侯丹鳳，張家紅，宋鑒清

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗(yàn)科，沈陽 110001）

活化部分凝血活酶時(shí)間（activated partial thromboplastin time，APTT）糾正試驗(yàn)是對不明原因APTT延長的患者進(jìn)行原因篩查的一線試驗(yàn)方法，可為指導(dǎo)臨床診斷治療提供重要的參考。當(dāng)患者血漿和正?；旌涎獫{（normal pooled plasma，NPP）混合后APTT結(jié)果被糾正，表明患者血漿中凝血因子不足，因此可進(jìn)行特異性因子活性測定以確定缺乏的凝血因子。當(dāng)混合后APTT結(jié)果并未被糾正，表明有抑制劑的存在，如狼瘡抗凝物（lupus anticoagulant，LA）或特定的凝血因子抑制物，前者是即刻反應(yīng)抑制物，后者主要是凝血因子Ⅷ（FⅧ）抑制物，通常依賴于時(shí)間和溫度。目前臨床上暫無統(tǒng)一的結(jié)果判定方法和臨界值［1］。國內(nèi)實(shí)驗(yàn)室大部分使用國外小樣本研究所得數(shù)據(jù)，并未建立更適合國內(nèi)及本實(shí)驗(yàn)室檢測系統(tǒng)的臨界值，因此，對于結(jié)果的解釋有時(shí)并不恰當(dāng)。本研究擬建立4種常用APTT糾正試驗(yàn)結(jié)果判定方法臨界值，并進(jìn)行效果評價(jià)，旨在選擇更適合本實(shí)驗(yàn)室的方法。完整的APTT糾正試驗(yàn)包括即刻試驗(yàn)和孵育試驗(yàn)，本研究僅對即刻試驗(yàn)進(jìn)行分析。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 一般資料：回顧性分析2019年3月至2021年10月就診于中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院不明原因APTT延長并進(jìn)行APTT糾正試驗(yàn)，且明確APTT延長原因的116例患者的資料。其中，抑制物陽性71例，因子缺乏45例；抑制物陽性包括LA陽性61例，F(xiàn)Ⅷ抑制物陽性9例，F(xiàn)Ⅴ抑制物陽性1例；因子缺乏包括vWD2例，F(xiàn)Ⅻ缺乏10例，F(xiàn)Ⅺ缺乏3例，F(xiàn)Ⅸ缺乏4例，F(xiàn)Ⅷ缺乏13例，F(xiàn)Ⅴ缺乏2例，F(xiàn)Ⅱ缺乏1例，同時(shí)也收集了使用華法林導(dǎo)致多因子缺乏標(biāo)本10例。男42例，女74例，中位年齡43.5（1～78）歲。通過凝血因子檢測明確所缺乏凝血因子及其水平，通過稀釋蝰蛇毒凝血時(shí)間試驗(yàn)和硅凝固時(shí)間試驗(yàn)檢測LA，且檢測至少間隔12周，LA陽性≥2次，最終確認(rèn)為LA陽性標(biāo)本。通過Bethesda方法檢測凝血因子抑制物。排除使用肝素、直接凝血酶抑制劑的標(biāo)本。同時(shí)排除分析前誤差，如肝素污染、標(biāo)本送達(dá)延遲、EDTA污染、標(biāo)本凝固、溶血、標(biāo)本量不足等。

1.1.2 儀器與試劑：應(yīng)用STA-R EVOLUTION凝血分析儀進(jìn)行APTT相關(guān)所有檢測，所用試劑為STA?-PTT A。試劑1含有兔腦磷脂和硅土（激活物）的凍干粉，試劑2為0.025 mol/L CaCl2。應(yīng)用ACL TOP-750 凝血分析儀及配套試劑進(jìn)行LA檢測。

1.1.3 NPP的制備：選取健康體檢者的3.2%枸櫞酸鈉抗凝血20份，男女比例相等，年齡18～55歲，常規(guī)凝血試驗(yàn)結(jié)果正常，避免選擇感染、腫瘤、創(chuàng)傷、妊娠、新生兒等人群標(biāo)本；確保每個(gè)單獨(dú)血漿標(biāo)本血小板計(jì)數(shù)<10×109/L；將收集標(biāo)本混合后，以1 500g離心15 min2次；排除LA陽性。

1.2 方法

1.2.1 即刻APTT糾正試驗(yàn)操作方法：將等量的患者血漿與NPP混合后，將患者血漿、NPP和混合后血漿立即裝載至凝血分析儀進(jìn)行檢測，所得APTT分別為PAPTT、NAPTT、MAPTT。

1.2.2 即刻APTT糾正試驗(yàn)結(jié)果的不同判定方法：（1）目前最常用的方法是循環(huán)抗凝劑指數(shù)［也稱為羅斯納指數(shù)（Rosner index，RI）］，RI（%）=［（MAPTTNAPTT）/PAPTT］×100；（2）百分比糾正法，糾正百分比（%）=［（PAPTT-MAPTT）/（PAPTT-NAPTT）］×100；（3）正常參考范圍法，MAPTT結(jié)果不超過APTT正常參考范圍上限，本實(shí)驗(yàn)室建立本地APTT正常參考范圍上限為43 s；（4）差值法，即MAPTT與NAPTT的差值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，受試者操作特 征（receiver operating characteristic，ROC）曲線評估不同判定方法對APTT糾正試驗(yàn)結(jié)果的診斷效能，即區(qū)分因子缺乏和抑制物陽性的能力，同時(shí)確定最佳臨界值。比較4種方法設(shè)定的最佳臨界值對即刻APTT糾正試驗(yàn)結(jié)果診斷的靈敏度、特異度、陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值。應(yīng)用散點(diǎn)圖分析因子缺乏和抑制物陽性標(biāo)本對不同判定方法所得結(jié)果的分布情況。對單因子缺乏標(biāo)本的因子濃度水平與結(jié)果判定方法進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 4種判定方法對即刻APTT糾正試驗(yàn)結(jié)果的診斷效能

通過ROC曲線評估4種方法區(qū)分凝血因子缺乏和抑制物陽性能力的診斷效能。即刻APTT糾正試驗(yàn)結(jié)果若為糾正，即因子缺乏，反之為不糾正，即抑制物陽性。各判定方法曲線下面積（area under the curve，AUC）見表1。

表1 不同判定方法區(qū)分凝血因子缺乏和抑制物陽性的ROC曲線下面積Tab.1 Area under the ROC curve of coagulation factor deficiency and positive inhibitor were distinguished by different methods

2.2 即刻APTT糾正試驗(yàn)結(jié)果不同判定方法的臨界值及評價(jià)

通過ROC曲線建立RI法、百分比糾正法及差值法的最佳臨界值分別為12.2%、62%、7.4 s，本實(shí)驗(yàn)室APTT正常參考范圍上限值為43 s，各方法臨界值所對應(yīng)的靈敏度、特異度、陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值見表2。

表2 建立不同判定方法的最佳臨界值Tab.2 Establish the optimal cutoff values for different methods

2.3 不同判定方法所得結(jié)果的標(biāo)本分布情況

以不同判定方法的目標(biāo)參數(shù)為縱坐標(biāo)，導(dǎo)致APTT延長的病因?yàn)闄M坐標(biāo)，制作散點(diǎn)圖，分析標(biāo)本在不同結(jié)果判定方法中分布的具體情況。結(jié)果如圖1所示，單獨(dú)任何一種方法都無法完全區(qū)分因子缺乏和抑制物陽性。RI<12.2%基本可識(shí)別出因子缺乏標(biāo)本（圖1A）；糾正百分比>62%可識(shí)別出全部因子缺乏標(biāo)本（圖1B）；差值法設(shè)定7.4 s為臨界值時(shí)對華法林引起的多因子缺乏識(shí)別能力差（圖1C）；所有FⅧ抑制物陽性標(biāo)本MAPTT均大于正常參考范圍上限43 s（圖1D）。

圖1 4種不同判定方法標(biāo)本分布情況Fig.1 Specimen distribution of the four different judgment methods

2.4 凝血因子濃度水平和糾正試驗(yàn)不同結(jié)果判定方法的相關(guān)性分析

為探討凝血因子水平與不同判定方法所得結(jié)果是否有相關(guān)性，將單因子缺乏標(biāo)本（35例）凝血因子水平與RI法、百分比糾正法、差值法、正常參考范圍法結(jié)果進(jìn)行相關(guān)性分析。以上相關(guān)參數(shù)通過Kolmogorov-Smirnov檢驗(yàn)均服從正態(tài)分布，進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析。因子濃度與RI法、百分比糾正法、差值法、正常參考范圍法的相關(guān)系數(shù)r分別為0.536（P<0.01）、-0.710（P<0.01）、0.225（P>0.05）、0.216（P>0.05），因子濃度水平與RI法結(jié)果呈中等正相關(guān)，與百分比糾正法結(jié)果呈顯著負(fù)相關(guān)，與差值法和正常參考范圍法無相關(guān)性。

3 討論

雖然內(nèi)源性凝血因子缺乏和抑制物陽性（主要是LA陽性）都能使APTT延長，但在臨床上表現(xiàn)為完全不同的癥狀，大部分嚴(yán)重的因子缺乏會(huì)導(dǎo)致出血，而LA陽性是高凝狀態(tài)易形成血栓，在治療上也是采取完全不同的手段。因此，明確無明顯癥狀僅表現(xiàn)為APTT延長的患者的診斷對于治療至關(guān)重要，臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)制定的指南強(qiáng)調(diào)對于LA的檢測，篩選、混合和確認(rèn)試驗(yàn)都是必要的［2］，遺漏混合試驗(yàn)會(huì)給最終結(jié)果帶來假陽性或假陰性［3］。但由于各實(shí)驗(yàn)室使用APTT試劑不同，其成分中的激活劑不同，磷脂的來源、性質(zhì)和總濃度不同，APTT試劑對肝素、LA和凝血因子缺乏的靈敏度和特異度也大不相同［4-5］。文獻(xiàn)［6］表明，6種不同APTT試劑RI臨界值介于11.5%～15.6%之間。因此，應(yīng)建立屬于本地實(shí)驗(yàn)室的結(jié)果判定值。

本研究對目前的即刻APTT糾正試驗(yàn)的結(jié)果判定方法中常用的4種進(jìn)行了比較，包括RI法、百分比糾正法、MAPTT與NAPTT差值法和正常參考范圍法，并重新建立了前3種方法的臨界值。但無論哪種方法都無法完全將因子缺乏和抑制物陽性區(qū)分開。本研究中RI的臨界值為12.2%，與文獻(xiàn)［7］報(bào)道的RI臨界值10%～15%相符。本研究中，百分比糾正法臨界值≥62%，所有因子缺乏標(biāo)本均被糾正，因此百分比糾正法最大的意義在于<62%可排除因子缺乏。與以往研究［8］結(jié)果相同，正常參考范圍法中FⅧ抑制物標(biāo)本均為部分糾正。雖然FⅧ抑制物是時(shí)間溫度依賴的抗體，但高滴度的FⅧ抑制物也可起快速抑制作用［9-10］。從正常參考范圍法散點(diǎn)圖中可發(fā)現(xiàn)，無論FⅧ抑制物滴度如何，都不會(huì)被糾正至APTT正常范圍內(nèi)。如血友病等長期因子缺乏患者近期出現(xiàn)出血癥狀或APTT逐漸升高，臨床醫(yī)生無法確定是否產(chǎn)生FⅧ抑制物，可通過此方法進(jìn)行排除。因子抑制物檢測方法昂貴，一般實(shí)驗(yàn)室尚未開展，更無法在資源匱乏的環(huán)境中進(jìn)行基于人群的篩查。本研究結(jié)果顯示，只要混合后APTT結(jié)果不超過正常參考范圍上限，即可排除FⅧ抑制物的存在，無需進(jìn)行因子抑制物檢測。當(dāng)然，這需要擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步驗(yàn)證。但這一方法的不足之處在于試劑批號(hào)更換時(shí)要頻繁驗(yàn)證參考范圍。差值法沒有將患者APTT結(jié)果納入判定結(jié)果計(jì)算，只考慮NPP和混合后APTT結(jié)果，將二者的差值作為判定標(biāo)準(zhǔn)，理論上并不科學(xué)。因患者APTT延長的程度一定程度上會(huì)影響混合后APTT結(jié)果，應(yīng)將患者APTT也考慮到最終結(jié)果計(jì)算中，而不是用絕對值作為判定目標(biāo)值。

本研究發(fā)現(xiàn)，因子缺乏程度與RI法結(jié)果呈正相關(guān)，與百分比糾正法結(jié)果呈負(fù)相關(guān)，即因子缺乏程度越大，結(jié)果被糾正的程度越大，因子輕度缺乏的標(biāo)本被糾正的程度小，甚至不被糾正，與ORELLANA等［11］的研究結(jié)果一致。在無法進(jìn)行因子濃度檢測的實(shí)驗(yàn)室，可根據(jù)RI法和百分比糾正法結(jié)果大致判斷患者的因子缺乏程度。在各種方法的結(jié)果判讀中，總是存在LA陽性標(biāo)本在糾正試驗(yàn)中被糾正，這些標(biāo)本均為LA弱陽性者，在即刻糾正試驗(yàn)中，低滴度的LA抑制物被稀釋，無法發(fā)揮直接抑制作用，而表現(xiàn)出被糾正的假陰性結(jié)果［12］。對于使用華法林所致多因子缺乏標(biāo)本，RI法和百分比糾正法幾乎均可得到標(biāo)本被糾正的結(jié)果，而差值法和正常參考范圍法區(qū)分這類標(biāo)本的能力欠缺。在單因子缺乏引起APTT延長的標(biāo)本中，最常見的是FⅫ缺乏，F(xiàn)Ⅻ在內(nèi)源性途徑的啟動(dòng)中起關(guān)鍵作用，其不足會(huì)導(dǎo)致血栓形成，而不會(huì)出現(xiàn)其他凝血因子缺乏引起的出血［13］。

綜上所述，每種判定方法都有各自的特點(diǎn)和適用人群，可以嘗試對臨床特定需求使用特定判定方法和臨界值。各方法新建立的臨界值可更好地識(shí)別因子缺乏和抑制物陽性的標(biāo)本，且與其他3種方法相比，RI法用到了所有的APTT結(jié)果，使最終判定結(jié)果更準(zhǔn)確客觀，可最大程度排除各種系統(tǒng)誤差對結(jié)果帶來的影響，無論是從判斷因子缺乏還是抑制物陽性都有較好的靈敏性和特異性，且具有最大的AUC，可作為本實(shí)驗(yàn)室APTT糾正試驗(yàn)結(jié)果首要常規(guī)判斷方法。本研究的局限性在于研究方法是回顧性分析，無法保證不同人員操作的差異，最終可能給結(jié)果帶來的影響也無法評估。由于FⅧ抑制物標(biāo)本量少，本研究未對孵育試驗(yàn)的結(jié)果進(jìn)行分析。