洪銀潔，涂文玲，傅頤，陳靜怡，朱景茹，甘慧娟，李旻

(福建中醫(yī)藥大學，福建 福州 350122)

慢性萎縮性胃炎(chronic atrophic gastritis，CAG)是以固有層腺體萎縮為主要病理特點的消化系統(tǒng)常見病，是“炎癌轉(zhuǎn)化”的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。中醫(yī)學依據(jù)癥候表現(xiàn)將其歸屬于“胃痛”“胃痞”“嘈雜”等，CAG病機以本虛標實為根本，脾胃虛弱為本，胃絡(luò)瘀血為標，瘀血亦是CAG發(fā)生發(fā)展的重要因素[1]。IL-1β、IL-6屬于促炎細胞因子[2]，與CAG的“炎癌轉(zhuǎn)化”進展密切相關(guān)，在檢測炎癥和評估CAG病情進展方面具有重要參考價值。HIF-1α表達水平與細胞缺氧程度呈正相關(guān)[3]，CAG病久入絡(luò)，胃絡(luò)血運不暢，瘀血內(nèi)阻，形成炎癥局部缺氧環(huán)境。加味柴芍六君湯在疏肝理氣、健脾和胃基礎(chǔ)上，加入丹參、莪術(shù)兩味中藥，兼顧活血祛瘀之效，能顯著改善臨床癥狀并促進炎癥修復[4-6]，然而其逆轉(zhuǎn)CAG胃黏膜病理改變的分子機制尚未完全闡明。本研究應(yīng)用加味柴芍六君湯治療CAG模型大鼠，通過HIF-1α表達變化以及IL-1β、IL-6含量來探討加味柴芍六君湯逆轉(zhuǎn)慢性萎縮性胃炎大鼠胃黏膜病理改變的炎癥相關(guān)生物學機制，可以進一步明確疏肝健脾化瘀治療CAG的效果，為相關(guān)研究提供參考。

1 材料

1.1 動物

20只SPF級SD大鼠，雄性，體質(zhì)量100～120 g，由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供，許可證號：SCXK(滬)2019-0005，飼養(yǎng)于福建中醫(yī)藥大學SPF級動物實驗中心，屏障環(huán)境下，控制環(huán)境溫度21～24 ℃，空氣濕度50%～60%。動物實驗過程符合《關(guān)于善待實驗動物的指導性意見》的相關(guān)規(guī)定，并取得福建中醫(yī)藥大學倫理委員會批準。

1.2 藥物

加味柴芍六君湯組成包含柴胡6 g，白芍4.5 g，人參9 g，白術(shù)9 g，茯苓9 g，半夏4.5 g，陳皮3 g，炙甘草6 g，丹參9 g，莪術(shù)9 g，中藥飲片均購于福建中醫(yī)藥大學附屬第三人民醫(yī)院藥劑科。浸泡30 min后單蒸水煎煮2次，混合后濃縮至含生藥量0.69 g/mL的中藥煎液，經(jīng)潔凈紗布過濾后分裝，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 試劑

脫氧膽酸鈉，批號20201209，北京奧博星生物技術(shù)有限公司；25%～28%氨水，批號202008011，西隴科學股份有限公司；HE染色試劑盒，批號J21D10Y106492，上海源葉生物科技有限公司；大鼠白細胞介素-1β(IL-1β)、白細胞介素-6(IL-6) ELISA試劑盒，批號LOT20210510A，上海酶聯(lián)生物科技有限公司；RNA提取試劑盒，批號R401-01，Vazyme；逆轉(zhuǎn)錄試劑，批號AKF1919A，寶生物工程(大連)有限公司；PCR試劑，批號AK41790A，寶生物工程(大連)有限公司。

1.4 儀器

RM2245型半自動輪轉(zhuǎn)式切片機(德國Leica公司)；5424R型高速冷凍離心機(德國Eppenddorf公司)；TissueLyser Ⅱ型組織研磨儀(Giagen公司)；RT6100型酶標儀(Rayto公司)；Nanodrop 2000型紫外-可見分光光度計(美國Thermo Scientific)；QuantStudio6 Flex型熒光定量PCR儀(美國ABI公司)。

2 方法

2.1 動物分組及造模

將大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后按隨機數(shù)字表法分為正常組6只，造模組14只。造模方法參照文獻[7]加以改進，將脫氧膽酸鈉粉末溶于單蒸水中配成8.29 g/L的脫氧膽酸鈉溶液，將氨水溶于單蒸水中配制成3.78 mL/L的氨水溶液，用以造模組大鼠每日交替飲用，并配合饑飽失常(兩日飽食，一日停食)，循環(huán)往復，共16周。造模結(jié)束后隨機取2只造模組大鼠取材觀察胃黏膜組織病理形態(tài)，若出現(xiàn)固有層腺體萎縮，炎性細胞浸潤則提示造模成功。將成模大鼠隨機分為模型組、加味柴芍六君湯組，每組6只。

2.2 給藥

按人與動物間藥物劑量換算的常規(guī)算法[8]，大鼠的給藥量約為人的6倍，正常組和模型組予等體積(10 mL/kg)生理鹽水灌胃，加味柴芍六君湯組予0.69 g/mL加味柴芍六君湯灌胃，每日1次。3組均連續(xù)干預4周。

2.3 取材

灌胃結(jié)束后，大鼠禁食不禁水24 h，稱取大鼠體質(zhì)量，用20%烏拉坦(0.3 mL/100 g)腹腔注射麻醉，麻醉后迅速剖腹，行腹主動脈采血。斷頭處死大鼠，取出全胃并從幽門處沿胃大彎剪開胃腔，冰生理鹽水清洗干凈胃內(nèi)容物，取胃竇部修剪為5 mm×5 mm的組織塊放入4%的多聚甲醛溶液固定24 h，其余胃黏膜組織置于凍存管，-80 ℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 觀察及檢測指標

2.4.1 動物一般情況及體質(zhì)量

觀察各組大鼠毛發(fā)色澤、精神狀態(tài)、活動度、糞便性狀等一般情況變化，并于造模前后、干預后分別記錄3組大鼠體質(zhì)量。

2.4.2 HE染色法觀察胃黏膜組織病理

將4%多聚甲醛固定后的胃黏膜組織取出，梯度脫水、透明、浸蠟、石蠟包埋、連續(xù)切片，切片厚度為4 μm，撈片后烘干脫蠟，進行HE染色，封片，光學顯微鏡下觀察各組大鼠胃黏膜組織病理形態(tài)。

2.4.3 酶聯(lián)免疫吸附測定IL-1β、IL-6含量

按照ELISA試劑盒說明配制標準品和樣品，用酶標儀測定450 nm處標準品的濃度及吸光度值并繪制標準曲線。將樣品吸光度值代入標準曲線，計算各樣品中IL-1β、IL-6的實際濃度。

2.4.4 qPCR法檢測胃黏膜HIF-1α mRNA表達

將組織從-80 ℃冰箱取出冰上解凍，稱取50 mg胃黏膜組織進行RNA提取，經(jīng)75%乙醇清洗后用紫外-可見分光光度計測RNA濃度。根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑說明書配制反應(yīng)體系，設(shè)置逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件。將反應(yīng)完的cDNA吸取1 μL用于下一步的qPCR反應(yīng)，其余放入-20 ℃儲存。按說明書配制qPCR反應(yīng)體系，置于熒光定量PCR儀中進行擴增反應(yīng)，擴增條件：95 ℃ 30 s、95 ℃ 10 s、60 ℃ 30 s，40個循環(huán)。采用β-actin作為內(nèi)參基因，用2-△△Ct法計算胃黏膜HIF-1α mRNA相對表達量。引物序列見表1。

表1 胃黏膜組織β-actin、HIF-1α mRNA引物序列

2.5 統(tǒng)計學方法

3 結(jié)果

3.1 模型評價

3.1.1 動物一般情況及體質(zhì)量比較

正常組大鼠毛發(fā)潔白有光澤，活潑好動，行動敏捷，大便性狀氣味無殊；模型組大鼠毛發(fā)粗硬，色淡黃無光澤，無精打采，安靜扎堆，大便時干時稀，氣味臭穢；加味柴芍六君湯組大鼠毛發(fā)情況、精神狀況、活動度、大便性狀等較模型組有明顯改善。造模前，正常組與造模組大鼠體質(zhì)量無明顯差異(P>0.05)。造模后，與正常組相比，造模組大鼠體質(zhì)量顯著減輕(P<0.01)，見表2。連續(xù)干預4周后，計算各組大鼠的體質(zhì)量增量。與正常組相比，模型組大鼠的體質(zhì)量增量下降(P<0.05)。與模型組相比，加味柴芍六君湯組大鼠的體質(zhì)量增量顯著增加(P<0.01)，見表3。

表2 兩組大鼠造模前后體質(zhì)量比較

表3 各組大鼠體質(zhì)量增量比較

3.1.2 胃黏膜組織病理比較

正常組大鼠胃固有層腺體排列整齊，未見腺體萎縮、減少；模型組大鼠胃黏膜固有層腺體排列紊亂，局部腺體萎縮、減少，腺腔增大，炎性細胞浸潤，可見多處散在出血點；與模型組相比，加味柴芍六君湯組大鼠腺體排列較整齊，腺體萎縮改善，仍可見散在出血點。如圖1所示。

圖1 各組大鼠胃黏膜組織HE染色病理圖(×400)

3.2 各組血清IL-1β、IL-6含量

與正常組相比，模型組大鼠血清炎癥因子IL-1β、IL-6含量顯著升高(P<0.01)；與模型組相比，加味柴芍六君湯組大鼠血清炎癥因子IL-1β、IL-6含量顯著降低(P<0.01)。見表4。

表4 各組大鼠血清IL-1β、IL-6含量比較

3.3 各組胃黏膜HIF-1α mRNA表達

與正常組相比，模型組大鼠胃黏膜組織HIF-1α mRNA表達量明顯上調(diào)(P<0.05)；加味柴芍六君湯組大鼠胃黏膜組織HIF-1α mRNA表達量與模型組表達量相比有下調(diào)趨勢，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表5。

表5 各組大鼠胃黏膜組織HIF-1α表達水平比較

4 討論

CAG歸屬于中醫(yī)學“胃痛”“胃痞”“嘈雜”等范疇，中醫(yī)學認為，CAG病位在胃，與肝、脾密切相關(guān)，肝與脾在生理上密切相關(guān)，病理上相互影響[9-10]?！巴恋媚径_”，脾土得肝木之疏泄，脾胃升降協(xié)調(diào)，運化功能健旺；而“木賴土以培之”，脾為氣血生化之源，脾氣運化水谷精微，輸送滋養(yǎng)肝木，才能發(fā)揮其正常的生理功能。血液的生成和循行同樣需要肝脾相互協(xié)作，脾氣健運，氣血化源充足，肝血充足，則疏泄正常，氣機調(diào)暢，氣血運行方能無阻。葉天士在《臨證指南醫(yī)案》中指出慢性遷延性疾病的發(fā)生發(fā)展規(guī)律是“初為氣結(jié)在經(jīng)，久則血傷入絡(luò)”，CAG病程長，病情反復，血瘀是CAG病情進展的關(guān)鍵因素[11-12]，肝郁脾虛是CAG的重要病理特點，而柴芍六君湯是臨床上治療慢性萎縮性胃炎肝郁脾虛型的常用方劑。本研究在柴芍六君湯的基礎(chǔ)上加入活血祛瘀、通經(jīng)止痛之丹參以及破血行氣、消積止痛之莪術(shù)組成加味柴芍六君湯，旨在探討加味柴芍六君湯針對肝郁脾虛血瘀病機治療CAG的炎癥相關(guān)生物學機制。

本實驗通過動物一般情況、體質(zhì)量以及胃黏膜組織病理形態(tài)比較來進行模型評價。結(jié)果顯示，模型組大鼠毛發(fā)粗硬，色淡黃無光澤，無精打采，安靜扎堆，大便時干時稀，氣味臭穢，成模大鼠體質(zhì)量較正常組大鼠顯著減輕，其宏觀表征符合肝郁脾虛的病機特點。模型組大鼠胃固有層腺體萎縮，符合CAG的病理診斷標準，說明CAG疾病模型已成功建立。

IL-1β是由單核-巨噬細胞分泌的炎癥因子，能引發(fā)級聯(lián)反應(yīng)致使白細胞聚集、浸潤，放大炎癥反應(yīng)，并通過影響炎癥與免疫二者平衡[13-14]，促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展。其能誘導內(nèi)皮細胞活化，在CAG胃黏膜炎癥反應(yīng)中起調(diào)節(jié)作用，但IL-1β水平過高會損傷胃黏膜。研究顯示[15]，IL-1β水平在慢性非萎縮性胃炎、慢性萎縮性胃炎、胃癌3個階段有顯著差異，呈升高趨勢，并與胃癌的生長、浸潤及轉(zhuǎn)移明顯相關(guān)。血清IL-6是可調(diào)節(jié)免疫細胞(B細胞和T細胞)參與機體免疫應(yīng)答，促進炎癥反應(yīng)的一種多效炎癥細胞因子[16]。較多研究表明[17-18]，IL-1β、IL-6在炎性反應(yīng)的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用，可用于探討胃黏膜損傷的嚴重程度及炎癥分級。

HIF-1α是對缺氧水平產(chǎn)生細胞免疫應(yīng)答的主要調(diào)節(jié)因子，可以激活多種缺氧反應(yīng)基因的表達，其在常氧環(huán)境下不穩(wěn)定，易被細胞內(nèi)氧依賴性泛素蛋白酶降解，但在缺氧環(huán)境下可以穩(wěn)定表達[19]。缺氧是腫瘤微環(huán)境的一個常見特征，可誘導HIF-1α表達水平上調(diào)，增強腫瘤細胞對低氧環(huán)境的適應(yīng)能力[20]，增加CAG的癌變風險。

本實驗研究結(jié)果顯示，模型組血清IL-1β、IL-6含量顯著升高，胃黏膜組織HIF-1α mRNA表達水平較之正常組上調(diào)，表明CAG胃黏膜損傷程度較為嚴重，炎癥反應(yīng)明顯，胃黏膜局部缺氧環(huán)境形成，癌變風險增加。加味柴芍六君湯干預后IL-1β、IL-6含量顯著減輕，HIF-1α mRNA表達水平較模型組表現(xiàn)出下調(diào)的變化趨勢，說明藥中病機，能促進CAG胃黏膜損傷修復，減輕炎癥反應(yīng)，可能具有改善胃黏膜缺氧環(huán)境的作用，但效果不甚明顯。

綜上所述，加味柴芍六君湯可能是通過降低血清IL-1β、IL-6含量，下調(diào)胃黏膜缺氧誘導因子HIF-1α過表達，從而改善胃黏膜局部缺氧環(huán)境，減輕炎癥反應(yīng)，逆轉(zhuǎn)胃黏膜萎縮。