韓 祎，崔大慶,2,*，李紀(jì)元，劉志博,4,*

1.中國原子能科學(xué)研究院 放射化學(xué)研究所，北京 102413；2.斯德哥爾摩大學(xué) 材料與環(huán)境化學(xué)系，瑞典 SE-106 91；3.北京大學(xué) 化學(xué)與分子工程學(xué)院，北京 100871；4.北京大學(xué)-清華大學(xué)生命聯(lián)合中心，北京 100871

中子俘獲治療(neutron capture therapy, NCT)是一種二元的、分子靶向的放射治療法，對局部侵襲性惡性腫瘤如黑色素瘤、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤和復(fù)發(fā)性頭頸部腫瘤提供了良好的腫瘤控制治療方案。它的原理是利用可以與中子發(fā)生俘獲反應(yīng)的核素，在反應(yīng)后放出射線，從而殺死腫瘤細(xì)胞而使患者生存期得以延長，這促進(jìn)了NCT的發(fā)展和臨床應(yīng)用。鑭系元素Gd因其在4f殼層[1]有7個未配對電子，所以有著非常強的弛豫效應(yīng)和順磁特性。在穩(wěn)定同位素中，157Gd(天然豐度15.7%),有著最大的反應(yīng)截面σ值(254 000 b,1 b=10-28m2)，在和中子發(fā)生俘獲反應(yīng)后，放出1 330 keV高能γ射線和低能電子。157Gd的高能γ射線輻射范圍較廣，穿透力強，可損傷腫瘤細(xì)胞，抑制腫瘤生長[2-3]。然而，由于釓發(fā)射的二次粒子譜的復(fù)雜性，包括瞬發(fā)γ射線、內(nèi)轉(zhuǎn)換電子、X射線和俄歇電子，限制了這種治療[4]的選擇性。近年來，人們通過對釓攜帶劑不同的修飾來提高GdNCT[5]的靶向性。

1 GdNCT原理

放射療法主要利用電離輻射產(chǎn)生的生物效應(yīng)，使腫瘤細(xì)胞膜上的蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)變性失活，造成細(xì)胞凋亡壞死。細(xì)胞死亡后釋放的抗原又可以激發(fā)機體免疫反應(yīng)，起到類似原位腫瘤疫苗的效果[6]，而其中內(nèi)照射療法則是將放射源引入體內(nèi)，盡可能進(jìn)入腫瘤內(nèi)或者貼近腫瘤，有效地殺死腫瘤細(xì)胞。

GdNCT作為新型內(nèi)照射療法的一種，不僅有著非常強的放射生物學(xué)效應(yīng)(relative biologi-cal effectiveness, RBE)，還有著高于傳統(tǒng)放射療法的靶向性。Gd元素有七種穩(wěn)定同位素，包括152Gd(0.205%)、154Gd(2.23%) 、155Gd(15.10%)、156Gd(20.60%)、157Gd(15.70%)、158Gd(24.50%)和160Gd(21.60%)[6]。在這些核素中，157Gd和155Gd具有最大的中子反應(yīng)截面，分別為25.4萬巴和6.08萬巴，是硼(10B)的66倍和16倍。Gd在俘獲中子反應(yīng)后的作用產(chǎn)物分別是高能γ射線、內(nèi)轉(zhuǎn)換(internal conversion, IC)電子、X射線和俄歇電子。γ射線和IC電子的平均能量分別約為1 330 keV和66.5 keV，它們的路徑長度分別是幾厘米和幾毫米。俄歇電子是高傳能線密度(linear energy transfer, LET)的低能電子，它在水溶液中的路徑長度只有幾個納米，其RBE效應(yīng)與γ射線相比，俄歇電子引起的脫氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid, DNA)損傷是其5～10倍。但是以157Gd為例，由于俄歇電子電離輻射局限于分子尺寸，即5～40 nm，所以為了提高GdNCT對DNA的破壞性，在腫瘤細(xì)胞中，157Gd必須盡可能靠近細(xì)胞核。具體反應(yīng)過程如圖1所示[7]。

圖1 157Gd的中子俘獲反應(yīng)示意圖[7]Fig.1 Schematic diagram of neutron capture reaction of 157Gd[7]

2 GdNCT優(yōu)勢和局限性

為了進(jìn)行準(zhǔn)確的治療，許多醫(yī)學(xué)成像方法如計算機斷層成像(computer tomography, CT)、正電子發(fā)射斷層顯像(polyethylene terephthalate, PET)[8]、熒光成像(fluorescence imag-ine, FI)[9]、核磁共振成像(magnetic resonance imaging, MRI)[10]和光聲成像(photoacoustic imaging, PAI)均被應(yīng)用于聯(lián)合治療。特別是MRI，由于其深穿透性、無侵襲性、無電離輻射累積及軟組織高分辨率，是目前臨床廣泛應(yīng)用的診斷技術(shù)。

為了進(jìn)行準(zhǔn)確的治療，許多醫(yī)學(xué)成像方法如計算機斷層成像(computer tomography, CT)、正電子發(fā)射斷層顯像(polyethylene terephthalate, PET)[8]、熒光成像(fluorescence imag-ine, FI)[9]、核磁共振成像(magnetic resonanceimaging, MRI)[10]和光聲成像(photoacoustic imaging, PAI)均被應(yīng)用于聯(lián)合治療。特別是MRI，由于其深穿透性、無侵襲性、無電離輻射累積及軟組織高分辨率，是目前臨床廣泛應(yīng)用的診斷技術(shù)。

在MRI掃描過程中，掃描儀會發(fā)射出一個射頻(radio frequency, RF)脈沖，導(dǎo)致一些元素比如氫質(zhì)子發(fā)生激勵而產(chǎn)生磁共振現(xiàn)象。弛豫是自旋釋放從射頻脈沖接收到能量的過程。這一過程所需的時間就是弛豫時間，弛豫時間分為自旋-晶格弛豫時間又稱為縱向弛豫時間(T1)，另一種是自旋-自旋弛豫時間又稱為橫向弛豫時間(T2)，它們的值在很大程度上取決于化學(xué)環(huán)境和原子核。

Gd在所有元素中具有最大的純自旋磁矩，使其在醫(yī)學(xué)成像上有著突出的物理性質(zhì)。Gd(Ⅲ)螯合物是T1最常見的臨床MRI對比劑[2,10]。與其他T1對比劑相比，Gd螯合劑可以通過降低T1在組織中的弛豫常數(shù)來提高信噪比(signal noise ratio, SNR)，即Gd螯合劑縮短了氫質(zhì)子的縱向弛豫時間，從而獲得了明顯的成像對比效果。

盡管Gd在醫(yī)學(xué)成像中具有突出的物理性質(zhì)，但Gd基對比劑(gadolinium based contrast agency, GBCA)在腦內(nèi)沉積和滯留，在臨床應(yīng)用中帶來了關(guān)鍵的安全問題。此外，γ射線的放射生物學(xué)效應(yīng)(relative biological effectiveness, RBE)與硼中子俘獲治療(BNCT)產(chǎn)生的α粒子的RBE相比不足，是GdNCT的另一個不可改變的缺點。在過去的幾十年里，人們在如何提高釓釋放劑的選擇性和降低其毒性這一領(lǐng)域做出了許多努力。

3 早期釓攜帶劑的發(fā)展

使用Gd螯合物作為NCT治療的最早報道，與商用MRI對比劑有關(guān)。Brugger研究組[11]第一個報道了Gd螯合物作為NCT釓攜帶劑應(yīng)用。采用釓-二乙基三胺五乙酸(gadolinium diethylenetriaminepentaacetic acid, Gd-DTPA)和釓-1，4，7四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-四羧基(Gd-1,4,7,10-tetraazacyclododecane-N,N′,N,N′-tetraacetic acid, Gd-DOTA)(圖2)通過靜脈注射治療小鼠腦腫瘤。實驗證明，這些Gd攜帶劑可明顯濃聚在腦腫瘤組織，達(dá)到每克腫瘤組織含Gd 300 μg。使用Gd-乙二胺四雙亞甲基膦(gadoterate ethylenediaminetetramethylene phosphonic acid, Gd-EDTMP)可將此濃度提高至800 μg，并且腫瘤組織與正常組織在Gd的攝取量上顯示極大的差別。對于含釓螯合物Gd-DTPA另一種相關(guān)動物實驗使用的是大鼠延森肉瘤模型[12]。大鼠瘤內(nèi)注射Gd-DTPA后，瘤內(nèi)Gd的質(zhì)量分?jǐn)?shù)約為13 750×10-6，中子照射治療后對腫瘤的殺傷效果顯著增強(腫瘤生長下降至腫瘤完全消退約80%)。神田公司[12]在一份簡短的通訊中也報道了在新西蘭大白兔左股動脈分支連續(xù)注射Gd-DTPA的實驗結(jié)果，雖然Gd含量在腫瘤和其相鄰正常組織間的分布沒有差異，但是與對照組相比，注射含Gd藥物后的腫瘤在治療后第16—23 d內(nèi)生長明顯受到抑制。最近，Hosmane等[13]觀察到9L腦瘤大鼠靜脈注射Gd-DTPA后，實驗組平均生存(33.5±3.0) d，而對照組平均生存(16.4±0.6) d，GdNCT后的大鼠存活時間顯著延長。

圖2 簡單157Gd螯合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)示意圖[11]Fig.2 Chemical structures of gadolinium-based chelate complexes[11]

Gd-BOPTA(圖3)是另一種臨床使用的Gd MRI對比劑[14-15]，實驗采用四組大鼠腫瘤模型，分別注射相同劑量的Gd-BOPTA和Gd-DTPA。中子照射治療后，明顯發(fā)現(xiàn)Gd-BOPTA組的腫瘤生長緩慢。Gd-BOPTA的治療效果強于Gd-DTPA的原因可能是：腫瘤對Gd-BOPTA選擇性攝取量更高；Gd-BOPTA與白蛋白的結(jié)合力較弱，增加了Gd在腫瘤中的滯留；所以Gd-BOPTA在當(dāng)時被認(rèn)為是一種較有效的釓攜帶劑。

圖3 Gd-BOPTA化學(xué)結(jié)構(gòu)示意圖[14]Fig.3 Chemical structures of Gd-BOPTA[14]

2010年，Rendina課題組[16]報道了第一個通過鉑配合物將Gd接近腫瘤細(xì)胞核的例子。他們提出了一種新的Pt-Gd復(fù)合物(圖4)，通過功能化DTPA配體連接，可以有效地靶向腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞核并以插入方式結(jié)合DNA。他們認(rèn)為，因為PtDTPA較高的腫瘤細(xì)胞攝取率，從而使結(jié)合的Gd盡可能地接近腫瘤細(xì)胞DNA以充分利用GdNCT產(chǎn)生的俄歇電子RBE效應(yīng)[12]。

圖4 連接兩個{PtⅡ (terpy)}(terpy=2,2′∶6′，2′-terpyridine) PtDTPA功能化的Pt-Gd復(fù)合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)[16]Fig.4 Chemical structure of the functionalized gadopentetate dimeglumine ligand linked to two {PtⅡ (terpy)} (terpy=2,2′∶6′,2′-terpyridine) PtDTPA[16]

4 釓攜帶劑研究現(xiàn)狀

為提高腫瘤對釓攜帶劑的攝取率，現(xiàn)有通過構(gòu)建葉酸受體[5]適配體、具有核穿透性的RGD(GRGDNP, RGD)肽[17]和腫瘤微環(huán)境(tumor microenvironment, TME)響應(yīng)結(jié)構(gòu)等提高其靶向性[2]；通過脂質(zhì)體包裹的釓化合物也被用來延長其在體內(nèi)的循環(huán)時間[18-19]。此外，其他材料如低密度脂蛋白[20]、殼聚糖[21]、碳基納米結(jié)構(gòu)[22]和聚合物基結(jié)構(gòu)[23]已被應(yīng)用于增強GdNCT的治療效果。

4.1 釓-硼中子俘獲治療

將硼中子俘獲治療(BNCT)與釓中子俘獲治療(GdNCT)相結(jié)合形成新的釓-硼中子俘獲治療(GdBNCT)方法顯然可以彌補上述釓攜帶劑不足。兩種不同的二次輻射模式的整合可以帶來特殊的治療效果。有兩種可能的策略：第一種策略是同時使用兩種NCT攜帶劑，一種攜帶10B，另一種攜帶157Gd；第二種策略是開發(fā)同時含有10B和157Gd化合物的中子俘獲治療藥物。Crich課題組[24]開發(fā)了一種基于聚(乳酸-co-乙醇酸)(poly(lactic-co-glycolic acid)，PLGA)和硼化姜黃素(boronated curcumin，圖5)的治療平臺。

圖5 葉酸偶聯(lián)PLGA RbCur/Gd納米顆粒(PLGA-NP-Folate)示意圖[24]Fig.5 Schematic representation of folate conjugated PLGA RbCur/Gd nanoparticles(PLGA-NP-Folate)[24]

如體外實驗所示，觀察到該聯(lián)合方法明顯改善了腫瘤的治療效果。與臨床使用的硼攜帶劑硼苯丙氨酸(L-para-boronophenylalanine, BPA)相比，其腫瘤硼濃度含量更高(圖6)[24]。對于第一個策略，Icten等[25]利用硼酸釓(gadolinium boron oxide, GdBO3)和Fe3O4的生物偶聯(lián)來實現(xiàn)GdBNCT的治療。其以Fe3O4、硼砂或硼酸和三價釓鹽為原料，水熱法制備納米復(fù)合材料，然后用檸檬酸和異硫氰酸熒光素?fù)诫s的二氧化硅進(jìn)行生物偶聯(lián)，最后用葉酸處理。其10B和157Gd的含量分別約為每微克1.8×1014和1.2×1014個原子。并且在HeLa和A549細(xì)胞上通過熒光顯微鏡和細(xì)胞流式儀，都證明了葉酸作為靶點的優(yōu)秀靶向性。各項實驗結(jié)果都證明GdBO3和Fe3O4生物偶聯(lián)物是可用于靶向治療、熒光成像和核磁共振成像的藥物。

■——PLGA-NP-Ctrl，●——PLGA-NP-Folate，▲——BPA圖6 在37 ℃下增加BPA濃度(10～500 μmol/L硼)孵育3 h或PLGA-NP-Ctrl或PLGA-NP-Folate(28～220 μmol/L硼)孵育6 h時IGROV-1細(xì)胞中的硼內(nèi)化情況[24]Fig.6 Boron internalization in IGROV-1 cells on incubation in the presence of increasing BPA concentrations (10-500 μmol/L boron) for 3 h at 37 ℃ or with PLGA-NP-Ctrl or PLGA-NP-Folate(28-220 μmol/L boron) for 6 h at 37 ℃[24]

4.2 釓藥物的多種構(gòu)型

脂質(zhì)體因其生物相容性、長循環(huán)特性和穩(wěn)定體內(nèi)載物的能力，在藥物輸送系統(tǒng)中具有重要意義。脂質(zhì)體包裹的釓攜帶劑可以克服釓螯合物遞送的各種困難，并獲得更好的治療結(jié)果。Langguth課題組[26]研究了脂質(zhì)體Gd-DTPA的抗腫瘤療效；脂質(zhì)體大小約為136～152 nm，這樣的尺寸避免了Gd-DTPA的過早釋放；1 h后，大約50%的Gd-DTPA仍包裹在脂質(zhì)體中。Ramaldes課題組[19]開發(fā)了具有放射性標(biāo)記的159Gd-DTPA-BMA的脂質(zhì)體(圖7)，他們發(fā)現(xiàn)該脂質(zhì)體的細(xì)胞毒性大約是游離的Gd-DTPA-BMA的1 170倍。

圖7 脂質(zhì)體樣品中159Gd的γ譜[19]Fig.7 Gamma spectrum of 159Gd in liposome sample[19]

Fukumori課題組[21]利用戊二醛作為交聯(lián)劑，通過乳液法制備了高水溶性Gd-DTPA殼聚糖微球(CMS-Gd-DTPA)，用于中子俘獲治療。紅外光譜表明，殼聚糖與Gd-DTPA之間的靜電相互作用加速了富釓殼聚糖微球的形成。CMS-Gd-DTPA中位直徑為11.7 μm，含有11.6%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的釓，可在瘤內(nèi)注射后用于GdNCT。與單獨Gd-DTPA相比，CMS-Gd-DTPA的釓體外釋放明顯延遲(圖8)。

圖8 CMS-Gd-DTPA和10 mL GST交聯(lián)后的Gd體外釋放實驗(37 ℃，磷酸鹽緩沖溶液(PBS，pH=7.4)，Gd質(zhì)量分?jǐn)?shù)11.6%，平均粒徑11.7 μm)[21]Fig.8 In vitro release profile of gadolinium from CMS-Gd-DTPA cross-linked with 10 mL GST having 11.6% of gadolinium and 11.7 μm of the mass median diameter in isotonic phosphate buffer solution(pH=7.4) at 37 ℃[21]

金屬富勒烯籠中含有一個或多個金屬原子，是一類具有不同尋常的電子和磁性的新型材料。長崎課題組[22]發(fā)現(xiàn)構(gòu)建Gd@C82可以像溶解C60等富勒烯一樣，加入PEG-b-PAMA使其易溶于水，形成一個透明、復(fù)雜的直徑約20～30 nm的軛合物(圖9)。中子輻照用Gd@C82-PEG-b-PAMA納米顆粒孵育colon-26腺癌細(xì)胞后，該腫瘤細(xì)胞絕大部分被殺死，并且本研究中的含Gd納米粒子(GdNPs)在細(xì)胞毒性實驗中，細(xì)胞存活率與對照組相比沒有差別，比以前報道的釓攜帶劑毒性要小得多[23]。

圖9 GdNPs制備工藝示意圖[22]Fig.9 Schematic of the preparation process of GdNPs[22]

4.3 刺激響應(yīng)型藥物遞送

磷酸鈣(calcium phosphate tribasic, CaP)納米顆粒作為人類骨骼和牙齒的無機礦物，具有較高的生物相容性和良好的生物降解性，因此其在醫(yī)療領(lǐng)域的應(yīng)用越來越受到關(guān)注。它不容易被微生物降解，但是在pH=7.4時可適度溶解，在pH≤6可逐漸溶解，所以CaP納米顆粒在遞送到細(xì)胞時仍可保持完整，而細(xì)胞進(jìn)入內(nèi)溶酶體后由于pH降低所以迅速溶解，這使得它在藥物遞送方面具有極大的潛力。Kataoka課題組[27]構(gòu)建了磷酸鈣膠束與聚陰離子嵌段共聚物雜交，并與臨床MRI對比劑Gd-DTPA/CaP相結(jié)合(圖10)。細(xì)胞毒性實驗中Gd-DTPA/CaP在100 μmol/L下對癌細(xì)胞無毒，而在此濃度下，超過50%的癌細(xì)胞在熱中子照射后被殺死。此外，由于Gd-DTPA/CaP在腫瘤中的攝取量顯著增加，因此可通過MRI來精確定位腫瘤位置(圖11)。

圖10 Gd-DTPA/CaP復(fù)合膠束靶向腫瘤GdNCT方案[27]Fig.10 Scheme of Gd-DTPA/CaP hybrid micelles targeting tumors for GdNCT[27]

○——Gd-DTPA/CaP+熱中子照射，□——Gd-DTPA+熱中子照射，△——Gd-DTPA/CaP，×——Gd-DTPA圖11 Gd-DTPA/CaP在體內(nèi)MR成像引導(dǎo)下的中子俘獲治療[27]Fig.11 In vivo MR imaging-guided neutron capture therapy with Gd-DTPA/CaP[27]

4.4 活性導(dǎo)向性藥物

環(huán)狀RGDs(cRGDs)是一種含有一系列精氨酸(Arg)-甘氨酸(Gly)-天冬氨酸(Asp)作為環(huán)狀成分的三肽，它通過結(jié)合αvβ3和αvβ5整合素來靶向腫瘤，這些整合素在腫瘤血管生成位點并在腫瘤細(xì)胞中過表達(dá)。RGDs之所以吸引人是因為它們比抗體小，容易通過化學(xué)方法大規(guī)模合成，具有低毒性和低免疫原性，可以很容易地偶聯(lián)到納米系統(tǒng)上達(dá)到成像和治療的目的。Lee課題組[17]用環(huán)狀RGDs作為腫瘤靶向配體，包覆超微氧化釓納米顆粒(GNPs，粒徑為1.0～2.5 nm)(圖12)。涂層中使用了五種商用cRGD。通過一鍋法合成了cRGD包覆的GNPs (cRGD-GNPs)。它們的縱向水質(zhì)子弛豫度r1值為10.0～18.7/(s·mmol/L),r2/r1值為1.4～1.7(r2為橫向水質(zhì)子弛豫度)，是Gd螯合物的3～5倍。使用制備五種cRGD-GNPs樣品溶液中的一種，在肝臟腫瘤模型小鼠上進(jìn)行T1MRI成像，證實了cRGD-GNPs的腫瘤靶向性[17]。靜脈注射該溶液后對感興趣區(qū)域(region of interested, ROI)的信噪比(SNR)進(jìn)行研究，如圖13，T1MRI圖像中觀察到肝臟腫瘤區(qū)攝取量約是正常部位的3倍。這些結(jié)果表明，cRGD-GNPs是潛在的具有腫瘤靶向性的診療一體化藥物。

圖12 cRGD1-GNP表面包被結(jié)構(gòu)[17]Fig.12 Surface-coating structure of the cRGD1-GNP[17]

Pre代表靜脈注射后成像圖13 肝臟正常部分、腫瘤部分、壞死部分ROI的信噪比隨時間變化圖[17]Fig.13 Plots of SNRs of ROIs in the normal part, the tumor part, and the necrotic part of the liver as a function of time[17]

5 結(jié) 論

Gd在NCT中的應(yīng)用因其具有較高的中子截面和良好的MRI成像而倍受關(guān)注。雖然GdNCT早在多年前就被提出，但由于缺乏具有較高腫瘤選擇性的釓攜帶劑，使GdNCT發(fā)展滯后。為了充分利用俄歇電子的RBE效應(yīng)，需要合成能夠盡可能靠近細(xì)胞DNA的新型釓攜帶劑?，F(xiàn)有釓攜帶劑的報道也為我們解決GdNCT問題提供一些發(fā)展思路，例如使用靶向性載體，可以大大提高腫瘤對釓攜帶劑的攝取，延長其滯留時間；利用釓的治療特性，通過測量局部Gd濃度來優(yōu)化中子輻照時間和傳遞的輻射劑量；可以聯(lián)合應(yīng)用BNCT和GdNCT，這樣可避免腫瘤復(fù)發(fā)的幾率，提高治療腫瘤的效果。