管超，李夢(mèng)玲，蔣禮青，李思敏，張宇沖，張博，李智，趙明芳

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué) 1.附屬第一醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，沈陽(yáng) 110001；2.附屬盛京醫(yī)院腫瘤科，沈陽(yáng) 110004；3.附屬第一醫(yī)院臨床流行病學(xué)與循證醫(yī)學(xué)教研室，沈陽(yáng) 110001）

肺癌是全球范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤。作為非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）的主要亞型之一，肺鱗狀細(xì)胞癌（簡(jiǎn)稱(chēng)鱗癌）約占肺癌的25%～30%［1-2］。因肺鱗癌獨(dú)特的臨床病理和生物學(xué)特征，部分患者可獲益于免疫治療。但免疫治療并非對(duì)所有患者有效［3］，因此，迫切需要尋找到免疫治療的生物標(biāo)志物。目前，最常用的2種生物標(biāo)志物為程序性死亡配體1（programmed cell death-ligand 1，PD-L1）和腫瘤突變負(fù)荷（tumor mutational burden，TMB）［4-5］。有研究［6］表明，TMB在預(yù)測(cè)免疫檢查點(diǎn)抑制劑（immune checkpoint inhibitors，ICIs）治療方面優(yōu)于PD-L1。但由于侵入性活檢及全外顯子組測(cè)序（whole exome sequencing，WES）的高成本等因素，阻礙了TMB檢測(cè)的大規(guī)模推廣。

放射組學(xué)作為一個(gè)快速崛起的領(lǐng)域，已在預(yù)測(cè)肺癌的診斷、預(yù)后和最佳治療方面顯示出重要作用［7］。有研究［8-9］顯示，以CT為基礎(chǔ)的影像組學(xué)在體細(xì)胞突變［如NSCLC的表皮生長(zhǎng)因子受體（epithelial growth factor receptor，EGFR）和間變性大細(xì)胞淋巴瘤激酶（anaplastic lymphoma kinase，ALK）突變］中存在潛在的預(yù)測(cè)價(jià)值。此外，有研究［10］顯示影像組學(xué)可以預(yù)測(cè)早期肺腺癌患者的TMB狀態(tài)。

本研究旨在探討從CT圖像中提取的放射組學(xué)特征預(yù)測(cè)肺鱗癌患者TMB狀態(tài)的價(jià)值，并基于放射組學(xué)數(shù)據(jù)開(kāi)發(fā)TMB的預(yù)測(cè)模型。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

共納入35例初治肺鱗癌患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）病理結(jié)果為肺鱗癌；（2）在癌癥影像數(shù)據(jù)庫(kù)（the cancer imaging archive，TCIA）中可下載胸部CT原發(fā)病灶全部影像。從TCIA數(shù)據(jù)庫(kù)下載TCGA-LUSC數(shù)據(jù)集中37例患者的全部CT影像，其中1例因病灶邊緣過(guò)于模糊無(wú)法勾畫(huà)靶病灶，另1例因存在多個(gè)原發(fā)病灶而被排除。

1.2 圖像分割與特征提取

本研究以開(kāi)源醫(yī)學(xué)圖像處理軟件（3D Slicer，版本4.11.0，http：//www.slicer.org）為分析平臺(tái)，從而實(shí)現(xiàn)圖像分割及影像特征提取。將下載的普通CT圖像加載到3D Slicer軟件，調(diào)整肺窗（窗口寬度：1 400，窗位：-500），以實(shí)現(xiàn)圖像統(tǒng)一化處理。由2名具有9年工作經(jīng)驗(yàn)的放射科醫(yī)生沿CT橫軸位病灶最大層面輪廓進(jìn)行三維半自動(dòng)分割，并手動(dòng)逐層修改以勾畫(huà)感興趣區(qū)（region of interest，ROI），盡量避開(kāi)血管、氣管、神經(jīng)等正常組織。再由1名具有15年以上工作經(jīng)驗(yàn)的高級(jí)放射科醫(yī)生核實(shí)并確認(rèn) ROI。

采用 3D-Slicer 軟件中的 Pyradiomics 包提取851個(gè)ROI 的放射組學(xué)特征。所有分割數(shù)據(jù)都用1 mm×1 mm×1 mm的體素重采樣進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，以減少圖像采集異質(zhì)性的影響。

1.3 TMB分組

從TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)下載肺鱗癌SNV數(shù)據(jù)集，用R軟件計(jì)算下載數(shù)據(jù)中每個(gè)樣品的TMB值，以數(shù)據(jù)集的TMB中位數(shù)為界，≤中位數(shù)的樣品為低TMB組，>中位數(shù)的樣品為高TMB組。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 25.0 軟件和R4.0.2軟件對(duì)影像組學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。采用LASSO回歸篩選影像學(xué)特征。采用logistic回歸對(duì)得到的影像學(xué)特征建立模型。所得受試者操作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線和曲線下面積（area under the curve，AUC）用于評(píng)價(jià)所建模型的診斷效能。臨床決策曲線（decision curve analysis，DCA）用于評(píng)估預(yù)測(cè)模型的臨床實(shí)用性。

2 結(jié)果

2.1 圖像分割與特征提取

本研究采用 3D-Slicer 軟件對(duì)35例初治肺鱗癌患者CT影像的原發(fā)病灶進(jìn)行三維圖像立體分割，主要方法為沿CT橫軸位病灶最大層面輪廓邊緣進(jìn)行三維半自動(dòng)分割，并逐層手動(dòng)修改，從而獲得原發(fā)病灶的三維立體圖像即放射組學(xué)的ROI。

采用 3D-Slicer 軟件中的 Pyradiomics 包對(duì)獲得的35個(gè)ROI進(jìn)行影像組學(xué)特征提取，共獲得851個(gè)ROI 的影像組學(xué)特征，其中包括shape、firstorder、glcm、gldm、glrlm、glszm和ngtdm 7種類(lèi)型。

圖1 原發(fā)灶的三維立體圖像Fig.1 Three-dimensional image of the primary foci

2.2 TMB分組

從TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)共下載491例肺鱗癌SNV數(shù)據(jù)集，采用R軟件（maftools包）計(jì)算每個(gè)樣品的TMB值，從而得出TMB的中位數(shù)為3.64/MB（圖2）。然后與從TCIA下載的35例肺鱗癌樣本進(jìn)行匹配，得到35例TCIA肺鱗癌樣本的TMB分組情況。

圖2 TMB分組情況Fig.2 TMB grouping

2.3 篩選與TMB相關(guān)的影像學(xué)特征

采用LASSO回歸對(duì)851個(gè)特征進(jìn)行降維處理，篩選出與TMB相關(guān)的影像學(xué)特征。根據(jù)最優(yōu)λ值（圖3），最終篩選出9個(gè)相關(guān)的影像學(xué)特征，分別為wavelet-HHH_ glcm_Correlation，wavelet-HHL_glcm_Imc1，wavelet-LLH_glcm_MCC，wavelet-HHL_glszm_LowGrayLevelZoneEmphasis，wavelet-HHH_glszm_Zone Variance，wavelet-HHL_gldm_LargeDependenceHigh GrayLevelEmphasis，wavelet-LLH_ngtdm_Busyness，wavelet-HLL_firstorder_MeanAbsoluteDeviation和wavelet-LLL_glcm_MCC。

圖3 三折交叉驗(yàn)證圖Fig.3 Tri-fold cross-validation diagram

2.4 預(yù)測(cè)模型的構(gòu)建及其診斷效能

將篩選的9個(gè)影像學(xué)特征與TMB同時(shí)納入logistic回歸方程，進(jìn)行逐步回歸，最后篩選得到預(yù)測(cè)模型的3個(gè)影像學(xué)特征，分別為wavelet-HHH_glcm_Correlation、wavelet-HHL_gldm_Large Dependence High Gray Level Emphasis和wavelet-LLL_glcm_MCC（表1）。繪制3個(gè)影像學(xué)特征與TMB的nomogram圖（圖4）。繪制3個(gè)影像學(xué)特征預(yù)測(cè)的ROC 曲線（圖5），AUC可達(dá)0.882，說(shuō)明此模型預(yù)測(cè)TMB精度良好。利用logistic回歸模型進(jìn)行建模，繪制DCA對(duì)臨床預(yù)測(cè)模型進(jìn)行評(píng)價(jià)。DCA顯示，當(dāng)閾值取0.10～1.00時(shí)，影像組學(xué)模型預(yù)測(cè)效能良好，見(jiàn)圖6。

表1 篩選預(yù)測(cè)模型的影像學(xué)特征Tab.1 Imaging characteristics of the screening prediction model

圖4 預(yù)測(cè)TMB的影像組學(xué)nomogram圖Fig.4 Imaging nomogram of predicted TMB

圖5 影像學(xué)組學(xué)預(yù)測(cè)模型的ROC曲線Fig.5 ROC curves for the imaging histological features of prediction models

圖6 影像組預(yù)測(cè)模型的DCAFig.6 DCA of the image group prediction model

3 討論

NSCLC患者經(jīng)過(guò)ICIs治療后，僅有一小部分人群臨床獲益。除了PD-L1、MSI等預(yù)測(cè)ICIs療效的生物標(biāo)志物，近年來(lái)，越來(lái)越多的數(shù)據(jù)證實(shí)TMB越高的腫瘤抗原負(fù)荷越高，更有可能從ICIs 治療中獲益，因此，TMB受到的臨床關(guān)注度逐漸升高。

TMB是一種廣泛用于ICIs治療獨(dú)立的療效預(yù)測(cè)生物標(biāo)志物。TMB首次在2014年黑色素瘤的研究［11］中被證實(shí)與CTLA-4抗體的療效存在相關(guān)性。2017年發(fā)現(xiàn)TMB對(duì)27種腫瘤的免疫治療研究［12-13］有顯著的療效預(yù)測(cè)作用，奠定了其作為預(yù)測(cè)泛癌種治療探索的基礎(chǔ)。

盡管TMB具有前景的預(yù)測(cè)價(jià)值，但TMB檢測(cè)仍面臨著一些挑戰(zhàn)，包括肺癌患者動(dòng)態(tài)獲取活檢組織的可行性差，重癥患者無(wú)法獲取活檢組織，以及WES檢查的高成本等。本研究基于CT影像組學(xué)預(yù)測(cè)TMB，可以彌補(bǔ)傳統(tǒng)TMB檢測(cè)方法的不足。

放射組學(xué)研究因其獲取全面圖像信息方面的優(yōu)勢(shì)而在廣泛腫瘤研究領(lǐng)域迅速發(fā)展［14］。在NSCLC中，影像學(xué)組在預(yù)測(cè)病理和分子分型［15-16］、器官特異性轉(zhuǎn)移［17-18］、復(fù)發(fā)和總生存［19-20］等方面表現(xiàn)出潛力。因此，假設(shè)放射組學(xué)特征可用于通過(guò)預(yù)測(cè)高TMB的概率來(lái)選擇臨床上最需要的患者群體進(jìn)行TMB檢測(cè)。此外，對(duì)于那些無(wú)法接受昂貴WES測(cè)試的人群來(lái)說(shuō)，放射組學(xué)可以作為 TMB 檢測(cè)的替代或輔助診斷。

本研究中，TMB預(yù)測(cè)模型通過(guò)列線圖可視化，可以方便地計(jì)算肺鱗癌患者高TMB的可能性。該研究有可能幫助臨床醫(yī)生篩選出TMB檢測(cè)的最佳候選人，即最有可能具有高TMB的患者。另一方面，本研究的模型也可以作為T(mén)MB的替代品，用于無(wú)法負(fù)擔(dān)昂貴的TMB檢測(cè)或沒(méi)有可獲取的組織樣本進(jìn)行檢測(cè)的患者。與傳統(tǒng)的TMB檢測(cè)方法相比，本研究放射組學(xué)TMB預(yù)測(cè)模型為完全非侵入性。此外，由于大多數(shù)肺鱗癌患者在初始診斷之前或初始診斷時(shí)已經(jīng)接受了胸部CT掃描，因此，基于影像組學(xué)的TMB預(yù)測(cè)模型幾乎不需要額外的檢查。

本研究存在一定的局限性。首先，本研究數(shù)據(jù)來(lái)自TCIA數(shù)據(jù)庫(kù)，樣本量相對(duì)較小，因此不可避免的會(huì)存在與回顧性研究相關(guān)的缺點(diǎn)；其次，由于目前對(duì)肺鱗癌中TMB的最佳臨界值沒(méi)有達(dá)成共識(shí)，選擇了通過(guò)R包（maftools包）計(jì)算得出的中位TMB來(lái)定義TMB的高、低組；第三，影像組學(xué)預(yù)測(cè)肺鱗癌患者TMB能力背后的生物學(xué)解釋尚不清楚，還需要進(jìn)一步深入研究。最后，本研究缺乏外部數(shù)據(jù)對(duì)預(yù)測(cè)模型進(jìn)行驗(yàn)證。

本研究結(jié)果顯示，從胸部CT中提取的影像組學(xué)特征與TMB之間存在內(nèi)在聯(lián)系。因此建立了一個(gè)基于放射組學(xué)特征的TMB預(yù)測(cè)模型，通過(guò)本研究證明了采用放射組學(xué)預(yù)測(cè)TMB的可行性。并且，基于影像組學(xué)特征建立的預(yù)測(cè)模型對(duì)TMB狀態(tài)有較高的預(yù)測(cè)價(jià)值，有待進(jìn)一步研究探索。