李佳霖 楊萍 秦瑩瑩 趙涵

(山東大學(xué)附屬生殖醫(yī)院，山東 濟(jì)南 250000)

TATA盒結(jié)合蛋白樣2(TBPL2)，在脊椎動物的卵母細(xì)胞中高表達(dá)[1]，作為卵母細(xì)胞中特異的通用轉(zhuǎn)錄因子，參與卵母細(xì)胞中特異性基因的表達(dá)，在雌性脊椎動物卵母細(xì)胞發(fā)育中發(fā)揮重要作用[2-3]。TBPL2基因突變可引起卵泡發(fā)育缺陷、卵母細(xì)胞成熟障礙和卵巢功能低下等，均能導(dǎo)致女性不孕[1]。本文著重介紹了TBPL2基因及其蛋白產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)和功能，總結(jié)了該基因在雌性脊椎動物生殖發(fā)育中的重要作用及其突變導(dǎo)致的生殖障礙疾病的主要研究進(jìn)展。

1 TBPL2的概述

1.1 TBPL2蛋白的結(jié)構(gòu)

TBPL2基因位于人類第14號染色體，包含7個外顯子和6個內(nèi)含子[4]，其編碼的蛋白質(zhì)包含一個C端結(jié)構(gòu)域和一個N端結(jié)構(gòu)域，是TBP家族中的第3位成員，在雌性脊椎動物的卵巢尤其是卵母細(xì)胞中特異性高表達(dá)[3,5]。在對TBP和TBPL2的結(jié)構(gòu)進(jìn)行對比時發(fā)現(xiàn)，它們的C端核心結(jié)構(gòu)域相似性高達(dá)93%，都可折疊成馬鞍形結(jié)構(gòu)，其凹陷處可與DNA雙螺旋的小溝結(jié)合[6-7]。而TBPL2的N端結(jié)構(gòu)域與TBP僅有15%的相似性。在對不同物種之間TBPL2結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較后發(fā)現(xiàn)，TBPL2的C端結(jié)構(gòu)域高度保守，而N端結(jié)構(gòu)域的長度和序列差別很大，具有物種特異性，但也有部分序列存在一定的相似性，比如第93～104位氨基酸間的區(qū)域高度保守，提示該區(qū)域可能具有重要的功能[3,8]。

1.2 TBPL2調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄的作用機(jī)制

鑒于TBP中構(gòu)成DNA結(jié)合域的氨基酸殘基和TBPL2核心區(qū)域的氨基酸殘基相似度很高，有研究者推測TBPL2可能也參與了RNA聚合酶Ⅱ(PolⅡ)的轉(zhuǎn)錄。PolⅡ的通用轉(zhuǎn)錄因子包括TFⅡA、TFⅡB、TFⅡD、TFⅡE和TFⅡF，它們與PolⅡ一起形成起始前復(fù)合物(PIC)[9]。PIC的形成通常始于TFⅡD對于啟動子的識別。TFⅡD是由多個蛋白質(zhì)組成的復(fù)合物，包含TBP和14個TBP結(jié)合因子(TAF)，其中TBP可以識別并結(jié)合啟動子中的TATA盒[5]。TBPL2作為TBP的同源蛋白也可以與TATA盒結(jié)合，但凝膠過濾分析的結(jié)果表明TBPL2與TFⅡD的相對分子質(zhì)量差別比較大，提示TBPL2與TBP有著不完全相同的啟動子識別途徑[3]。比如TBP可以識別不含有TATA盒的啟動子，因此具有更廣泛的轉(zhuǎn)錄起始位點，而TBPL2更傾向于驅(qū)動啟動子中的TATA樣基序[10-11]。此外，與TBP和TFⅡD相互作用不同，在體外實驗中，TBPL2已經(jīng)被證實可以與TATA盒以及TFⅡA和TFⅡB相互作用形成轉(zhuǎn)錄復(fù)合物共同調(diào)控PolⅡ的轉(zhuǎn)錄[11-12]。因此，TBPL2作為轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)脊椎動物卵母細(xì)胞和早期胚胎中特異性基因的轉(zhuǎn)錄，在卵母細(xì)胞成熟以及早期胚胎發(fā)育過程中均發(fā)揮重要作用。

2 TBPL2基因在卵母細(xì)胞發(fā)育中的作用

TBPL2作為轉(zhuǎn)錄因子在小鼠卵母細(xì)胞中可以取代TBP參與PolⅡ的轉(zhuǎn)錄。在小鼠卵泡發(fā)育過程中，卵母細(xì)胞的體積不斷增大，此時卵母細(xì)胞內(nèi)累積了大量的母源RNA和蛋白質(zhì)，以確保卵母細(xì)胞成熟、受精和早期胚胎發(fā)育。成熟的卵母細(xì)胞均處于轉(zhuǎn)錄沉默狀態(tài)。受精后，基因組仍保持一段時間的沉默狀態(tài)，直到受精卵中合子型基因被激活。有研究發(fā)現(xiàn)TBP在原始卵泡的卵母細(xì)胞中表達(dá)，在卵母細(xì)胞發(fā)育的后續(xù)階段則檢測不到，受精后含量再次增加并在合子型基因激活后達(dá)到頂峰[12]。與TBP相比，TBPL2在發(fā)育的卵母細(xì)胞中高表達(dá)，在卵母細(xì)胞恢復(fù)減數(shù)分裂并發(fā)育成熟過程中，TBPL2蛋白逐漸被降解，受精后在胚胎中幾乎檢測不到[13-14]。鑒于發(fā)育階段的卵母細(xì)胞中TBPL2蛋白含量豐富而TBP表達(dá)缺失，推測TBPL2可能是取代TBP調(diào)控PolⅡ的轉(zhuǎn)錄[14]。此外，TBPL2在卵泡發(fā)育過程中主要位于卵母細(xì)胞的細(xì)胞核中，由此可以推測出TBPL2在卵母細(xì)胞發(fā)育階段的轉(zhuǎn)錄啟動和調(diào)控中起著特殊的作用[13]。

2.1 TBPL2基因缺失對卵母細(xì)胞發(fā)育的影響

為了解TBPL2在生殖細(xì)胞發(fā)育過程中的作用，有研究通過基因編輯小鼠模型發(fā)現(xiàn)，TBPL2基因純合缺失的小鼠能夠存活，其外觀、大小和體質(zhì)量與正常小鼠無異，雄性小鼠的生育能力并未受到影響，但雌性小鼠由于卵泡發(fā)育缺陷表現(xiàn)為不孕[1]。為找到導(dǎo)致此類雌鼠不孕的原因，對TBPL2基因缺失小鼠的卵巢進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，其皮質(zhì)內(nèi)存在大量發(fā)育遲緩的小卵泡，大部分處于次級卵泡階段，這些次級卵泡中的卵母細(xì)胞大多透明帶缺失，細(xì)胞核失去正常形態(tài)[1]。這些結(jié)果表明TBPL2對卵泡發(fā)育和卵母細(xì)胞的成熟至關(guān)重要。

2.2 TBPL2基因缺失對卵母細(xì)胞中染色質(zhì)凝縮和基因表達(dá)的影響

TBPL2基因缺失的卵母細(xì)胞核中染色質(zhì)結(jié)構(gòu)異常，未達(dá)到完全濃縮狀態(tài)。這類卵母細(xì)胞中與染色體構(gòu)象密切相關(guān)的基因表達(dá)也下調(diào)，如H1foo、Dnmt1等[1]。此外，卵母細(xì)胞中PolⅡ的活性下降，H3K4me3表達(dá)水平也顯著降低[1]。上述結(jié)論提示TBPL2基因缺失破壞了卵母細(xì)胞中與轉(zhuǎn)錄相關(guān)的染色質(zhì)的正常結(jié)構(gòu)，使染色質(zhì)重塑和凝聚異常。

TBPL2基因缺失可導(dǎo)致卵母細(xì)胞中特異性基因表達(dá)產(chǎn)物的水平上調(diào)或下調(diào)。比如生長分化因子9(GDF9)和骨形態(tài)發(fā)生蛋白15(BMP15)是卵母細(xì)胞特異性生長因子，在大多數(shù)哺乳動物卵母細(xì)胞的發(fā)育中起關(guān)鍵作用。GDF9缺失的小鼠由于初級卵泡發(fā)育受阻而不孕，BMP15缺失的小鼠生育能力下降，表現(xiàn)為排卵障礙和受精率降低[15]。BMP15和GDF9基因突變可導(dǎo)致卵母細(xì)胞和卵丘細(xì)胞功能受損，影響卵母細(xì)胞成熟、受精和卵丘擴(kuò)展[16]。因此，TBPL2基因缺失后卵巢中GDF9和BMP15的表達(dá)水平下降，破壞了卵母細(xì)胞和顆粒細(xì)胞之間的雙向交流，影響顆粒細(xì)胞增殖與分化，阻礙卵母細(xì)胞生長與成熟[15-16]。

3 TBPL2基因在早期胚胎發(fā)育中的作用

由于低水平的TBPL2持續(xù)存在于胚胎發(fā)育過程中，因此TBPL2可能在胚胎發(fā)育過程中發(fā)揮特殊的作用。早期研究通過檢測TBPL2-/-胚胎中基因的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)部分基因的表達(dá)水平下降。然而在注射外源性TBPL2 mRNA后大部分表達(dá)下調(diào)的基因恢復(fù)正常，該結(jié)果提示TBPL2參與胚胎中部分基因的轉(zhuǎn)錄[2,17]。

斑馬魚mespa基因編碼的蛋白質(zhì)作為轉(zhuǎn)錄因子參與胚胎造血系統(tǒng)發(fā)育相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，該基因表達(dá)缺失會導(dǎo)致胚胎造血系統(tǒng)發(fā)育過程的異常[18]。有文獻(xiàn)報道TBPL2基因缺失時，斑馬魚胚胎也表現(xiàn)出造血系統(tǒng)發(fā)育過程異常，如果在此類斑馬魚胚胎中注入外源mespa蛋白則能使胚胎造血系統(tǒng)發(fā)育恢復(fù)正常[18]。研究者在對該現(xiàn)象的發(fā)生機(jī)制進(jìn)行進(jìn)一步探索時發(fā)現(xiàn)，TBPL2作為轉(zhuǎn)錄因子可識別mespa基因的啟動子，并與TBP結(jié)合因子3(TAF3)相互作用共同調(diào)控該基因的轉(zhuǎn)錄[19-20]。因此TBPL2基因缺失時，mespa基因表達(dá)下降，繼而導(dǎo)致胚胎造血發(fā)育和胚胎干細(xì)胞造血分化過程異常。TBPL2還參與非洲爪蟾原腸胚的形成，TBPL2的存在可以部分彌補(bǔ)TBP缺乏帶來的負(fù)面影響，而在TBP表達(dá)水平正常的情況下，TBPL2的表達(dá)又不會干擾胚胎的正常發(fā)育[21-22]。

4 TBPL2基因突變對女性生殖功能的影響

4.1 TBPL2基因突變與卵母細(xì)胞成熟障礙和卵巢功能下降的關(guān)系

目前已報道的TBPL2基因突變有兩種，一種是TBPL2基因純合錯義突變c.895T>C，另一種是TBPL2基因純合剪接突變c.788+3A>G。這兩種突變均為隱性遺傳模式，均導(dǎo)致卵母細(xì)胞發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)下降，繼而導(dǎo)致卵母細(xì)胞成熟障礙和卵巢功能下降。

本課題組在兩個卵母細(xì)胞成熟障礙的不孕家系當(dāng)中，發(fā)現(xiàn)了TBPL2基因純合剪接突變c.788+3A>G，該純合突變導(dǎo)致了以卵母細(xì)胞成熟障礙和早期胚胎發(fā)育缺陷為特征的女性不孕。進(jìn)一步探索TBPL2基因突變的致病機(jī)制時發(fā)現(xiàn)，該突變使TBPL2基因第4個外顯子跳躍缺失，從而導(dǎo)致翻譯提前終止，產(chǎn)生一個由233個氨基酸組成的截短蛋白[23]。該蛋白由于缺少C端核心結(jié)構(gòu)域，導(dǎo)致卵母細(xì)胞中特異性基因的表達(dá)異常，其中包括使卵子發(fā)生(SEBOX、MARF1)[24-25]、卵母細(xì)胞與顆粒細(xì)胞間信息交流(OOSP1、ZP)[26-27]和顆粒細(xì)胞增殖(BMP15)[28]等相關(guān)基因的表達(dá)顯著下調(diào)。但HE等[29]報道的該突變所致的臨床表現(xiàn)與本課題組研究對象的臨床表現(xiàn)略有不同，其在3個原發(fā)性不孕家系中也發(fā)現(xiàn)該突變，并均表現(xiàn)為卵巢儲備功能下降(DOR)，因此HE等[29]認(rèn)為TBPL2基因可作為DOR和原發(fā)性不孕的遺傳標(biāo)記。

WANG等[30]在一個以卵母細(xì)胞生發(fā)泡(GV)期阻滯為特征的原發(fā)性不孕家系中發(fā)現(xiàn)了TBPL2基因純合錯義突變(c.895T>C；p.C299R)。該突變可以使TBPL2蛋白的穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)錄活性下降，影響其轉(zhuǎn)錄起始功能，降低卵母細(xì)胞中ZP3、H2BC等基因的表達(dá)，導(dǎo)致卵母細(xì)胞停滯于GV期。

4.2 TBPL2基因突變與卵巢早衰的關(guān)系

TBPL2基因敲除的小鼠與卵巢早衰(POF)患者在生殖方面的臨床特征相似，因此有研究者認(rèn)為TBPL2基因突變可能導(dǎo)致POF。全基因組關(guān)聯(lián)分析研究發(fā)現(xiàn)，人類14號染色體上的基因突變可能與POF相關(guān)[31]。ABOURA等[32]將研究中發(fā)現(xiàn)的拷貝數(shù)變異(CNV)與基因組變異數(shù)據(jù)庫中表型正常人群的CNV比較，結(jié)果顯示8個染色體區(qū)的CNV差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義，其中染色體14q32.33區(qū)域發(fā)現(xiàn)了6種基因(SIVA1、AKT1、ZBTB42、INF2、ADSSL1、MGC23270)，該報道提示14號染色體上可能存在POF致病的候選基因，而TBPL2基因也位于人類的第14號染色體上。曹金翔[33]的研究認(rèn)為TBPL2基因編碼區(qū)的突變可能與中國漢族女性的POF發(fā)生無關(guān)，該研究除了發(fā)現(xiàn)已知的單核苷酸多態(tài)性位點外，沒有發(fā)現(xiàn)其他突變。該研究的POF實驗組與正常人群對照組基因型分布和等位基因頻率也無明顯差異。造成該結(jié)果的原因可能有以下幾點：一方面許多POF候選基因在不同種族之間表現(xiàn)出顯著的頻率差異，該研究的人群局限于中國漢族女性且樣本量不足，因此得到的結(jié)果不能用來解釋TBPL2基因在其他種族POF患者中的作用；另一方面TBPL2基因致病突變位點位于基因的非編碼區(qū)，而非編碼區(qū)(如啟動子、內(nèi)含子或其他調(diào)節(jié)區(qū)域)并未包含在此次檢測范圍內(nèi)。因此可能需要在包括其他種族群體在內(nèi)的更大樣本量中研究TBPL2基因與POF的相關(guān)性。

5 TBPL2基因突變患者的臨床表現(xiàn)及治療

對已報道的TBPL2基因突變患者的臨床特征進(jìn)行總結(jié)，發(fā)現(xiàn)這類患者通常因不明原因?qū)е略l(fā)性不孕多年而就診，她們的基礎(chǔ)促卵泡生成素水平高于正常，部分患者基礎(chǔ)竇卵泡數(shù)偏少，卵巢功能低于同齡人群；在接受體外助孕促排卵治療過程中有些患者卵巢反應(yīng)慢，用藥量大；獲卵后表現(xiàn)為卵母細(xì)胞成熟障礙、受精障礙或早期胚胎發(fā)育停滯等，盡管采用卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)或卵泡漿內(nèi)單精子注射助孕仍不能獲得優(yōu)質(zhì)胚胎[34]。

目前臨床上最常用的改善卵母細(xì)胞成熟度的方法，如改變促排卵方案、延長人絨毛促性腺激素作用時間、卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)等治療本病效果均不是特別理想，因此大部分患者仍然需要依靠供卵獲得成功妊娠[35]。

6 小結(jié)

TBPL2作為脊椎動物卵母細(xì)胞中特異性表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，在卵母細(xì)胞成熟過程中起關(guān)鍵作用。TBPL2基因突變可導(dǎo)致卵泡發(fā)育缺陷、卵母細(xì)胞成熟障礙，引起POF或原發(fā)性不孕，該類患者需借助供卵治療以獲得期望結(jié)局。

利益沖突聲明：所有作者聲明不存在利益沖突。

ConflictsofInterest： All authors disclose no relevant conflicts of interest.

作者貢獻(xiàn)：趙涵和秦瑩瑩參與論文的選題；李佳霖、趙涵、楊萍和秦瑩瑩參與論文的寫作與修改；所有作者均閱讀并同意發(fā)表該論文。

Contributions： The topic of the review was disigned byZHAOHanandQINYingying. The manuscript was drafted and revised byLIJialin,ZHAOHan,YANGPing, andQINYingying. All the authors have read the last version of the paper and consented submission.