張鈺坤 原陽 盧琦 鄒林峰 高遠真 邢東明,3

(1 青島大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，山東 青島 266071；2 青島大學(xué)附屬醫(yī)院腫瘤研究所，青島腫瘤研究院； 3 清華大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院)

目前包括阿霉素(Dox)在內(nèi)的蒽環(huán)類藥物是乳腺癌等多種腫瘤的常用化療藥物[1-2]，但其導(dǎo)致的心臟毒性發(fā)生率高達30%[3]，是腫瘤患者死亡的重要因素之一[4]。迄今為止，右雷佐生(Dexra)是唯一被FDA批準的蒽環(huán)類藥物中用于化療的心臟保護藥物，但仍有嚴重的骨髓抑制等副作用[5-6]。因此，研發(fā)更加有效且副作用小的新型心臟保護藥物有重要臨床意義。線粒體功能障礙和活性氧(ROS)大量釋放是Dox誘導(dǎo)心臟毒性發(fā)生的主要機制[7-8]，恢復(fù)心肌細胞內(nèi)線粒體功能和降低氧化損傷可緩解Dox引起的心肌毒性。5-羥基色氨酸(5-HTP)是自非洲加納谷物Griffoniasimplicifolia種子中提取的天然氨基酸類物質(zhì)[9]，臨床上用作抗抑郁藥物。目前研究表明，5-HTP能夠增強心肌收縮力，同時5-HTP是比維生素C更為有效的抗氧化劑[10-11]。而目前5-HTP對Dox引發(fā)的心臟損傷是否有保護作用尚不清楚。本研究以Dexra作為陽性藥物，以Dox誘發(fā)的小鼠急性心肌損傷和H9c2心肌細胞損傷為模型，研究5-HTP對Dox誘導(dǎo)心肌損傷的保護作用及可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

SPF級雌性C57BL/6J小鼠共計32只(8周齡，18～22 g)，購自北京斯貝福生物技術(shù)有限公司。H9c2大鼠心肌細胞株購自武漢普諾賽生命科技有限公司。Dox與Dexra購自湖北威德利化學(xué)科技有限公司，5-HTP購自西安恩肽元生物科技有限公司。CCK-8試劑，線粒體膜電位試劑盒、HE染色試劑盒及Annexin V-FITC/PI細胞凋亡試劑盒均購自大連美侖生物技術(shù)有限公司，三磷酸腺苷(ATP)檢測試劑盒、乳酸脫氫酶(LDH)檢測試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)檢測試劑盒及DCFH-DA探針購買于北京索萊寶科技有限公司，心肌肌鈣蛋白I(cTnI)檢測試劑盒購自武漢云克隆科技股份有限公司，實時熒光定量PCR(RT-qPCR)試劑盒、小G蛋白Rho相關(guān)激酶1(Rock-1)、核因子E2相關(guān)因子2(Nrf-2)、沉默調(diào)節(jié)蛋白1(Sirt-1)及B淋巴細胞瘤-2(Bcl-2)兔源抗體購自武漢愛博泰克生物技術(shù)有限公司。

1.2 H9c2細胞培養(yǎng)及5-HTP濃度的確定

H9c2細胞培養(yǎng)于含體積分數(shù)0.10的胎牛血清以及10 g/L的青霉素鏈霉素雙抗的DMEM完全培養(yǎng)基中，置于37 ℃恒溫恒濕且含體積分數(shù)0.05 CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞生長密度達到70%～80%時進行后續(xù)實驗。

將H9c2細胞以每孔10 000個細胞的密度接種于96孔板中，待細胞融合度達到80%后，分別加入10、20、50、100 μmol/L 5-HTP與5 μmol/L Dox的混合液，處理24 h后，每孔加入10 μL CCK-8試劑于37 ℃孵育2 h，使用酶標儀測定波長450 nm處吸光度值。計算不同濃度藥物處理后的細胞存活率，選取細胞存活率最高時的5-HTP濃度用于后續(xù)實驗。每組設(shè)置5個復(fù)孔，結(jié)果取均值。

1.3 H9c2細胞分組及各項指標檢測

當H9c2細胞融合度約達80%時，使用胰酶消化細胞，接種于6孔板中，待細胞生長密度再次達到80%后，將細胞分為4組：對照組(不處理)、模型組(培養(yǎng)液中加入Dox 5 μmol/L)、陽性藥物保護組(培養(yǎng)液中加Dox 5 μmol/L+Dexra 20 μmol/L)以及5-HTP保護組(培養(yǎng)液中加入Dox 5 μmol/L+5-HTP 20 μmol/L)，處理24 h后，取各組細胞用于后續(xù)檢測。

嚴格按照各試劑盒說明書操作要求，使用LDH檢測試劑盒測定各組細胞培養(yǎng)基中LDH的漏出量，分別使用ATP檢測試劑盒和SOD檢測試劑盒檢測細胞內(nèi)ATP的水平及SOD活性，使用酶標儀分別測定波長340 nm與560 nm處的吸光度值。按照Annexin V-FITC/PI細胞凋亡試劑盒說明書的要求，用不含EDTA的胰蛋白酶消化細胞，探針孵育15 min后，使用流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率，細胞凋亡率為Annexin V-FITC陽性的細胞占比。用20 μmol/L DCFH-DA探針孵育細胞20 min，在熒光顯微鏡下隨機選取5個視野拍照，采用Image J 軟件分析平均熒光強度。同時按照說明書要求使用JC-1熒光探針檢測線粒體膜電位，熒光顯微鏡下觀察紅色熒光和綠色熒光，采用Image J 軟件分析紅綠熒光強度，以紅綠熒光比值表示線粒體膜電位。上述實驗均重復(fù)3次，結(jié)果取均值。

1.4 以Western Blot方法檢測H9c2心肌細胞中Rock-1、Nrf-2、Sirt-1及Bcl-2蛋白表達水平

各組細胞于10 cm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)至生長密度達70%～80%時，藥物處理24 h后，以預(yù)冷PBS清洗，使用加入蛋白酶抑制劑裂解液裂解細胞，提取細胞內(nèi)總蛋白。取等量蛋白上樣，經(jīng)SDS-PAGE電泳后，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，以50 g/L脫脂牛奶室溫封閉1 h，分別加入兔源Rock-1、Nrf-2、Sirt-1、Bcl-2一抗(1∶1 000)和內(nèi)參GAPDH(1∶5 000)，4 ℃孵育過夜；TBST洗去殘留的一抗，二抗(1∶10 000)室溫孵育1 h，滴加超敏型化學(xué)發(fā)光檢測試劑顯色，凝膠成像儀顯影，采用Image J 軟件分析蛋白條帶灰度值，以Rock-1、Nrf-2、Sirt-1及Bcl-2蛋白灰度值/GAPDH蛋白灰度值表示各蛋白的相對表達水平。實驗重復(fù)3次，結(jié)果取均值。

1.5 動物實驗及相關(guān)指標檢測

32只C57BL/6J小鼠隨機分為4組，每組8只，對照組小鼠每天灌胃200 μL生理鹽水，模型組、陽性藥物保護組和5-HTP保護組小鼠均于實驗第1天腹腔注射10 mg/kg Dox，僅注射1次，同時陽性藥物保護組小鼠再每天經(jīng)腹腔注射14.3 mg/kg Dexra，5-HTP保護組小鼠再每天灌服30 mg/kg的5-HTP，連續(xù)1周。處理1周后，所有小鼠用含體積分數(shù)0.015的異氟烷進行氣體麻醉，采用飛依諾多普勒超聲診斷儀V6檢測小鼠心功能(探頭頻率為23 MHz)，測定左心室射血分數(shù)(EF%)和短軸縮短率(FS%)。參照試劑盒說明書使用ELISA法測定小鼠血清中心肌肌鈣蛋白I(cTnI)的水平。心臟超聲檢查完成后，每只小鼠腹腔注射10 g/L戊巴比妥鈉10 μL/g麻醉，后脫臼處死，取心臟組織石蠟包埋，組織切片進行HE染色，于顯微鏡下觀察心臟組織病理學(xué)變化。使用Trizol試劑提取對照組、模型組以及5-HTP保護組3組小鼠心臟組織總RNA，通過RT-qPCR法檢測心肌組織中含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶1(Casp1)、Casp2、B淋巴細胞瘤-2關(guān)聯(lián)X(Bax)及B淋巴細胞瘤-2基因相關(guān)啟動子(Bad)的mRNA表達水平。引物名稱及其序列見表1。

表1 引物名稱及其序列Tab.1 Primer names and sequences

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 5-HTP實驗濃度的確定

CCK-8實驗結(jié)果顯示，H9c2細胞經(jīng)10、20、50、100 μmol/L 5-HTP與5 μmol/L Dox的混合液處理24 h以后，細胞存活率分別為(52.78±2.55)%、(72.84±1.88)%、(72.52±3.21)%、(68.77±3.84)%，各組間比較差異有顯著性(F=96.88，P<0.05),其中20 μmol/L 5-HTP與5 μmol/L Dox混合液處理后的細胞存活率最高，故確定20 μmol/L為后續(xù)5-HTP的實驗濃度。

2.2 5-HTP對Dox誘導(dǎo)的H9c2心肌細胞各項指標的影響

單因素方差分析顯示，各組H9c2細胞培養(yǎng)基中LDH漏出量、各組細胞的細胞凋亡率以及細胞內(nèi)ROS水平、SOD活性、線粒體膜電位、ATP水平及Bcl-2、Sirt-1、Nrf-2、Rock-1蛋白表達水平比較，差異均有顯著性(F=17.15～238.27，P<0.05)。其中，對照組、5-HTP保護組的上述各項指標與模型組相比，差異均有顯著性(P<0.05)；陽性藥物保護組細胞內(nèi)的ROS水平、細胞凋亡率、ATP水平、Sirt-1蛋白表達水平及培養(yǎng)基內(nèi)LDH漏出量與模型組相比，差異有顯著性(P<0.05)；陽性藥物保護組細胞內(nèi)的ROS水平、SOD活性、線粒體膜電位及Bcl-2、Nrf-2、Rock-1蛋白表達水平與5-HTP保護組相比，差異有顯著性(P<0.05)，陽性藥物保護組和5-HTP保護組的其余指標比較差異均無顯著性(P>0.05)。見表2。

表2 5-HTP對Dox誘導(dǎo)的H9c2心肌細胞各項指標的影響Tab.2 Effect of 5-HTP on various indices of Dox-induced H9c2 cardiomyocytes

2.3 5-HTP對小鼠心功能以及心臟組織形態(tài)學(xué)的影響

小鼠心臟超聲檢測結(jié)果顯示，對照組、模型組、陽性藥物保護組、5-HTP保護組小鼠的EF%分別為(84.22±2.94)%、(59.72±8.67)%、(75.26±2.52)%、(86.90±1.03)%，F(xiàn)S%分別為(48.68±4.71)%、(27.40±7.84)%、(41.66±7.50)%、(51.58±7.89)%，血清中cTnI水平分別為(152.20±12.30)、(505.60±18.31)、(365.00±21.14)、(372.00±18.91)ng/L，各組小鼠EF%、FS%以及血清cTnI水平比較，差異均具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(F=6.91～59.69，P<0.05)，其中，對照組、陽性藥物保護組以及5-HTP保護組與模型組小鼠的上述指標比較，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，陽性藥物保護組與5-HTP保護組上述指標比較，差異無顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

HE染色結(jié)果顯示，模型組與對照組比較，心肌細胞排列間隙變大，心肌細胞周圍可見炎性細胞浸潤，而陽性藥物保護組、5-HTP保護組與模型組相比，心肌細胞排列間隙減小，炎性浸潤情況減輕。陽性藥物保護組與5-HTP保護組間心肌組織形態(tài)學(xué)無明顯差異。見圖1。

A:對照組，B:模型組，C:陽性藥物保護組，D:5-HTP保護組，400倍

2.4 5-HTP對小鼠心臟組織中凋亡相關(guān)基因表達的影響

RT-qPCR結(jié)果顯示，對照組、模型組、5-HTP保護組小鼠心臟組中Casp1 mRNA相對表達水平分別為1.00±0.16、1.3±0.05、0.98±0.11，Casp2 mRNA的相對表達水平分別為1.00±0.04、1.27±0.07、0.95±0.04，Bax相對表達水平分別為1.00±0.07、1.19±0.10、0.86±0.06，BadmRNA的相對表達水平分別為1.00±0.05、1.23±0.10、1.13±0.06，各組間上述凋亡相關(guān)基因相對表達水平比較差異有顯著意義(F=7.30～29.67，P<0.05)，其中，對照組、5-HTP保護組Casp1、Casp2、Bax及BadmRNA的相對表達水平與模型組相比，差異均有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

3 討 論

蒽環(huán)類藥物是乳腺癌輔助治療中常用的化療藥物[2,6]，然而包括Dox在內(nèi)的蒽環(huán)類藥物對心臟有嚴重的副作用，而且還有劑量依賴性[4]，Dexra作為唯一被FDA認可的對蒽環(huán)類藥物心臟毒性有保護作用的藥物，也有著嚴重的骨髓抑制副作用[5-6]，因此探索與開發(fā)安全有效的心臟保護藥物對提高癌癥患者的生存質(zhì)量很有必要。

研究表明氧化應(yīng)激是Dox引起心臟毒性和心肌細胞死亡的主要因素[12-13]，ROS的大量積累會導(dǎo)致細胞線粒體中ATP合成中斷[12]，反之，線粒體功能受損，心肌細胞能量代謝異常，也會促使線粒體釋放過多ROS，細胞內(nèi)氧自由基生成增多，氧化應(yīng)激水平失衡，誘發(fā)細胞凋亡[14]。

本研究首先采用10、20、50、100 μmol/L濃度的5-HTP與5 μmol/L Dox共同處理H9c2細胞，使用CCK-8法檢測細胞存活率，確定20 μmol/L的5-HTP是保護作用最強的濃度，作為后續(xù)實驗的使用濃度。進一步針對氧化應(yīng)激和線粒體功能相關(guān)指標進行檢測，結(jié)果顯示，5-HTP能降低H9c2細胞LDH的過度釋放，緩解細胞凋亡，表明5-HTP對Dox引起的心肌細胞損傷與凋亡表現(xiàn)出良好的抑制作用，可減少細胞膜破損。進一步研究顯示，5-HTP能夠恢復(fù)H9c2細胞的線粒體膜電位并提升細胞內(nèi)ATP水平與SOD的活性、降低ROS水平，這提示5-HTP可通過調(diào)控線粒體功能恢復(fù)細胞內(nèi)能量代謝，進而緩解由線粒體損傷引發(fā)的細胞過度氧化應(yīng)激與凋亡，且5-HTP保護組的ROS水平、SOD活性、線粒體膜電位及Nrf-2、Rock-1蛋白表達水平與陽性藥物保護組相比差異有顯著性，推測5-HTP在緩解心肌細胞線粒體損傷和氧化應(yīng)激方面的效果略優(yōu)于陽性藥物Dexra。多項研究表明褪黑素可通過降低心肌細胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平而緩解Dox誘發(fā)的心肌損傷[15-16]，而5-HTP代謝的下游產(chǎn)物即為褪黑素[10,17]。有研究表明，5-HTP是比褪黑素和維生素C更有效的自由基清除劑[10-11]。從分子結(jié)構(gòu)上來講，5-HTP有理想的氧化還原特性，其雜原子環(huán)結(jié)構(gòu)使吲哚胺能夠作為電子供體發(fā)揮抗氧化作用[11]。本研究中5-HTP能夠降低Dox誘發(fā)的較高的心肌細胞氧化應(yīng)激的水平，可能與其所具有的強大的自由基清除活性有關(guān)。

本研究中通過Western Blot實驗的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，5-HTP保護組與模型組相比，細胞內(nèi)Sirt-1、Nrf-2和Rock-1蛋白的表達水平顯著上升，提示5-HTP通過上調(diào)這3種蛋白的表達發(fā)揮保護作用。Sirt-1蛋白可參與調(diào)節(jié)細胞能量代謝、線粒體功能、氧化應(yīng)激和細胞凋亡等，通過激活Nrf-2蛋白來預(yù)防Dox所致的氧化應(yīng)激和細胞凋亡[18-19]。另有研究表明，Nrf-2蛋白的下調(diào)會使RhoA/Rock信號通路受到抑制，Rock-1蛋白表達下降，導(dǎo)致細胞增殖受到抑制[20-21]。5-HTP能夠顯著改善Dox引起的Sirt-1蛋白表達降低，進而改善線粒體功能及抑制細胞凋亡。Dox誘導(dǎo)的心肌病中主要表現(xiàn)為心肌細胞內(nèi)Nrf-2缺乏，Nrf-2可控制細胞中氧化應(yīng)激的內(nèi)源性抑制因子[22-23]。本研究結(jié)果顯示，5-HTP能顯著提高Nrf-2蛋白的表達水平，并激活Rock-1蛋白，提示5-HTP可通過上調(diào)細胞內(nèi)Sirt-1和Nrf-2的水平，減輕氧化應(yīng)激水平，以利于線粒體功能恢復(fù)。此外，通過增強Rock-1蛋白表達促進細胞增殖，減少細胞凋亡，緩解心臟毒性。

5-HTP是5-HT的前體化合物，是心臟中合成5-HT的關(guān)鍵因子。有研究表明，5-HTP在心肌細胞中發(fā)揮正性肌力及變時性作用的原因是5-HTP在心肌細胞內(nèi)轉(zhuǎn)化為了5-HT[17]，所以在本研究中5-HTP保護組能緩解Dox引發(fā)的小鼠心功能障礙以及降低心肌損傷標記物cTnI水平，可能是由于5-HTP在心臟中被轉(zhuǎn)化為5-HT而發(fā)揮作用。此外，注射Dox引起的過度氧化應(yīng)激及線粒體損傷會引發(fā)細胞凋亡[24-25]。本研究中，細胞凋亡相關(guān)基因Casp1、Casp2、Bax與Bad的表達水平在模型組小鼠心臟組織中均顯著上調(diào)，而5-HTP保護組中上述基因的表達下降，提示5-HTP可緩解Dox誘導(dǎo)的細胞凋亡進而緩解心臟毒性。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)5-HTP在H9c2心肌細胞及C57BL/6J小鼠中對Dox誘導(dǎo)的心肌毒性均有保護作用。該保護作用可能與通過調(diào)控H9c2心肌細胞內(nèi)Sirt-1/Nrf-2/Rock-1信號通路進而恢復(fù)線粒體功能，抑制細胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平及細胞凋亡有關(guān)。因此，5-HTP有潛力作為一種新的候選藥物治療Dox誘發(fā)的心臟毒性。

利益沖突聲明：所有作者聲明不存在利益沖突。

ConflictsofInterest： All authors disclose no relevant conflicts of interest.

倫理批準和動物權(quán)利聲明：本研究涉及的所有動物實驗均已通過青島大學(xué)實驗動物福利倫理委員會的審核批準(文件號20211202C57-7620211217068)。所有實驗過程均遵照美國國立衛(wèi)生院出版的《實驗動物合理和使用指南》的條例進行。

EthicsApprovalandAnimalRight： All experimental animal protocols in this study were reviewed and approved by Experimental Animal Welfare Ethics Committee of Qingdao University (Approval Letter No. 20211202C577620211217068), and all experimental animal protocols were carried out by following the guidelines of the Care and Use of Laboratory Animals published by the National Institutes of Health.

作者貢獻：張鈺坤、原陽、盧琦及高遠真參與了研究設(shè)計；張鈺坤、原陽、鄒林峰及邢東明參與了論文的寫作和修改。所有作者均閱讀并同意發(fā)表該論文。

Contributions： The study was designed byZHANGYukun,YUANYang,LUQi, andGAOYuanzhen. The manuscript was drafted and revised byZHANGYukun,YUANYang,ZOULinfeng, andXINGDongming.All the authors have read the last version of the paper and consented submission.