湯紫依，吳 倩，田盛野，何海葉，朱 晏，張慧娟，蔣 明

（臺州學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，浙江 臺州 318000）

0 引言

杜鵑屬（Rhododendron）是杜鵑花科（Ericaceae）最大的屬，全世界約有1200種，除非洲和南美洲外，其他洲均有分布。我國的杜鵑屬植物種類較為豐富，約有720種，主要分布在西南和華南地區(qū)［1-2］。浙江省的杜鵑屬植物種類相對較少，僅19種，它們具有觀賞或藥用價(jià)值，其中的云錦杜鵑（R.fortunei）、猴頭杜鵑（R.simiarum）和刺毛杜鵑（R.championiae）等具有很好的觀賞性，可用于庭院栽培或園林美化；羊躑躅（R.molle）、映山紅（R.simsii）和毛果杜鵑（R.seniavinii）等有一定的藥用價(jià)值，具有清熱解毒、化痰止咳和祛風(fēng)除濕的功效［3］。華頂杜鵑（R.huadingense）為浙江特有種，最早發(fā)現(xiàn)于天臺華頂山，后在寧波、金華、臨海等地發(fā)現(xiàn)新的分布點(diǎn)。華頂杜鵑生于海拔700 m以上的黃山松林或針闊葉混交林中，植株數(shù)量十分稀少，為國家Ⅱ級重點(diǎn)保護(hù)野生植物、浙江省重點(diǎn)保護(hù)野生植物和浙江省極小種群保護(hù)植物［3-5］。華頂杜鵑樹姿優(yōu)美，花先于葉，花色艷麗，花朵碩大，具有很好的觀賞價(jià)值和開發(fā)前景（如圖1所示）。

圖1 華頂杜鵑

葉綠體基因組為雙鏈環(huán)狀DNA，長度范圍為35～217 kb，綠色植物中葉綠體基因組是大小約為115～165 kb、有130個左右編碼的基因，包括tRNA、rRNA和蛋白質(zhì)編碼基因等［6］。葉綠體基因及其基因間隔區(qū)通常十分保守，經(jīng)常被用于植物系統(tǒng)發(fā)育分析或物種的鑒定，其中的ndhF、matK、atpB、rpl16、trnL內(nèi)含子、trnK內(nèi)含子、trnL-trnF和psbA-trnH等應(yīng)用較廣［7-8］。Givnish等［9］結(jié)合形態(tài)學(xué)和ndhF基因序列對澤藺花科（Rapateaceae）開展研究，明確了它們的進(jìn)化關(guān)系；Hao等［10］利用trnL-trnF理清了紅豆杉科（Taxaceae）、三尖杉科（Cephalotaxaceae）和羅漢松科（Podocarpaceae）植物之間的親緣關(guān)系；Feng 等［11］則借助psbA-trnH序列對酸漿屬（Physalis）植物進(jìn)行了分子鑒定。近年來，有關(guān)華頂杜鵑的研究主要集中在群落特征、種間關(guān)系和親緣關(guān)系等方面，與葉綠體基因間隔區(qū)相關(guān)的研究未見報(bào)道［12-14］。本文在克隆華頂杜鵑葉綠體psbA-trnH序列的基礎(chǔ)上進(jìn)行了序列分析和系統(tǒng)發(fā)育分析。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

華頂杜鵑葉片分別采自浙江省臨海市蘭遼（2019年）、天崗尖（2020年）、括蒼山（2021年）和天臺縣華頂山（2021年），將健康葉片置于自封袋帶回實(shí)驗(yàn)室。葉片先用大量的自來水沖洗，再用無菌水沖洗3～4次，晾干后置于-80℃超低溫冰箱中備用。

1.2 基因組DNA的提取

每個樣地取10個單株的葉片用于DNA的提取，基因組DNA的提取采用試劑盒法，“柱式植物基因組DNA提取試劑盒”購自生工生物工程（上海）股份有限公司，操作按照說明書步驟進(jìn)行。DNA用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，再稀釋成35 ng/μL的溶液，置于-20℃冰箱中備用。

1.3 psbA-trnH序列的克隆

用于擴(kuò)增psbA-trnH序列的上游和下游引物分別為5＇-CGCGCGTGATGAATTCACAATCC-3＇和5＇-GTTATGCATGAACGTAATGCTC-3＇，以DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。在20 μL體系中，分別加入2 μL 10×Taq緩沖液（含 Mg2+）、0.40 μL dNTP mix（10 mmol/L）、上/下游引物（20 μmol/L）各 0.45 μL，DNA 模板 0.8 μL（35 ng/μL）和 0.45 μLTaqDNA 聚合酶（2 U/μL），最后加入 ddH2O 15.45 μL。PCR 反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃ 5 min；95℃ 30 s，65℃ 45 s，72℃ 45 s，共32個循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測、連接、轉(zhuǎn)化和PCR驗(yàn)證后測序。

1.4 序列比對和系統(tǒng)發(fā)育分析

從 NCBI下載張家界杜鵑（R.zhangjiajieense）（HQ707040）、灰被杜鵑（R.tephropeplum）（JX989278）、銀葉杜鵑（R.argyrophyllum）（KM605490）、褐葉杜鵑（R.pseudociliipes）（KM605509）、糠秕杜鵑（R.sperabiloides）（KM605519）、柳條杜鵑（R.virgatum）（KM605526）、毛棉杜鵑（R.moulmainense）（KM605648）、彎果杜鵑（R.campylocarpum）（KM605669）、猩紅杜鵑（R.fulgens）（KM605680）、滇隱脈杜鵑（R.maddenii）（KM605702）、米杜鵑（R.tschonoskii）（LC612422）、天城杜鵑（R.amagianum）（LC631172）、羊躑躅（R.molle）（MH837814）和長蕊杜鵑（R.stamineum）（HQ707026）的psbA-trnH序列。采用Clustal X 1.81進(jìn)行多重比對，參數(shù)取默認(rèn)值；根據(jù)比對結(jié)果，利用GeneDoc生成序列比對圖；利用Mega 7.0計(jì)算遺傳距離，并生成系統(tǒng)發(fā)育樹，建樹方法采用鄰接法，自舉檢測次數(shù)為1000。

2 結(jié)果與分析

2.1 華頂杜鵑psbA-trnH序列信息

利用PCR法克隆了華頂杜鵑的psbA-trnH序列，電泳結(jié)果表明，PCR產(chǎn)物條帶清晰、單一，可用于連接、轉(zhuǎn)化和測序（如圖2所示）。測序結(jié)果表明：來自同一樣地10個單株的psbA-trnH序列完全一致，不同樣地樣品之間則存在一定的差異。多重比對結(jié)果表明：蘭遼樣品psbA-trnH的序列最長，為353 bp，而華頂、天崗尖和括蒼山樣品的序列長度一致，均為352 bp：蘭遼樣品psbA-trnH的GC值為29.2%，另三地樣品psbA-trnH的GC值為29.3%。蘭遼樣品與其他三地樣品的psbA-trnH僅存在1個堿基的差異，該變異發(fā)生在+260 bp處，蘭遼樣品在該位點(diǎn)有1個堿基T的插入（如圖3所示）。

圖2 華頂杜鵑psbA-trnH的克隆

圖3 華頂杜鵑樣品psbA-trnH序列的比對

2.2 杜鵑屬植物psbA-trnH的序列比對

如表1所示，18個杜鵑屬植物材料psbA-trnH的序列長度范圍為346～359 bp，天城杜鵑和米杜鵑的序列最長，均為359 bp；華頂杜鵑（蘭遼）、張家界杜鵑、彎果杜鵑和滇隱脈杜鵑次之，均為353 bp；柳條杜鵑的序列最短，僅346 bp。psbA-trnH序列的GC值大小為24.4%～29.3%，華頂杜鵑的GC值最大，長蕊杜鵑其次，為28.6%，張家界杜鵑的GC值最小，僅24.4%。4個樣地華頂杜鵑psbA-trnH的相似性最高，蘭遼樣品與天崗尖樣品、華頂樣品、括蒼山樣品的相似性均為99.7%，與長蕊杜鵑的相似性次之，為97.2%，與張家界杜鵑、銀葉杜鵑的相似性最低，均為91.5%。

表1 杜鵑屬植物psbA-trnH序列的特征

華頂杜鵑序列與其他杜鵑屬植物序列之間存在大量的插入、缺失、轉(zhuǎn)換和顛換現(xiàn)象。如長蕊杜鵑、毛棉杜鵑、米杜鵑、天城杜鵑和華頂杜鵑psbA-trnH的+7位為G，而其他杜鵑屬植物在該位點(diǎn)的堿基為A，發(fā)生了1次轉(zhuǎn)換；羊躑躅的+36位為G，而其他杜鵑屬序列為A，該位點(diǎn)也發(fā)生了轉(zhuǎn)換現(xiàn)象（如圖4所示）?；冶欢霹N和褐葉杜鵑在+55位的堿基為A，而其他杜鵑屬序列中為C，發(fā)生了顛換現(xiàn)象。滇隱脈杜鵑的+75位發(fā)生缺失，銀葉杜鵑、糠秕杜鵑、彎果杜鵑、猩紅杜鵑、張家界杜鵑的psbA-trnH序列在該位點(diǎn)為T，而其他杜鵑屬植物為G，發(fā)生了顛換現(xiàn)象。

圖4 杜鵑屬psbA-trnH序列的多重比對

2.3 系統(tǒng)發(fā)育分析

利用Mega軟件計(jì)算遺傳距離，結(jié)果表明：18個材料之間的平均遺傳距離為0.047，華頂杜鵑與張家界杜鵑的遺傳距離最大，為0.084，與柳條杜鵑和滇隱脈杜鵑的遺傳距離次之，為0.078；4個樣地華頂杜鵑材料之間及灰被杜鵑和褐葉杜鵑之間的遺傳關(guān)系最近，遺傳距離最小，值為0。利用鄰接法構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖5所示。從圖5中可以看出，15種杜鵑在發(fā)育樹上可分為6組：4個華頂杜鵑材料聚于組I，支持率達(dá)99.9%；馬銀花亞屬的長蕊杜鵑和毛棉杜鵑聚于組Ⅱ，支持率相對較低，為69.7%；映山紅亞屬的米杜鵑和天城杜鵑聚于組Ⅲ，支持率為94.4%；杜鵑亞屬的灰被杜鵑、褐葉杜鵑、柳條杜鵑和滇隱脈杜鵑聚于組Ⅳ，支持率為93.3%；羊躑躅亞屬的羊躑躅單獨(dú)聚于組V；常綠杜鵑亞屬的5種植物聚于組Ⅵ，支持率為95.3%。

圖5 基于psbA-trnH序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)生樹

3 討論

葉綠體基因及基因間隔區(qū)是植物系統(tǒng)發(fā)育分析和分子鑒定的重要DNA條形碼，與核基因條形碼相比，葉綠體DNA標(biāo)記為母性遺傳，進(jìn)化速率小，序列組成和長度相對保守，適合種以上水平的系統(tǒng)發(fā)生研究，近年來在譜系地理學(xué)、系統(tǒng)發(fā)育、親緣關(guān)系及遺傳多樣性等方面得到廣泛應(yīng)用［15］。psbA-trnH是最為常用的葉綠體DNA條形碼之一，該序列的長度變異大，變異位點(diǎn)多，在真雙子葉植物（eudicotyledons）、單子葉植物、裸子植物、蕨類植物和苔蘚植物中的長度范圍分別為152～851 bp、151～905 bp、283～1006 bp、167～547 bp和103～265 bp［16］。文中15種杜鵑屬植物psbA-trnH的長度變異不大，介于346～359 bp之間，而不同地理來源華頂杜鵑樣品的psbA-trnH長度則更為保守，僅存在1個堿基的差異。

psbA-trnH的變異豐富，可用于種及種級以上物種的鑒定。趙容等［17］以穿龍薯蕷（Dioscorea nipponica）及23種來自NCBI數(shù)據(jù)庫的薯蕷屬植物psbA-trnH序列為材料，發(fā)現(xiàn)利用該DNA條形碼可區(qū)分供試的24種植物。劉濤等［18］利用psbA-trnH對滇重樓（Paris polyphyllavar.yunnanensis）及其同屬物種進(jìn)行鑒定，表明該序列可用于分辯這些物種，并且有較好的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性。Loera-Sánchez等［19］研究表明：psbA-trnH可用于區(qū)分5個供試豆科（Leguminosae）牧草和3種飼用牧草材料，但它不能正確區(qū)分羊茅屬（Festuca）、黑麥草屬（Lolium）和霞禾屬（Poa）牧草。本文實(shí)驗(yàn)中利用psbA-trnH序列可將華頂杜鵑和其他杜鵑屬植物區(qū)分開，但該序列不能區(qū)分灰被杜鵑和褐葉杜鵑，因?yàn)樗鼈兊男蛄虚L度和堿基組成完全一致，需要其他DNA條形碼解決這一問題。

4 結(jié)語

本文以珍稀瀕危植物華頂杜鵑的葉片DNA為材料，在克隆葉綠體基因組psbA-trnH序列的基礎(chǔ)上，利用生物信息學(xué)手段分析它的序列特征，明確了華頂杜鵑與其他杜鵑屬植物之間系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，為后續(xù)進(jìn)一步開展華頂杜鵑的遺傳多樣性研究奠定了基礎(chǔ)。