趙歡 王璟璐 張穎 廖生進 杜建軍 郭新宇 趙春江

摘要：針對玉米自交系莖稈不同節(jié)位形態(tài)特征差異大、維管束分布不同等特點，利用Micro-CT掃描技術及基于區(qū)帶的維管束表型解析方法，對莖稈基部第3節(jié)、穗位節(jié)、頂位節(jié)節(jié)間進行顯微圖像獲取，實現(xiàn)莖稈不同節(jié)間橫切面、表皮區(qū)、周皮區(qū)、髓區(qū)、維管束相關表型的精準解析。研究結果表明，基于區(qū)帶的維管束表型解析方法適用于莖稈不同節(jié)間維管束表型解析，可獲得表征莖稈節(jié)間組織和維管束形態(tài)、幾何性狀、分布等共47項指標，獲取效率高達20 s/張圖像。同傳統(tǒng)方法相比，基于區(qū)帶的維管束表型解析方法效率高、通量大，且可獲取的表型指標類型多。描述性統(tǒng)計分析結果顯示，同莖稈橫切面長軸長等傳統(tǒng)指標相比，基于區(qū)帶的維管束表型解析方法獲取的功能區(qū)表型指標變異系數(shù)較大，能更好地反映出不同節(jié)間、不同自交系間的差異;且在不同自交系間，基部第3節(jié)的周皮區(qū)維管束數(shù)量（P=7.79×10-29）和穗位節(jié)的周皮區(qū)維管束面積占比（P=1.79×10-26）差異最顯著。此外，從基部到頂部，表征橫切面及各功能區(qū)幾何、形態(tài)性狀以及維管束數(shù)量、面積相關的表型指標呈依次減小的趨勢;表征維管束分布的表型指標呈依次增加的趨勢;功能區(qū)面積占比分布趨勢不同，其中周皮區(qū)面積占比在基部節(jié)間最大，髓區(qū)面積占比在穗位節(jié)最大，表皮區(qū)面積占比在頂位節(jié)最大。本研究實現(xiàn)了玉米自交系莖稈不同節(jié)間維管束表型的高通量獲取與精準解析，初步揭示了表型指標在不同節(jié)間的分布趨勢，可為后期莖稈表型遺傳解析和性狀定向改良提供參考。

關鍵詞：玉米莖稈;Micro-CT;區(qū)帶;維管束表型;高通量獲取;精準解析

中圖分類號：S126;S513.01 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2022）12-0201-11

收稿日期：2021-12-26

基金項目：國家自然科學基金（編號：31801254）;北京市農(nóng)林科學院作物表型協(xié)同創(chuàng)新中心項目（編號：KJCX201917）。

作者簡介：趙 歡（1997—），女，四川廣元人，碩士研究生，主要從事作物表型組學研究。E-mail：3321621249@qq.com。

通信作者：趙春江，博士，研究員，中國工程院院士，主要從事農(nóng)業(yè)信息化關鍵技術研究。E-mail：zhaocj@nercita.org.cn。

隨著高通量測序技術和信息技術的飛速發(fā)展，作物科學研究進入了大數(shù)據(jù)、大平臺、大發(fā)現(xiàn)的新時代[1-3]。近年來，以高通量、自動化、智能化為主要特征的表型組學技術及平臺系統(tǒng)層出不窮，使得多尺度、高精度、自動化的表型檢測成為可能，為實現(xiàn)作物多維度表型精準鑒定奠定了良好基礎。在此背景下，基于組學的莖稈維管束形態(tài)、分布、關聯(lián)性等高通量、精準性、系統(tǒng)性研究對助力作物莖稈維管束的表型特征分析和遺傳解析具有重要意義[1-2]。

玉米莖稈維管束是“流”的重要組成部分，由木質部和韌皮部構成，負責水分和有機養(yǎng)分的運輸。由于受限于顯微表型檢測設備分辨率和表型解析手段，玉米莖稈維管束研究進程緩慢。傳統(tǒng)玉米莖稈維管束表型檢測主要依賴顯微鏡進行局部觀察。顯微鏡雖然分辨率高，但成像視野小，僅能獲取預先選擇的、特定組織中的維管束數(shù)量、面積等表型指標，且無論是人工測量還是應用商業(yè)軟件，都需要大量人工參與，費時費力[4-7]。因此，基于顯微鏡的觀察方法無法滿足大規(guī)模、系統(tǒng)性的玉米莖稈維管束表型特征分析需求，迫切需要找到一種高通量、自動化的維管束表型研究方法來打破困局。2014年，Legland等利用BlueBox宏觀成像系統(tǒng)對人為去除表皮和周皮的玉米莖稈橫切面進行成像分析，獲得了維管束空間分布相關性狀[8]。2015年，Heckwolf等通過平板掃描儀獲得玉米莖稈整個橫切面圖像，提出一種自定義圖像處理程序對圖像進行自動化解析，成功實現(xiàn)在樣品無損的情況下對髓組織內(nèi)部維管束表型指標的提取，但并未實現(xiàn)對周皮維管束的表型獲取[9]。2017年，Legland等基于玻片掃描儀對Fasga染色后的整個莖稈橫切面進行成像，量化各組織區(qū)塊成色單元，為莖稈外圍維管束相關表型測量提供了可能[10]。

鑒于傳統(tǒng)成像系統(tǒng)及表型提取手段的諸多不足，通過二維成像技術提取玉米莖稈維管束表型仍存在較大困難。如今，顯微計算機χ射線斷層掃描（Micro-CT）等三維成像技術在作物表型研究領域得到越來越多的關注[11-15]，為玉米維管束性狀的提取提供了新的技術途徑。Micro-CT系統(tǒng)作為一種高分辨率、高精度儀器，不僅能對植株內(nèi)部顯微表型進行精準獲取，還能最大程度地保留樣品的完整性?；贛icro-CT掃描技術，可以精準定量玉米莖稈在伸長期和抽雄期的顯微指標，實現(xiàn)不同生長階段的實時觀測[16];還可以獲取不同品種玉米莖稈不同節(jié)間的解剖特征，進行解剖表型與抗倒伏性的關系研究[17]。基于CT圖像，Zhang等研發(fā)出專用于維管束表型分析的圖像處理軟件VesselParser 4.0，該軟件根據(jù)莖稈內(nèi)物質分布（CT值），將莖稈橫切面精準劃分為表皮區(qū)、周皮區(qū)和髓區(qū)，并提出了基于區(qū)帶的表型解析方法。該方法的提出與應用不僅實現(xiàn)了莖稈橫切面的組織劃分，還實現(xiàn)了維管束分類以及維管束數(shù)量、面積和空間分布等顯微表型特征的自動化獲取[18]。目前，基于區(qū)帶的維管束表型解析方法已成功應用于玉米莖稈基部第3節(jié)維管束的表型研究及遺傳解析，而尚無在莖稈其他節(jié)間的應用報道。

本研究針對玉米自交系莖稈不同節(jié)間形態(tài)特征差異大、維管束分布不同等特點，利用Micro-CT掃描技術和基于區(qū)帶的維管束解析方法，對玉米自交系莖稈基部第3節(jié)、穗位節(jié)和頂位節(jié)進行維管束表型高通量獲取及精準解析，并基于獲取的莖稈橫切面及各區(qū)帶幾何形態(tài)性狀和維管束數(shù)量、面積及分布等47項表型指標，開展玉米不同節(jié)間的差異分析，以期為進一步的遺傳學研究和性狀定向改良提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料4FC70124-2524-41CF-BEF5-849E79D3D36F

試驗材料為玉米關聯(lián)分析群體[19]中莖稈粗細不同的36個自交系，材料來源地涵蓋了熱帶、亞熱帶及溫帶等多氣候帶。具體材料信息如下，非堅稈綜合種（non-stiff stalk，NSS）：MO113、GEMS58、By4839、M153、By813、BEM、Dan360、Zheng28、P138;堅稈綜合種（Stiff Stalk，SS）：GEMS14、832、Tie7922、U8112、GEMS52、B110、Zheng32、GEMS13、GEMS4;熱帶種質材料（Tropical-subtropical，TST）：GEMS31、CIMBL55、CIMBL50、CIMBL69、CIMBL63、CIMBL90、CML69、CML170、CML171;混合材料（Mixed）：SK、CIMBL154、Ye515、Zheng22、TY2、TY7、Ye107、Zhong69、3H-2。

1.2 田間試驗設計及樣品制備

供試材料于2018年4月28日在北京市農(nóng)林科學院通州試驗基地（116°E，39.69°N）種植，采用完全隨機區(qū)組設計，8次重復，每個自交系種植4行，行長2.1 m，行距0.6 m。種植密度和水肥管理均參照當?shù)卮筇锷a(chǎn)模式。

在玉米吐絲期（種植73 d后）選取長勢一致的植株進行取樣，每個小區(qū)取3株作為重復。獲取各自交系基部第3節(jié)、穗位節(jié)（最大果穗著生處）和頂位節(jié)的節(jié)間中部切片，獲取長度2 cm以上，取樣后及時放置在甲醛-乙酸-乙醇（FAA）固定液（70%乙醇、100%甲醛、100%乙酸體積比為90 ∶5 ∶5）中進行固定。

1.3 莖稈樣本前處理及CT掃描

（1）樣本脫水。樣本固定完成后，從固定液中取出，進行系列脫水處理，具體流程為：70%乙醇 4 h→100%乙醇 4 h→100%乙醇 4 h→100%叔丁醇 4 h→100%叔丁醇 4 h。（2）樣本超低溫冷凍。叔丁醇代替完成后，將樣品從叔丁醇中取出，放置 -80 ℃ 超低溫箱中冷凍24 h以上。（3）超低溫冷凍干燥。將經(jīng)超低溫冷凍的樣品放置于超低溫冷凍干燥儀（LGJ-10E，中國）的樣品倉中，-30 ℃ 干燥3～4 h。（4）固態(tài)碘染色。將干燥后的樣品加固態(tài)碘進行染色，每個樣品中大致放3～5顆固態(tài)碘珠，待染色均勻后進行CT掃描。（5）CT掃描。使用Skyscan 1172 X射線計算機斷層攝影系統(tǒng)（Bruker Corporation）進行樣品掃描，掃描參數(shù)設置參照Zhang等設置的CT掃描參數(shù)[17]。（6）圖像重構。利用Skyscan NRecon軟件（Bruker Corporation）進行重構，亨氏單位（HU）統(tǒng)一設置為-500～9 40，獲得一系列玉米穗位節(jié)橫截面為8位（8-bit）的圖像文件格式（bmp），用于后期表型特征提取與分析。（7）表型指標提取。使用VesselParser 4.0對莖稈CT圖像進行處理，自動獲取表型指標。

1.4 表型數(shù)據(jù)分析

利用R語言（https：//cran.r-project.org/）進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。首先，采用“l(fā)m”函數(shù)進行線性回歸分析，建立實測值與VesselParser 4.0軟件提取值之間的線性模型;然后，利用psych包對表型數(shù)據(jù)進行描述性統(tǒng)計分析，結合CT圖像進行莖稈不同節(jié)間形態(tài)及表型指標對比分析;最后，對表型指標進行不同自交系間或不同節(jié)間的單因素方差分析。數(shù)據(jù)分析結果的可視化由ggplot2包呈現(xiàn)。

2 結果與分析

2.1 不同節(jié)間顯微成像及基于區(qū)帶的維管束表型特征解析

參照Zhang等已有的基部第3節(jié)維管束表型解析結果[18]，利用Micro-CT掃描技術同時對玉米莖稈上中下關鍵的基部第3節(jié)、穗位節(jié)、頂位節(jié)進行顯微圖像獲取。從圖1中原始圖像可以看出，在外部形態(tài)上，從基部第3節(jié)到穗位節(jié)再到頂位節(jié)，玉米橫切面呈橢圓—扇形—圓形變化，橫切面面積依次減小。維管束分布在周皮和髓組織，其中周皮維管束較大，分布密集，髓組織維管束較小，分布松散。在基部第3節(jié)中，周皮維管束有3～4層，維管束間分布緊密;穗位節(jié)的周皮維管束有1～2層，但分布不均勻，其中凹面分布著1層維管束，凸面分布著2層維管束;在頂位節(jié)中，周皮分布著1層間距稀疏的維管束。

采用基于區(qū)帶的維管束表型解析方法對不同節(jié)間顯微圖像進行解析，可將莖稈橫切面分割為3個功能區(qū)，分別為表皮區(qū)、周皮區(qū)和髓區(qū)。結果表明，針對基部第3節(jié)內(nèi)部物質分布（CT值）提出的基于區(qū)帶的維管束表型解析新方法不受莖稈外部形態(tài)和內(nèi)部解剖結構的影響，在莖稈穗位節(jié)和頂位節(jié)間表型解析均具有較好的適用性。對玉米莖稈不同節(jié)間橫切面進行功能區(qū)劃分后，維管束根據(jù)分布位置差異，分為周皮區(qū)維管束和髓區(qū)維管束。按照傳統(tǒng)維管束分類標準[20]，即根據(jù)維管束面積和結構將其分為大維管束和小維管束，本研究使用的基于區(qū)帶的維管束表型解析方法除維管束面積外，還參考了維管束內(nèi)部空腔大小、CT值和分布密度，因而能夠反映莖稈不同節(jié)間內(nèi)部物質含量、維管束結構特征和分布變化。利用該方法處理單張CT圖像，可一次性自動獲取47項表型指標（表1），可分為莖稈橫切面類（8項）、表皮區(qū)類（3項）、周皮區(qū)類（10項）、髓區(qū)類（10項）和維管束類（13項）。其中橫切面類、維管束類歸類于傳統(tǒng)表型指標，表皮區(qū)類、周皮區(qū)類、髓區(qū)類表型指標歸類于功能區(qū)表型指標。

為評價采用VesselParser 4.0獲取的穗位節(jié)和頂位節(jié)表型指標精度，利用ImageJ軟件手動統(tǒng)計穗位節(jié)和頂位節(jié)節(jié)間的維管束總數(shù)量（VB_N），然后與VesselParser 4.0自動解析的VB_N進行線性回歸分析，結果如圖2所示。在穗位節(jié)中，線性回歸模型的決定系數(shù)r2為0.98;在頂位節(jié)中，線性回歸模型的決定系數(shù)r2為0.95。兩節(jié)位的模型決定系數(shù)均接近 表明基于VesselParser 4.0軟件獲取的 VB_N 與實測值吻合程度高，說明本研究采用VesselParser 4.0獲取的莖稈節(jié)間表型指標精度高，可用于后續(xù)不同節(jié)間的特征分析。4FC70124-2524-41CF-BEF5-849E79D3D36F

由表2可知，同石蠟切片與人工測量等傳統(tǒng)維管束表型獲取方法相比[21-22]，Micro-CT掃描技術簡化了前期制樣流程，基于區(qū)帶的維管束表型解析方法可在 0 s 左右完成單張圖像的表型解析，且支持批處理，大大提高了莖稈維管束表型的獲取效率，適合大群體維管束表型指標高通量獲取。此外，傳統(tǒng)方法獲取的維管束表型指標（如大、小維管束數(shù)量和面積）是在顯微圖像的局部區(qū)域中獲取;而本研究是基于完整的橫切面圖像提取到表征莖稈橫切面及各區(qū)帶幾何、形態(tài)性狀，以及維管束數(shù)量、形狀、面積、分布等幾大類重要表型指標，獲取的表型指標類型豐富，且數(shù)量多達傳統(tǒng)研究方法的5倍以上。以上結果表明，基于區(qū)帶的維管束表型解析方法不僅能實現(xiàn)玉米不同節(jié)位莖稈維管束表型指標的高通量獲取，還能實現(xiàn)表型指標的精準解析。

2.2 玉米莖稈不同節(jié)間表型指標描述性統(tǒng)計分析

分別對玉米莖稈基部第3節(jié)、穗位節(jié)、頂位節(jié)的47項表型指標進行描述性統(tǒng)計，進而分析不同節(jié)間表型特征。以表征玉米莖粗的表型指標SZ_LA作為參照，對比分析各項表型指標的變異情況。

由表3可知，基部第3節(jié)的SZ_LA變異系數(shù)（CV）為16.35%，其余指標中有26項表型指標的變異系數(shù)大于16.35%，其中功能區(qū)表型指標占一半以上（表皮區(qū)3項，周皮區(qū)6項，髓區(qū)6項）。在基部第3節(jié)中，變異系數(shù)最大的表型指標為IZ_VB_CA（CV=42.25%），是SZ_LA的2.6倍左右。在穗位節(jié)中，有28項表型指標的變異系數(shù)大于SZ_LA的變異系數(shù)（CV=15.42%），其中功能區(qū)表型指標有16項（表皮區(qū)3項，周皮區(qū)7項，髓區(qū)6項）。穗位節(jié)的VB_LWR變異系數(shù)（CV=33.75%）最大，是 SZ_LA 的變異系數(shù)的2.2倍左右。頂位節(jié)的 SZ_LA 變異系數(shù)為19.71%，其余指標中有25項表型指標的變異系數(shù)大于19.71%，其中表皮區(qū)3項，周皮區(qū)5項，髓區(qū)6項。而且IZ_VB_CA在頂位節(jié)中變異系數(shù)（CV=43.36%）最大，是SZ_LA變異系數(shù)的2.2倍。

描述統(tǒng)計結果顯示，SZ_LA在不同節(jié)間的變異系數(shù)不同，尤其是在穗位節(jié)時最小，這可能與穗位節(jié)外部形態(tài)結構相關。此外，以SZ_LA為變異系數(shù)分界線，高于該分界線的表型指標中，至少有一半指標為功能區(qū)表型指標，特別是基部第3節(jié)和頂位節(jié)表型變異系數(shù)最大的表型指標均來自功能區(qū)類（IZ_VB_CA）。結果表明，同傳統(tǒng)指標相比，基于區(qū)帶的維管束表型解析方法獲取的功能區(qū)表型指標能更好地反映出不同自交系間的差異。

2.3 玉米莖稈不同節(jié)間表型指標方差分析

分別對基部第3節(jié)、穗位節(jié)、頂位節(jié)的47項表型指標進行不同自交系間的差異分析。方差分析結果（表4）顯示，基部第3節(jié)的47項表型指標在不同自交系間均存在顯著差異（P<0.05），其中 SZ_LA 在不同自交系間的P=5.11×10-18，與顯著性最高的PZ_VB_N（P=7.79×10-29）相差11個數(shù)量級。在穗位節(jié)中，47項表型指標均在不同自交系間存在顯著差異（P<0.05）。SZ_LA在不同自交系間的顯著性為P=5.96×10-2 與顯著性最高的 PZ_VB_AR（P=1.79×10-26）相差5個數(shù)量級。在頂位節(jié)中，除SRVB外，其余46項表型指標在不同自交系間均存在顯著差異（P<0.05）。其中，差異性最高的表型指標為VB_N（P=1.25×10-21），與 SZ_LA（P=8.20×10-14）相差7個數(shù)量級。

方差分析結果還顯示，盡管基部第3節(jié)、穗位節(jié)和頂位節(jié)的47項表型指標大多在P<0.05水平上存在顯著差異，但是不同節(jié)間差異最顯著的表型指標卻各不相同。其中，基部第3節(jié)和穗位節(jié)差異最顯著的指標均為功能區(qū)的周皮區(qū)類表型指標，進一步表明基于區(qū)帶進行維管束解析更有助于莖稈維管束表型精準鑒定。此外，同描述統(tǒng)計結果相似，穗位節(jié)的SZ_LA在不同自交系間的差異顯著性水平高于其他節(jié)間，可能與穗位節(jié)外部形態(tài)結構相關。

2.4 玉米不同節(jié)間維管束表型指標隨葉序分布趨勢研究

為研究表型指標在單株尺度內(nèi)的分布情況，對47項表型指標做關于不同節(jié)間的方差分析。結果顯示，除SZ_LWR外，其余46項表型指標在基部第3節(jié)、穗位節(jié)和頂位節(jié)間均存在顯著差異（P<0.05）。隨后，對差異顯著的46項表型指標進行3個節(jié)間的多重比較分析，進一步探究各表型指標在基部第3節(jié)、穗位節(jié)、頂位節(jié)的具體分布，并將結果進行數(shù)據(jù)可視化。

由圖3可知，除莖稈橫切面類表型指標和維管束類表型指標等傳統(tǒng)表型指標，基于區(qū)帶獲取的新表型指標在3個節(jié)間具有明顯的分布規(guī)律。首先是橫切面類（SZ_A、SZ_CA、SZ_CCA、SZ_P、SZ_LA、SZ_SA）和維管束類（VB_N、VB_A、VB_Aave、VB_CAave、VB_CCAave、VB_LAave、VB_SAave、VB_Pave、ARIVB）等傳統(tǒng)表型指標，從基部第3節(jié)到穗位節(jié)再到頂位節(jié)呈依次減小的趨勢，并且兩兩節(jié)間差異顯著。其次是基于區(qū)帶獲得的新表型指標，功能區(qū)面積（EZ_A、IZ_A、PZ_A）、功能區(qū)厚度（IZ_T、PZ_T）以及功能區(qū)維管束數(shù)量（IZ_VB_N、PZ_VB_N）、面積（IZ_VB_A、PZ_VB_A）和凸包面積（IZ_VB_CA、PZ_VB_CA），從基部到頂部呈依次減小的趨勢，并且兩兩節(jié)間差異顯著。

同VB_D分布一樣，PZ_VB_D和IZ_VB_D從基部第3節(jié)到穗位節(jié)再到頂位節(jié)呈依次增加趨勢。此外，表型指標EZ_AR、PZ_VB_AA、VB_LWR也呈現(xiàn)同樣的分布趨勢，并且兩兩節(jié)間差異顯著。

此外，IZ_AR、IZ_VB_CAR從基部第3節(jié)到穗位節(jié)再到頂位節(jié)呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢，且在穗位節(jié)時顯著大于其他2個節(jié)間。而PZ_AR、SZ_CAR呈現(xiàn)相反的分布趨勢，且在穗位節(jié)時顯著小于基部第3節(jié)和頂位節(jié)。4FC70124-2524-41CF-BEF5-849E79D3D36F

綜合差異分析結果可知，47項表型指標中有36項在基部第3節(jié)、穗位節(jié)和頂位節(jié)具有明顯的分布趨勢，其中有18項表型指標來自各功能區(qū)。此外，從基部到頂部分布趨勢并非依次減小的表型指標主要來自各功能區(qū)，如IZ_AR、PZ_AR，這些表型指標可為后期進行節(jié)間功能研究和性狀定向改良提供參考。

3 討論與結論

3.1 基于區(qū)帶的玉米不同節(jié)間維管束表型特征精準解析

基于區(qū)帶的維管束表型解析方法于2021年由Zhang等首次提出[18]。該團隊通過Micro-CT掃描技術和圖像處理軟件VesselParser 4.0對玉米基部第3節(jié)的維管束表型進行研究，并根據(jù)莖稈內(nèi)物質分布將橫切面分割為3個功能區(qū)，實現(xiàn)了對玉米莖稈基部第3節(jié)橫切面的精準分割以及維管束結構及分布變化的特征提取。本研究基于Zhang等的研究結果[18]，首次將基于區(qū)帶的維管束表型解析新方法應用于穗位節(jié)和頂位節(jié)，獲取效率高達20 s/張圖像，相較傳統(tǒng)手段一次性可獲得的表型指標增至5倍以上，實現(xiàn)了表型指標的高通量獲取。最終在3個節(jié)間均獲取了包括莖稈橫切面及各區(qū)帶幾何形態(tài)性狀和維管束數(shù)量、面積及分布等在內(nèi)的47項表型指標。對比分析不同節(jié)間CT圖像，結果表明，雖然穗位節(jié)和頂位節(jié)在外部形態(tài)和內(nèi)部解剖結構上與基部第3節(jié)存在明顯差異，但是應用于基部第3節(jié)橫切面的功能區(qū)分割方法同樣適用于穗位節(jié)和頂位節(jié)的研究，表明基于區(qū)帶的維管束表型解析方法對玉米莖稈不同節(jié)位均具有較好的適用性。此外，穗位節(jié)和頂位節(jié)的VB_N線性回歸模型的決定系數(shù)均高于0.95，表明通過VesselParser 4.0軟件自動解析的表型指標精度較高。

3.2 玉米不同節(jié)間維管束表型特征差異分析

玉米莖稈不同節(jié)間維管束表型特征不同。47項表型指標在不同自交系間的差異分析結果表明，盡管多項表型指標在基部第3節(jié)、穗位節(jié)、頂位節(jié)間存在顯著差異，但是不同節(jié)間差異最顯著的表型指標卻并不相同。其中，不同節(jié)間維管束表型差異最顯著的表型指標分別為基部第3節(jié)的PZ_VB_N（P=7.79×10-29）、穗位節(jié)的PZ_VB_AR（P=1.79×10-26）和頂位節(jié)的VB_N（P=1.25×10-21），其中前2項指標均為功能區(qū)表型指標，進一步表明基于區(qū)帶進行維管束解析更有助于莖稈維管束表型精準鑒定。

已有研究表明，基部第3節(jié)是植株抗倒伏研究的重要對象[23]。蔣傲男等的研究表明，維管束數(shù)量與基部第3節(jié)穿刺強度呈顯著負相關[24];李波等研究發(fā)現(xiàn)，小維管束數(shù)量在莖稈穩(wěn)定性方面發(fā)揮重要作用[25]。在本研究的方差分析結果中，基部第3節(jié)的PZ_VB_N和VB_N在不同自交系間差異最顯著，據(jù)此推斷這2項表型指標可能與玉米莖稈抗倒伏性的相關程度較高。在穗位節(jié)相關的研究中，何啟平等研究發(fā)現(xiàn)由莖節(jié)維管束等橫向分支組成的穗部維管束系統(tǒng)是養(yǎng)分從植株運輸?shù)阶蚜Ｖ械闹匾Ｕ蟍26]。Ren等研究發(fā)現(xiàn)，穗位節(jié)間大維管束面積占總維管束面積比例的均值小于小維管束面積占總維管束面積的比例，而增施氮肥有利于增加小維管束面積占總維管束面積的比例，提高物質運輸速率，加快光合產(chǎn)物向庫運輸[5]。侯彥龍等也指出維管束面積大有利于營養(yǎng)物質運輸[27]。而本研究在穗位節(jié)間表型指標關于不同自交系間的差異分析結果表明，PZ_VB_AR、IZ_VB_AR、IZ_VB_N在不同自交系間差異最顯著。相較前人的研究，本研究獲取的表型指標更精細，分區(qū)特征更明顯，可為穗位節(jié)的物質運輸相關研究提供參考。在玉米莖稈上部節(jié)間維管束的研究中，王越等利用198份玉米自交系對雄穗中部維管束性狀開展不同雜種優(yōu)勢群的比較，結果發(fā)現(xiàn)大、小維管束數(shù)量和單個大、小維管束面積在不同自交系間的差異均達到極顯著水平[28]。楊碩等利用172份玉米自交系對莖稈上部維管束數(shù)量進行差異分析，結果同樣表明大、小維管束數(shù)量在不同自交系間呈極顯著差異[7]。而在本研究中，不同自交系在頂位節(jié)的差異分析結果顯示，除頂位節(jié)的VB_N、IZ_VB_N外，VB_AR也在0.05水平上存在顯著差異。

3.3 玉米不同節(jié)間維管束表型指標隨葉序分布趨勢

莖稈維管束表型指標在單株尺度內(nèi)莖稈不同節(jié)間分布趨勢明顯。對獲取的47項表型指標進行不同節(jié)間分布趨勢研究發(fā)現(xiàn)，表征橫切面及各功能區(qū)幾何、形態(tài)，以及維管束數(shù)量、面積相關的表型指標從基部到頂部呈依次減小的趨勢。這一結果與前人的研究結果一致，如Ren等指出大、小維管束數(shù)量從基部節(jié)、穗位節(jié)、穗柄到穗軸呈減小趨勢[5];趙雪等指出玉米莖稈維管束數(shù)量從基部向上逐漸減小[29]。而表征維管束分布的表型指標從基部到頂部呈依次增加的趨勢。此外，本研究發(fā)現(xiàn)功能區(qū)面積占比從基部第3節(jié)到穗位節(jié)再到頂位節(jié)的分布趨勢不同，其中EZ_AR呈依次增加的趨勢，IZ_AR呈先增加后減小的趨勢，PZ_AR呈先減小后增加的趨勢。

綜上所述，本研究利用Micro-CT掃描技術及基于區(qū)帶的維管束表型解析方法，實現(xiàn)了玉米自交系不同節(jié)間維管束表型的高通量獲取與精準解析，并首次證明基于區(qū)帶的維管束表型解析方法對不同節(jié)位均具有較好的適用性。方差分析結果顯示，47項表型指標中，基部第3節(jié)和穗位節(jié)在不同自交系中差異最顯著的指標均為周皮區(qū)類表型指標，進一步表明基于區(qū)帶的維管束解析方法相較傳統(tǒng)手段更有助于玉米莖稈維管束表型的精準鑒定。表型指標從基部到頂部的分布趨勢研究表明，大部分表型指標分布趨勢一致，均呈依次減小的趨勢，但功能區(qū)（表皮區(qū)/周皮區(qū)/髓區(qū)）面積占比卻不一致，表明基于區(qū)帶的維管束解析方法獲取的表型指標更能突顯出不同節(jié)間差異，進而為后續(xù)遺傳學分析和性狀定向改良提供表型參考。

參考文獻：

[1]趙春江. 植物表型組學大數(shù)據(jù)及其研究進展[J]. 農(nóng)業(yè)大數(shù)據(jù)學報，2019，1（2）：5-18.

[2]胡偉娟，傅向東，陳 凡，等. 新一代植物表型組學的發(fā)展之路[J]. 植物學報，2019，54（5）：558-568.4FC70124-2524-41CF-BEF5-849E79D3D36F

[3]張 穎，廖生進，王璟璐，等. 信息技術與智能裝備助力智能設計育種[J]. 吉林農(nóng)業(yè)大學學報，202 43（2）：119-129.

[4]Huang C，Chen Q Y，Xu G H，et al. Identification and fine mapping of quantitative trait loci for the number of vascular bundle in maize stem[J]. Journal of Integrative Plant Biology，2016，58（1）：81-90.

[5]Ren H，Jiang Y，Zhao M，et al. Nitrogen supply regulates vascular bundle structure and matter transport characteristics of spring maize under high plant density[J]. Frontiers in Plant Science，202 11：602739.

[6]馮海娟，張善平，馬存金，等. 種植密度對夏玉米莖稈維管束結構及莖流特性的影響[J]. 作物學報，2014，40（8）：1435-1442.

[7]楊 碩，鄭云霄，黃亞群，等. 不同玉米自交系莖稈上部維管束數(shù)目的差異分析[J]. 植物遺傳資源學報，202 2（2）：466-475.

[8]Legland D，Devaux M F，Guillon F. Statistical mapping of maize bundle intensity at the stem scale using spatial normalisation of replicated images[J]. PLoS One，2014，9（3）：e90673.

[9]Heckwolf S，Heckwolf M，Kaeppler S M，et al. Image analysis of anatomical traits in stalk transections of maize and other grasses[J]. Plant Methods，2015，11（1）：1-11.

[10]Legland D，El-Hage F，Méchin V，et al. Histological quantification of maize stem sections from FASGA-stained images[J]. Plant Methods，2017，13（1）：1-11.

[11]趙 歡，王璟璐，廖生進，等. 基于Micro-CT的玉米籽粒顯微表型特征研究[J]. 智慧農(nóng)業(yè)（中英文），202 3（1）：16-28.

[12]Shao M，Zhang Y，Du J J，et al. Fast analysis of maize kernel plumpness characteristics through Micro-CT technology[C]// Rannenberg K. International Conference on Intelligent Agriculture 017（ICIA2017） PartI. Changchun： Beijing Engineering Research Center for Agriculture Internet of Things， China Agricultural University，2017：46-54.

[13]Zhang Y，Ma L M，Pan X D，et al. Micron-scale phenotyping techniques of maize vascular bundles based on X-ray microcomputed tomography[J]. Journal of Visualized Experiments，2018 （140）：e58501.

[14]Du J J，Zhang Y，Guo X，et al. Micron-scale phenotyping quantification and three-dimensional microstructure reconstruction of vascular bundles within maize stalks based on micro-CT scanning[J]. Functional Plant Biology，2016，44（1）：10-22.

[15]Wu D，Wu D，F(xiàn)eng H，et al. A deep learning-integrated micro-CT image analysis pipeline for quantifying rice lodging resistance-related traits[J]. Plant Communications，202 （2）：100165.

[16]Zhang Y，Ma L M，Wang J，et al. Phenotyping analysis of maize stem using micro-computed tomography at the elongation and tasseling stages[J]. Plant Methods，2020，16（1）：1-14.

[17]Zhang Y，Du J J，Wang J L，et al. High-throughput micro-phenotyping measurements applied to assess stalk lodging in maize （Zea mays L.）[J]. BioMed Central，2018，51（1）：40.4FC70124-2524-41CF-BEF5-849E79D3D36F

[18]Zhang Y，Wang J L，Du J J，et al. Dissecting the phenotypic components and genetic architecture of maize stem vascular bundles using high‐throughput phenotypic analysis[J]. Plant Biotechnology Journal，202 19（1）：35-50.

[19]Yang X H，Gao S B，Xu S T，et al. Characterization of a global germplasm collection and its potential utilization for analysis of complex quantitative traits in maize[J]. Molecular Breeding，201 8（4）：511-526.

[20]何啟平，董樹亭，高榮岐. 不同類型玉米品種果穗維管束的比較研究[J]. 作物學報，2007，33（7）：1187-1196.

[21]李素坤，張秋芝，郝玉蘭，等. 玉米成熟期莖稈石蠟切片方法的研究[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學，2010，38（8）：3935-3937.

[22]Zhang Y，Guo X Y，Yan W P，et al. Three-dimensional visualization of vascular bundles in stem nodes of maize[J]. Fresenius Environmental Bulletin，2017，26（5）：3395-3401.

[23]張士龍，賈海濤，賀正華，等. 長江中游夏玉米成熟期莖稈力學特性及其影響因素研究[J]. 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2020（24）：9-12，17.

[24]蔣傲男，閆靜琦，盧海博，等. 不同春玉米品種莖稈顯微結構對抗折強度的響應[J]. 玉米科學，2020，28（5）：53-59.

[25]李 波，張吉旺，崔海巖，等. 施鉀量對高產(chǎn)夏玉米抗倒伏能力的影響[J]. 作物學報，2012，38（11）：2093-2099.

[26]何啟平，董樹亭，高榮岐. 玉米果穗維管束系統(tǒng)的發(fā)育及其與穗粒庫容的關系[J]. 作物學報，2005，31（8）：995-1000，1105-1106.

[27]侯彥龍，馬 丹. 玉米生長發(fā)育規(guī)律研究現(xiàn)狀[J]. 中國農(nóng)業(yè)信息，2014（23）：14.

[28]王 越，李小雨，李青青，等. 不同雜種優(yōu)勢群玉米莖稈維管束性狀比較分析[J]. 河北農(nóng)業(yè)大學學報，202 44（5）：14-20，56.

[29]趙 雪，周順利. 玉米抗莖倒伏能力相關性狀與評價研究進展[J]. 作物學報，2022，48（1）：15-26.4FC70124-2524-41CF-BEF5-849E79D3D36F