的作用機(jī)制。