夏 亮 謝齊貴 陳湛蕾

肝癌是最常發(fā)生的惡性腫瘤之一[1]。盡管肝癌的治療手段不斷發(fā)展，包括手術切除、移植、消融、經動脈化學栓塞等，但療效仍不令人滿意[2]。芍藥苷是從白芍根中分離出來的一種生物活性成分，具有免疫調節(jié)、降血糖和降壓等作用[3-4]。已有研究發(fā)現(xiàn)，芍藥苷在多種人類癌癥中具有抗腫瘤功能，例如肺癌、乳腺癌、肝癌等[5-7]。然而，芍藥苷介導的抗肝腫瘤機制尚未完全明確。因此，本研究擬利用肝癌HepG2 細胞系，研究芍藥苷對肝癌細胞增殖、侵襲、凋亡的影響及其潛在機制，報道如下。

1 實驗材料

1.1 材料 人肝癌細胞HepG2（上海富衡生物科技有限公司，貨號FH0076）。

1.2 藥物及試劑 芍藥苷（麥克林，批號C10081578）；DMEM 培養(yǎng)基（美國Gibco 公司，批號11965092）；EDTA-胰蛋白酶消化液（美國Gibco 公司，批號25200072）；胎牛血清（美國Gibco 公司，批號12483020）、磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）（碧云天生物技術研究所，批號C0221A）；青霉素-鏈霉素溶液（美國Gibco 公司，批號15070063）；CCK-8 試劑盒（日本Dojindo 公司，批號CK-04）；transwell 小室（美國Corning 公司，批號3422）；基質膠（美國BD 公司，批號P0873K）；TRIzol 試劑（美國Invitrogen 公司，批號IK5013）；PrimeScriptRT 試劑盒、SYBRPremix Ex Taq 試劑盒（日本Takara 公司，批號RR047A、RR0584）；膜聯(lián)蛋白V/碘化丙錠（Annexin-V/PI）凋亡試劑盒（美國BD 公司，批號6301518）；RIPA 裂解液、磷酸酶抑制劑、封閉液、一抗稀釋液、二抗稀釋液、ECL 發(fā)光顯影液、BCA 蛋白濃度測定試劑盒（碧云天生物技術研究所，批號P0013B、ST019、P0252、P0256、P0258、P0018FS、P0012S）；兔抗人Notch-1 單克隆抗體、鼠抗人Hes-1 單克隆抗體、鼠抗人β-肌動蛋白（英國Abcam 公司，批號ab52627、ab119776、ab8226）。

1.3 儀器 FACS Calibur 流式細胞儀（美國BD公司）；ELx800 酶標儀（美國BioTek Instuments 公司）；奧林巴斯AI09 倒置光學顯微鏡（日本奧林巴斯公司）；Pierce ECL 系統(tǒng)（美國通用公司）。

2 實驗方法

2.1 細胞培養(yǎng)及分組 使用含10%的胎牛血清、1%雙抗的DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)人肝癌細胞HepG2，并將其置入37 ℃、5%CO2的增濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞融合度達到80%～90%時傳代以備后續(xù)實驗使用。將HepG2 細胞分為四組，空白對照組僅使用正常培養(yǎng)液進行培養(yǎng)。根據(jù)既往發(fā)表相關文獻[8-9]，確定芍藥苷用藥濃度范圍，設置低、中、高劑量，組細胞培養(yǎng)液中加入芍藥苷，分別使其藥物濃度為25、50、75 μmol/L。

2.2 CCK-8 實驗測定細胞增殖活性 將處于對數(shù)生長期的細胞，按照104個/孔的密度接種于96 孔板中，設置3 個重復，放回培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)至次日。加入不同濃度芍藥苷（0、25、50、75、100、150 μmol/L）培養(yǎng)24 h 后，每孔加入10 μL CCK-8，繼續(xù)培養(yǎng)3 h，使用酶標儀檢測450 nm 波長處的吸光度值（A）。

2.3 Transwell 實驗檢測細胞侵襲能力 將100 μL細胞懸液以5×103個/孔的密度接種于涂有基質膠的Transwell 上層小室中，在無血清的DMEM 培養(yǎng)基中孵育，下層小室加入600 μL 含有10%血清的DMEM培養(yǎng)基。24 h 后將細胞用甲醇固定15 min，并用2%結晶紫染色。用棉簽移除小室膜上未遷移的細胞，使用倒置顯微鏡拍照，記錄跨膜細胞數(shù)。

2.4 流式細胞儀檢測細胞凋亡率 將處于對數(shù)生長期HepG2 細胞以3×104個/孔的密度接種于6 孔板中，按上述分組處理細胞24 h，后消化細胞，并用預冷的PBS 洗滌細胞3 次，以3 000 r/min 離心10 min，留取細胞沉淀，加入500 μL 結合緩沖液后，依次加入5 μL Annexin-V/FITC 染液和10 μL PI 染液，室溫避光孵育15 min，立即進行流式細胞儀檢測，記錄各組凋亡情況。

2.5 Western blot 檢測細胞表達蛋白水平 取對數(shù)生長期的HepG2 細胞以3×104個/孔的密度接種于6孔板中，次日按上述分組處理細胞24 h，加入RIPA裂解液裂解細胞，冰裂30 min 后，以12 000 g、4 ℃離心30 min 吸取上清，用BCA 法測定蛋白濃度。每組取20 μg 蛋白加入SDS-PAGE 凝膠孔道進行電泳，后轉移至PVDF 膜上。使用封閉液室溫封閉膜1 h，后使用TBST 洗膜3 次，加入對應一抗，置于4 ℃搖床孵育過夜。次日洗膜3 次，加入對應二抗室溫孵育2 h，后用ECL 發(fā)光顯影液在曝光系統(tǒng)中進行蛋白條帶成像。使用ImageJ 軟件進行蛋白條帶灰度分析。

2.6 統(tǒng)計學方法 應用SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)。本研究中所有實驗均獨立重復3 次。符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差（）表示。單一處理條件下，組間比較采用單因素方差分析，兩組比較使用Student’s t 檢驗。P＜0.05 視為差異具有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 芍藥苷對HepG2 細胞增殖活性的影響 各組細胞培養(yǎng)24 h 后，與空白對照組細胞比較，隨著芍藥苷處理濃度增加，細胞增殖活性呈劑量依賴性顯著降低（P＜0.05），見表1。

表1 各組肝癌HepG2 細胞OD 值、增殖活性比較（）

表1 各組肝癌HepG2 細胞OD 值、增殖活性比較（）

注：空白對照組給予芍藥苷0 μmol/L；芍藥苷25 μmol/L 組給予芍藥苷25 μmol/L；芍藥苷50 μmol/L 組給予芍藥苷50 μmol/L；芍藥苷75 μmol/L 組給予芍藥苷75 μmol/L；芍藥苷100 μmol/L 組給予芍藥苷100 μmol/L；芍藥苷150 μmol/L 組給予芍藥苷150 μmol/L；與空白對照組比較，aP＜0.05；與芍藥苷25 μmol/L 組比較，bP＜0.05；與芍藥苷50 μmol/L 組比較，cP＜0.05；與芍藥苷75 μmol/L 組比較，dP＜0.05；與芍藥苷100 μmol/L 組比較，eP＜0.05

3.2 芍藥苷對HepG2 細胞增侵襲能力的影響 與空白對照組比較，芍藥苷低、中、高劑量組的細胞穿膜數(shù)顯著減少（P＜0.05），且芍藥苷低、中、高劑量組抑制細胞侵襲能力呈劑量依賴性（P＜0.05），見表2和圖1。

表2 各組肝癌HepG2 細胞穿膜數(shù)目比較（個，）

表2 各組肝癌HepG2 細胞穿膜數(shù)目比較（個，）

注：空白對照組給予芍藥苷0 μmol/L；芍藥苷低劑量組給予芍藥苷25 μmol/L；芍藥苷中劑量組給予芍藥苷50 μmol/L；芍藥苷高劑量組給予芍藥苷75 μmol/L；與空白對照組比較，aP＜0.05；與芍藥苷低劑量組比較，bP＜0.05；與芍藥苷中劑量組比較，cP＜0.05

圖1 芍藥苷對HepG2 細胞增侵襲能力的影響（2%結晶紫染色，×40）

3.3 芍藥苷對HepG2 細胞凋亡反應的影響 Annexin-V/PI 雙染法結果顯示，與空白對照組比較，芍藥苷處理組HepG2 細胞凋亡率顯著增加（P 均＜0.05），且細胞凋亡率隨芍藥苷的處理濃度增加而升高（P＜0.05），見表3。

表3 各組肝癌HepG2 細胞凋亡率比較（%，）

表3 各組肝癌HepG2 細胞凋亡率比較（%，）

注：空白對照組給予芍藥苷0 μmol/L；芍藥苷低劑量組給予芍藥苷25 μmol/L；芍藥苷中劑量組給予芍藥苷50 μmol/L；芍藥苷高劑量組給予芍藥苷75 μmol/L；與空白對照組比較，aP＜0.05；與芍藥苷低劑量組比較，bP＜0.05；與芍藥苷中劑量組比較，cP＜0.05

3.4 芍藥苷對HepG2 細胞Notch-1 信號通路的影響 與空白對照組比較，芍藥苷處理組Notch-1 及Hes-1 蛋白表達顯著降低（P 均＜0.05），且隨芍藥苷處理濃度增加，蛋白表達逐漸降低（P 均＜0.05）。

4 討論

目前，肝癌死亡的主要原因是腫瘤的復發(fā)和轉移[10]。因此，抑制肝癌細胞侵襲、增殖具有重要意義?；熕幬餅橐种聘伟┺D移的主要治療手段，但其低特異性導致了眾多不良反應和毒副作用[11]。與典型的化療藥物相比，藥物植物有望成為更有效的治療方法[12]。本研究結果表明，芍藥苷可呈劑量依賴性降低肝癌細胞增殖活性。此外，在用芍藥苷處理HepG2細胞24 h 后，隨著芍藥苷給藥濃度的增加，細胞侵襲性逐漸降低，表明芍藥苷成功地抑制了肝癌細胞的侵襲能力。Liu 等[7]發(fā)現(xiàn)，芍藥苷可抑制HepG2 肝癌細胞的增殖、遷移和侵襲，與本研究結果一致。

表4 各組肝癌HepG2 細胞蛋白表達比較（）

表4 各組肝癌HepG2 細胞蛋白表達比較（）

注：空白對照組給予芍藥苷0 μmol/L；芍藥苷低劑量組給予芍藥苷25 μmol/L；芍藥苷中劑量組給予芍藥苷50 μmol/L；芍藥苷高劑量組給予芍藥苷75 μmol/L；與空白對照組相比，aP＜0.05；與芍藥苷低劑量組比較，bP＜0.05；與芍藥苷中劑量組比較，cP＜0.05

Notch 信號通路是一種保守的信號轉導通路，對細胞發(fā)育和凋亡非常重要[13-15]。在哺乳動物的四種Notch 受體中，Notch-1 是主要受體[16]。既往有研究證明，Notch-1 信號通路與肝癌的增殖、侵襲和轉移有關[17-18]；因此，通過抑制該信號通路的活性有可能抑制肝癌細胞的上述功能。本研究觀察了Notch 信號通路在芍藥苷抑制肝癌細胞增殖、侵襲，并誘導凋亡中的潛在作用。我們發(fā)現(xiàn)，HepG2 細胞暴露于芍藥苷24 h 后，參與Notch-1 信號通路的Notch-1 和Hes-1蛋白表達水平呈劑量依賴性顯著降低。提示芍藥苷可能通過抑制Notch-1 信號通路，從而抑制肝癌細胞的增殖、侵襲，并誘導凋亡。

綜上所述，芍藥苷顯著抑制肝癌細胞HepG2 增殖和侵襲能力，還可誘導細胞發(fā)生凋亡，其機制可能與芍藥苷抑制Notch-1/Hes-1 信號通路有關。