姚軼俊, 李枝芳, 王 博, 王立峰, 鞠興榮

(江南大學(xué)食品學(xué)院1，無(wú)錫 214122) (南京財(cái)經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院；江蘇省現(xiàn)代糧食流通與安全協(xié)同創(chuàng)新中心2，南京 210023)

中國(guó)的雜糧總產(chǎn)量占世界粗糧總產(chǎn)量的17.1%，薏米、赤小豆、青稞、蕎麥?zhǔn)?種具有我國(guó)特色的雜糧。薏米殼提取物已被證明其酚類成分部分與抗氧化和抗炎活性有關(guān)，薏米有可能成為一種針對(duì)慢性疾病的功能性食品[3]。德國(guó)營(yíng)養(yǎng)協(xié)會(huì)最近證明全谷類食物可以降低低密度脂蛋白膽固醇，能減少Ⅱ型糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)，在一定程度上減少了成年人肥胖的風(fēng)險(xiǎn)，但針對(duì)減少代謝綜合征的風(fēng)險(xiǎn)證據(jù)不足[4]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究證明，赤小豆具有抗氧化[5]、降血糖[6]、降血脂[7]的作用。青稞中含有多種活性物質(zhì)，如酚類化合物、黃酮類化合物，β-葡聚糖、γ-氨基丁酸等[8]。洛桑旦達(dá)等[9]對(duì)我國(guó)75個(gè)品種青稞中的β-葡聚糖含量進(jìn)行測(cè)定，得到不同品種β-葡聚糖的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5.25%，質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高的品種達(dá)8.62%，相較于國(guó)外上百個(gè)品種的β-葡聚糖含量測(cè)定結(jié)果，西藏青稞的β-葡聚糖含量最高。蕎麥?zhǔn)且环N營(yíng)養(yǎng)豐富、藥用價(jià)值極高的植物。甜蕎蛋白是甜蕎麥中的主要營(yíng)養(yǎng)成分之一，同時(shí)也是目前甜蕎麥的一個(gè)重要的研究方向[10]。蘆丁是苦蕎中含量最豐富的多酚類物質(zhì)之一，蘆丁具有降低毛細(xì)血管脆性，改善微循環(huán)的作用，在臨床上被用于糖尿病和高血壓的輔助性治療?？嗍w麥中還包含了豐富的生物類黃酮、礦物質(zhì)、維生素、膳食纖維等活性物質(zhì)，其中膳食纖維質(zhì)量分?jǐn)?shù)高達(dá)1.6%，是普通米面的8倍多[11]。

近年來(lái)，相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)雜糧具有良好的降脂功能，其中含有的一些生物活性成分能有效改善脂質(zhì)代謝異常導(dǎo)致的相關(guān)疾病。因此研究人員開(kāi)始聚焦于谷物飲食對(duì)健康的影響[12]。相關(guān)研究表明，雜糧中富含的多酚類物質(zhì)可以通過(guò)調(diào)節(jié)機(jī)體脂質(zhì)代謝從而降低血脂，有效預(yù)防心血管疾病的發(fā)生[13]。此外，雜糧中膳食纖維的攝入有助于改善腸道菌群的構(gòu)成，其中益生菌的發(fā)酵會(huì)給人體帶來(lái)所必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。因此，本實(shí)驗(yàn)以薏米、赤小豆、青稞、蕎麥為原料，對(duì)其提取物中的可溶性總糖、蛋白質(zhì)、氨基酸、總酚、總黃酮含量進(jìn)行分析。并通過(guò)構(gòu)建高脂HepG2細(xì)胞模型，以TG、T-CHO、LDL-C、AST、ALT作為指標(biāo)，對(duì)其降脂功能進(jìn)行評(píng)價(jià)，進(jìn)一步明確幾種我國(guó)特色糧食作物的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，為肥胖人群的膳食提供一定的指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

薏米(遼寧5號(hào)Coixlachryma-jobiL.)、赤小豆(天津紅AbrusprecatoriusL.)、青稞(北青3號(hào)HordeumvulgareLinn. var. nudum Hook.f.)、蕎麥(大三棱FagopyrumesculentumMoench.)，當(dāng)季采收后在陰涼避光條件下儲(chǔ)藏，并在3個(gè)月內(nèi)使用。人體HepG2肝癌細(xì)胞株、DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、青霉素-鏈霉素溶液、0.25%胰蛋白酶消化液、脂肪酶測(cè)試盒 (A054-2)、甘油三酯(TG)測(cè)試盒 (A110-1)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)測(cè)試盒(A111-1)、總膽固醇(T-CHO)測(cè)試盒(A112-1)、GOT試劑盒(C010-2, 酶標(biāo)儀法)、GPT試劑盒(C009-2, 酶標(biāo)儀法)、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(A1933-5)、牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin)，試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

DFT-50A粉碎機(jī)，SHZ-82A水浴恒溫振蕩器，SpectraMax M2e多功能酶標(biāo)儀，K-360凱式定氮儀，TG16-WS臺(tái)式高速離心機(jī)，SN-210高壓滅菌鍋，ST-16 高速冷凍離心機(jī)，CIB-191C CO2培養(yǎng)箱，倒置生物顯微鏡，SJ-CJ-2FD生物超凈工作臺(tái)。

1.3 方法

1.3.1 雜糧提取物的制備

將薏米、赤小豆、青稞、蕎麥洗凈烘干，磨粉過(guò)60目篩，用紗布包裹并一同置于燒杯中，加入正己烷，料液比1∶4，水浴1 h，水浴溫度60 ℃，脫去多余的脂質(zhì)。取出紗布包，加入蒸餾水，料液比為1∶8，水浴4 h，水浴溫度70 ℃；取出紗布包，將水提物離心收取上清液，離心轉(zhuǎn)速為6 000 r/min，離心時(shí)間為10 min，重復(fù)離心2次；所取得的上清液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機(jī)溶劑，再經(jīng)冷凍干燥得到4種雜糧提取物粉末。

1.3.2 蒽酮比色法測(cè)定雜糧提取物的可溶性總糖含量

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：將葡萄糖在80 ℃的烘箱中烘至質(zhì)量恒定，取0.1 g定容至100 mL，再取出10 mL，定容至100 mL，即可得到0.1 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.6、0.8 mL，用蒸餾水定容到1 mL，再分別加入蒽酮試劑5 mL，沸水浴中加熱10 min，在620 nm波長(zhǎng)中進(jìn)行測(cè)定。以O(shè)D值為縱坐標(biāo)，葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液濃度為橫坐標(biāo)，作圖得到葡萄糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

4種雜糧可溶性總糖的提取及測(cè)定：分別準(zhǔn)確稱取0.1 g的薏米粉、赤小豆粉、青稞粉和蕎麥粉，并加入50 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為80%的乙醇，恒溫45 ℃加熱10 min，取其濾液1 mL，同時(shí)用蒸餾水做空白對(duì)照，冷卻后備用。測(cè)定4種雜糧中可溶性總糖的含量，計(jì)算公式為：

可溶性總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)(以葡萄糖計(jì))=p×稀釋倍數(shù)×10-4×100%

式中：p為從標(biāo)準(zhǔn)曲線中查得的糖質(zhì)量濃度/μg/mL；10-4為將μg/mL換成百分?jǐn)?shù)的系數(shù)。

1.3.3 雜糧提取物中蛋白質(zhì)及氨基酸含量的分析

蛋白質(zhì)含量測(cè)定參考GB 5009.5—2016。將4種雜糧用料理機(jī)進(jìn)行勻漿，放置于低溫冰箱中冷凍保存，使用時(shí)再將其解凍。準(zhǔn)確稱取一定量的樣品，精確到0.000 1 g，在水解管內(nèi)加入15 mL 6 mol/L鹽酸，加入新蒸餾的苯酚3滴，再將水解管放入冷凍劑中，冷凍5 min，在接到真空泵的抽氣管上，抽真空后充入高純氮?dú)猓貜?fù)3次后封口。將封好口的水解管放在110 ℃的恒溫干燥箱內(nèi)水解22 h，取出冷卻，過(guò)濾水解液轉(zhuǎn)移到50 mL容量瓶?jī)?nèi)，用去離子水定容。吸取1 mL濾液放入5 mL容量瓶?jī)?nèi)，在45 ℃的真空干燥器中干燥，殘留物用1 mL水溶解，再進(jìn)行干燥，重復(fù)2次最后蒸干后用1 mL pH 2.2的緩沖溶液溶解，供儀器測(cè)定用。準(zhǔn)確吸取0.2 mL混合氨基酸標(biāo)準(zhǔn)，用pH 2.2的緩沖液稀釋到5 mL，此標(biāo)準(zhǔn)稀釋濃度為5 nmol/50 μL，作為上機(jī)測(cè)定用的氨基酸標(biāo)準(zhǔn)，用氨基酸自動(dòng)分析儀以外標(biāo)法測(cè)定樣品測(cè)定液的氨基酸含量。

1.3.4 雜糧提取物的總酚及總黃酮含量測(cè)定

總酚測(cè)定：取4種雜糧各個(gè)階段提取物的凍干樣品0.1 g，溶于1 mL 80% 丙酮后，過(guò)0.45 μm的濾膜，用蒸餾水稀釋10倍后，加入1 mL的5倍稀釋的福林酚試劑混勻，反應(yīng)5 min后加入2 mL的15% Na2CO3溶液，用蒸餾水定容到10 mL，避光2 h，用酶標(biāo)儀測(cè)定760 nm下的吸光度。標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：稱取0.1 g的沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品，用蒸餾水定容于100 mL的容量瓶，然后從容量瓶中再取5 mL用蒸餾水定容到50 mL的容量瓶中。分別取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL的沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液(0.1 mg/mL)加入1 mL的5倍稀釋的福林酚試劑混勻，反應(yīng)5 min后加入2 mL的15% Na2CO3溶液，用蒸餾水定容到10 mL，避光2 h，用酶標(biāo)儀在96孔板上每孔150 μL測(cè)定760 nm下的吸光度。以濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程y=82.89x+0.044，R2=0.999?？偡雍恳悦靠宿裁椎韧跊](méi)食子酸(GAE)的毫克數(shù)表示[14]。

總黃酮測(cè)定：準(zhǔn)確稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品15 mg，用50%乙醇溶解并定容至50 mL，得到質(zhì)量濃度為0.3 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。取7支試管編號(hào)，分別按表1中所給的量加入各種試劑，并測(cè)定其吸光值。加入5% NaNO2溶液0.4 mL后，搖勻，放置6 min；加入10% Al(NO3)3溶液0.4 mL后，搖勻，放置6 min；加入5% NaOH溶液4 mL，再加入2.2 mL蒸餾水，搖勻，放置15 min。以0號(hào)試管為空白，于510 nm處測(cè)吸光值。以蘆丁的含量(mg/mL)為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[15]。

1.3.5 細(xì)胞培養(yǎng)

HepG2細(xì)胞培養(yǎng)在含8% 胎牛血清、50 units/mL青霉素和50 μg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液中，培養(yǎng)環(huán)境為37 ℃，5% CO2。

1.3.6 細(xì)胞毒性測(cè)試(MTT)

采用MTT法對(duì)薏米、赤小豆、青稞、蕎麥的提取物進(jìn)行細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)。將HepG2細(xì)胞以5 000～10 000 cells/孔的數(shù)量接種到96孔板中，每孔100 μL，邊緣用PBS填充，鋪好板后蓋上蓋子，十字搖勻，不要旋轉(zhuǎn)搖晃，于CO2培養(yǎng)箱(5% CO2、37 ℃)中培養(yǎng)24 h。將4種雜糧的消化產(chǎn)物用培養(yǎng)液溶解，配置成不同的梯度，換掉96孔板中的培養(yǎng)液，加入樣品液，不含樣品的培養(yǎng)液視為對(duì)照組。每孔100 μL，設(shè)5個(gè)重復(fù)。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，吸棄上清液，每孔加入120 μL MTT(0.1 mg/mL)溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)液體，每孔加入100 μL DMSO，置于搖床上低速振蕩10 min或置于培養(yǎng)箱中30 min，使結(jié)晶充分溶解。酶標(biāo)儀下檢測(cè)490 nm下各孔的吸光值[13]。實(shí)驗(yàn)中設(shè)凋零孔、對(duì)照孔及加藥孔。凋零孔：不含細(xì)胞的完全培養(yǎng)基、MTT、DMSO；對(duì)照孔：細(xì)胞懸液、藥物溶劑、MTT、DMSO；實(shí)驗(yàn)孔：細(xì)胞懸液、不同雜糧提取物、MTT、DMSO。

1.3.7 HepG2高脂細(xì)胞模型建立及降脂活性測(cè)定

蛋白吸附法配制油酸溶液：70 ℃振蕩水浴下將油酸溶于0.1 mmol/L NaOH中，配成 100 mmol/L 的儲(chǔ)存液；55 ℃振蕩水浴下將儲(chǔ)存液滴入10% BSA 的PBS溶液中，配成濃度5 mmol/L的使用液，過(guò)濾除菌，-20 ℃ 冷凍保存，使用前55 ℃水浴15 min并冷卻至室溫，用完全培養(yǎng)基稀釋至0.25 mmol/L。將 HepG2 細(xì)胞接種于6孔板，孵育24 h后取出，對(duì)照組加含8%～10% FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基，模型組加入含終濃度2.5 mmol/L油酸的8%～10% FBS高糖DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，高脂模型構(gòu)建完成[13,16]。

細(xì)胞經(jīng)分組培養(yǎng)后，分別加入4種雜糧提取物，并設(shè)置空白對(duì)照。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，吸除培養(yǎng)液，PBS輕柔洗滌3次，加入IP細(xì)胞裂解液，冰浴裂解細(xì)胞30 min，按照甘油三酯(TG)、總膽固醇(T-CHO)、低密度脂蛋白(LDL-C)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)和丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)試劑盒操作說(shuō)明測(cè)定細(xì)胞內(nèi)照甘油三酯(TG)、總膽固醇(T-CHO)、低密度脂蛋白(LDL-C)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)和丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)的含量。按照BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒操作說(shuō)明測(cè)定細(xì)胞中蛋白質(zhì)含量。用蛋白含量校準(zhǔn)細(xì)胞中甘油三酯(TG)含量。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，結(jié)果均表示為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差”，應(yīng)用GraphPad 7.0進(jìn)行圖形繪制，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

注：不同小寫字母表示相同指標(biāo)下4種雜糧差異顯著(P<0.05)，余同。圖1 薏米、赤小豆、青稞、蕎麥提取物中的蛋白質(zhì)及可溶性總糖含量

2 結(jié)果與分析

2.1 4種雜糧中蛋白質(zhì)及可溶性總糖含量的分析

薏米、赤小豆、青稞和蕎麥提取物中所含有的蛋白質(zhì)及可溶性總糖含量如圖1所示。其中赤小豆和青稞提取物中所含的可溶性總糖最高可達(dá)到39.43%和40.24%。赤小豆和青稞提取物中的可溶性總糖含量相當(dāng)，薏米提取物次之，蕎麥提取物最少。采用蒽酮比色法測(cè)定4種雜糧提取物中可溶性總糖的含量，利用強(qiáng)酸可使糖類脫水成糖醛，生成的糖醛或羥甲基糖醛與蒽酮脫水縮合，形成藍(lán)綠色的糖醛衍生物來(lái)測(cè)定[17]?？扇苄蕴侨缙咸烟窃谥参锏纳芷谥芯哂兄匾饔?。它不僅為植物的生長(zhǎng)發(fā)育提供能量和代謝中間產(chǎn)物，而且具有信號(hào)功能，它也是植物生長(zhǎng)發(fā)育和基因表達(dá)的重要調(diào)節(jié)因子[18]。從蛋白質(zhì)總量上來(lái)看，薏米和蕎麥提取物中的蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高，分別可以達(dá)到7.79% 和7.66%。青稞提取物中蛋白質(zhì)的含量次之，赤小豆提取物中含有的蛋白質(zhì)含量最低。有研究結(jié)果證明，赤小豆的礦物質(zhì)價(jià)值要比赤豆高，如赤小豆的鈣、鋅含量是赤豆的3.1倍和1.6倍，但赤小豆的粗蛋白含量比赤豆低13.95 g/100 g[19]。

2.2 4種雜糧提取物中氨基酸含量的分析

由表1可知，4種雜糧提取物中含有16種氨基酸，其中7種為必需氨基酸，9種為非必需氨基酸。其中蕎麥提取物中谷氨酸、天冬氨酸、絲氨酸、甘氨酸和精氨酸含量較高。青稞提取物中半胱氨酸、纈氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸的含量較高。赤小豆提取物中甲硫氨酸和賴氨酸的含量較高。薏米提取物中丙氨酸、亮氨酸和組氨酸的含量較高。谷氨酸是肌肉中最豐富的游離氨基酸，約占人體游離氨基酸總量的60%。谷氨酸被人體吸收后可以與血氨形成谷酰氨，能解除代謝過(guò)程中的氨毒害作用，因而能預(yù)防和治療肝損傷[20]。天冬氨酸參與鳥(niǎo)氨酸循環(huán)，促進(jìn)氧和二氧化碳生成尿素，降低血液中氮和二氧化碳的量，增強(qiáng)肝臟功能，消除疲勞。L-半胱氨酸是一種氨基酸類解毒藥，它參與細(xì)胞的還原過(guò)程和肝臟內(nèi)的磷脂代謝，有保護(hù)肝細(xì)胞不受損害，促進(jìn)肝臟功能恢復(fù)和旺盛的藥理效應(yīng)[21]。纈氨酸能促進(jìn)身體正常生長(zhǎng)，修復(fù)組織，調(diào)節(jié)血糖，并提供需要的能量[22]。蕎麥提取物中含量較多的氨基酸，如谷氨酸和天冬氨酸，對(duì)人體的肝臟有很好的保護(hù)作用。青稞提取物中富含的氨基酸，如半胱氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸等，可用于面團(tuán)改良劑、食品添加劑等。

Emebiri等[23]在研究谷物中天冬氨酸含量的遺傳變化率時(shí)發(fā)現(xiàn)92個(gè)品種的谷物中游離天冬氨酸含量為137～471 mg/kg。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，薏米和青稞提取物中天冬氨酸的含量為99.3、128.4 mg/kg，與其結(jié)果相較偏低，這可能是由于谷物品種的原因，日照時(shí)間、生長(zhǎng)周期、成熟度等都會(huì)影響，與國(guó)外品種在成分組成上可能略有差異。

表1 薏米、赤小豆、青稞蕎麥提取物中的氨基酸含量/g/100 g

2.3 4種雜糧提取物中總酚及總黃酮含量的分析

圖2結(jié)果表明，青稞提取物中的總酚含量最高可以達(dá)到84.24 mg GAE/100 g；薏米和赤小豆提取物中的總酚含量次之，為83.21、81.17 mg GAE/100 g；蕎麥提取物中的總酚含量最低68.54 mg GAE/100 g。因?yàn)槎喾拥姆恿u基結(jié)構(gòu)中的鄰位酚羥基很容易被氧化成醌類結(jié)構(gòu)，并在此過(guò)程中消化環(huán)境中的氧，同時(shí)捕捉活性氧等自由基，所以多酚含量的多少與其抗氧化能力成正比[24]。

圖2 薏米、赤小豆、青稞、蕎麥提取物中的總酚含量

圖3 薏米、赤小豆、青稞、蕎麥提取物中的總黃酮含量

如圖3所示，赤小豆提取物中總黃酮含量最高 (34.794 mg RE/100 g)。這可能與赤小豆的種皮有關(guān)。赤小豆種皮含有多種潛在生物活性的色素，包括多酚類物質(zhì)，如原花青素[25]。這也是赤小豆中總黃酮含量最高的原因。蕎麥提取物的總黃酮含量次之，為32.57 mg RE/100 g；薏米和青稞提取物中的總黃酮含量較少，分別為13.49 mg RE/100 g和7.81 mg RE/100 g。目前，類黃酮作為抗氧化劑和自由基清除劑被廣泛應(yīng)用。如王蘭等的研究表明，葛根異黃酮具有降血糖活性，能夠使糖尿病小鼠的抗氧化能力增強(qiáng)，改善糖尿病小鼠的糖脂代謝，對(duì)其有很好的保護(hù)作用[26]。

2.4 4種雜糧提取物對(duì)HepG2細(xì)胞毒性測(cè)試

很多研究證明雜糧具有一些潛在的功能，如抗氧化，抗肥胖和抗炎。然而，也有一些抗?fàn)I養(yǎng)因素可能產(chǎn)生某些不良反應(yīng)[27]。當(dāng)它們被濃縮時(shí)，可能引起免疫反應(yīng)并被代謝生成有毒產(chǎn)物[28]。因此，有必要評(píng)估其對(duì)HepG2細(xì)胞的安全性。如圖4所示，隨著青稞提取物濃度的升高HepG2細(xì)胞的存活率在逐漸下降。當(dāng)從青稞提取物的濃度高于1 000 μg /mL，HepG2細(xì)胞生存開(kāi)始低于90%，這個(gè)結(jié)果表明添加物的劑量對(duì)于維持HepG2細(xì)胞處于一個(gè)良好的生存狀態(tài)十分重要的。Rao等[29]證明麥片甲醇提取物濃度為500 μg/mL時(shí)對(duì)人類結(jié)腸癌細(xì)胞株沒(méi)有表現(xiàn)出任何明顯的細(xì)胞毒作用。然而，本實(shí)驗(yàn)采用了一種更加簡(jiǎn)單安全的方法，水提取，使提取物具有更高的安全性。在陳超等的研究中用丙酮提取脫脂后的薏米當(dāng)其質(zhì)量濃度達(dá)到25～500 μg/mL時(shí)，HepG2細(xì)胞的活力就開(kāi)始明顯地被抑制[30]。但是采用水提法提取的組分當(dāng)其濃度達(dá)到5 mg/mL時(shí)，HepG2細(xì)胞顯示仍然沒(méi)有毒性。因此鑒于提取方法，當(dāng)4種雜糧提取物質(zhì)量濃度為1 000 μg/mL時(shí)，對(duì)于HepG2不產(chǎn)生細(xì)胞毒性。

圖4 薏米、赤小豆、青稞、蕎麥的提取物對(duì)細(xì)胞活力的影響

2.5 4種雜糧提取物對(duì)HepG2高脂細(xì)胞內(nèi)TG、T-CHO、LDL-C、AST和ALT水平的影響

油酸誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞內(nèi)的TG和T-CHO濃度較正常的HepG2細(xì)胞明顯升高，如圖5所示。油酸誘導(dǎo)后，細(xì)胞內(nèi)TG和T-CHO含量明顯升高，4種種雜糧提取物的添加均有效地降低了其TG和T-CHO的濃度。與沒(méi)有添加雜糧提取物的高脂細(xì)胞相比較，薏米提取物、赤小豆提取物、青稞提取物和蕎麥提取物分別使高脂細(xì)胞內(nèi)的甘油三酯的含量降低了36.5%、24.4%、34.4%和16.9%。在針對(duì)降低細(xì)胞內(nèi)甘油三酯的功能上來(lái)看薏米和青稞的提取物的效果更為突出。高脂細(xì)胞內(nèi)T-CHO的含量在添加了薏米、赤小豆、青稞、蕎麥提取物后，T-CHO的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別降低了11.4%、11.5%、21.4%、5.9%。其中綜合來(lái)看青稞提取物的作用效果最為顯著。青稞提取物處理后細(xì)胞內(nèi)TG和T-CHO含量較油酸對(duì)照組明顯降低。結(jié)果表明，與未加1 mg/mL青稞提取物的高脂血癥HepG2細(xì)胞相比，細(xì)胞內(nèi)TG質(zhì)量分?jǐn)?shù)降低34.4%，T-CHO質(zhì)量分?jǐn)?shù)降低21.4%。Veronika等[31]研究了青稞中的β-葡聚糖對(duì)小鼠膽固醇代謝的影響。結(jié)果表明，經(jīng)β-葡聚糖處理后，TG降低24.14%，T-CHO降低15.53%。相比之下，實(shí)驗(yàn)中從青稞中提取的混合物比單一的β-葡聚糖效果更好。青稞提取物中含有豐富的多酚類物質(zhì)，能有效降低甘油三酯的含量。

圖5 薏米、赤小豆、青稞、蕎麥的提取物對(duì)經(jīng)過(guò)油酸處理的HepG2細(xì)胞內(nèi)甘油三酯和總膽固醇的影響

圖6 薏米、赤小豆、青稞、蕎麥的提取物對(duì)經(jīng)過(guò)油酸處理的HepG2細(xì)胞內(nèi)低密度脂蛋白的影響

如圖6所示，經(jīng)油酸處理后，低密度脂蛋白的含量顯著升高，是對(duì)照組含量的約2.3倍，在加入4種雜糧的提取物后，其含量都有明顯的降低，可以觀察到青稞提取物的效果尤為顯著，經(jīng)青稞提取物處理后LDL-C降低了51.8%。薏米提取物、赤小豆提取物和蕎麥提取物的添加分別使高脂細(xì)胞中低密度脂蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)降低了21.8%、26.1%和10.6%。

天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶和丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶是肝臟健康的指標(biāo)。只要有1%的肝細(xì)胞壞死，血液中的酶活性就會(huì)增加1倍，所以尤其是丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶是急性肝細(xì)胞損傷的敏感標(biāo)志物。從圖7可以看出，青稞和蕎麥的提取物可以明顯地降低AST的含量，經(jīng)過(guò)青稞和蕎麥提取物處理后AST分別下降了21%和16.8%，而薏米和赤小豆提取物對(duì)AST的效果并不明顯。細(xì)胞內(nèi)ALT的含量在經(jīng)油酸誘導(dǎo)后有極其顯著的上升，4種雜糧的提取物均有效地降低了其含量，與沒(méi)有添加雜糧提取物的細(xì)胞相比，添加了薏米、赤小豆、青稞和蕎麥提取物的細(xì)胞中ALT的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別降低了35.2%、28.1%、51.5%和44.3%。其中青稞提取物的效果更為突出，有研究表明酚酸是青稞中的主要酚類物質(zhì)，大部分集中在麩皮和胚芽，蘆丁、阿魏酸、p-香豆酸和表兒茶素是青稞總多酚提取物中的主要成分，可增強(qiáng)小鼠體內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)以及棕色脂肪相關(guān)基因表達(dá)[32]。青稞對(duì)細(xì)胞內(nèi)AST和ALT降低有顯著的作用，進(jìn)而對(duì)肝臟有很好的保護(hù)作用，也可能與青稞中富含的酚酸類活性成分的組成以及相對(duì)含量有關(guān)。將在后期的實(shí)驗(yàn)中利用該質(zhì)譜技術(shù)分析其中全部的酚酸化合物，并結(jié)合體內(nèi)實(shí)驗(yàn)利用分子生物技術(shù)進(jìn)一步研究其調(diào)控脂質(zhì)代謝的作用機(jī)理。

圖7 薏米、赤小豆、青稞、蕎麥的提取物對(duì)經(jīng)過(guò)油酸處理的HepG2細(xì)胞內(nèi)天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶和丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶的影響

3 結(jié)論

對(duì)4種雜糧進(jìn)行了脫脂提取，系統(tǒng)分析了其提取物的組分含量，并基于HepG2高脂模型對(duì)其降脂功能進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果表明，赤小豆和青稞提取物中的可溶性總糖含量相當(dāng)，薏米提取物次之，蕎麥提取物最少。此外，青稞提取物中的總酚含量最高可以達(dá)到84.24 mg GAE/100 g；赤小豆由于其種皮含有多種潛在生物活性的色素，因此其提取物中總黃酮含量最高(34.794 mg RE/100 g)。4種雜糧提取物在一定程度上均能有效降低高脂細(xì)胞內(nèi)TG、LDL-C、T-CHO、AST、ALT的含量。從整體上看，青稞提取物的效果較為突出，青稞提取物處理后細(xì)胞內(nèi)TG和T-CHO含量較油酸對(duì)照組明顯降低。結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，添加1 mg/mL青稞提取物后，高脂HepG2細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)TG質(zhì)量分?jǐn)?shù)降低34.4%，T-CHO質(zhì)量分?jǐn)?shù)降低21.4%，LDL-C降低了51.8%，ALT下降51.5%，AST下降21%，表現(xiàn)出最佳的降脂功能。因此后續(xù)將對(duì)青稞的活性成分進(jìn)行進(jìn)一步的探究，通過(guò)對(duì)機(jī)體內(nèi)相關(guān)通路的調(diào)控作用探明其降脂機(jī)理。