閔 盛，孫 群，汪 洋，戴 琴，王德玉，王 碩

(成都市藥品檢驗研究院,成都 610045)

生物胺是一類具有生物活性的低相對分子質(zhì)量的含氮有機化合物的總稱,結(jié)構(gòu)上可看作是氨中的氫原子被烷基、芳基或雜環(huán)基取代后生成的化合物。按結(jié)構(gòu)可將其分為脂肪族胺、芳香族胺和雜環(huán)族胺;按組成成分可分為單胺、二胺和多胺;按揮發(fā)難易程度可分為揮發(fā)性胺、非揮發(fā)性胺[1-2]。常見生物胺包括組胺、酪胺、色胺、尸胺、苯乙胺、腐胺、精胺和亞精胺等[3-4]。低含量的生物胺對人體細胞增殖分化、核酸功能調(diào)節(jié)等代謝活動有重要作用,但當積累過多生物胺或由遺傳、胃腸道疾病及酒精攝入導致體內(nèi)胃腸道上胺氧化酶活性不足時,便會引起一系列疾病,如頭痛、腹瀉、高血壓及心悸等[5-6]。其中,組胺的毒性最強,酪胺次之;腐胺和尸胺會抑制組胺、酪胺代謝酶的活性,增強組胺、酪胺的毒性,其還會與食品中的亞硝酸鹽反應(yīng)生成N-亞硝胺致癌物[7]。畜禽肉含有豐富的蛋白質(zhì),而蛋白質(zhì)分解為其腐敗變質(zhì)的特征,生物胺是蛋白質(zhì)受到組織酶或微生物蛋白酶的作用分解得到的產(chǎn)物,鑒于生物胺的毒性,加強對畜禽肉中生物胺的檢測具有非常重要的作用。

目前文獻報道的生物胺的檢測方法主要有氣相色譜法[8]、離子色譜法[9]、高效液相色譜法[10-13]、高效液相色譜-質(zhì)譜法[14-16]、電化學生物傳感器法[17]、薄層色譜法[18]、毛細管電泳法[19]、酶聯(lián)免疫法[20]、膠束液相色譜法[21]等。其中,高效液相色譜法使用較普遍,也被國家標準GB 5009.208－2016《食品安全國家標準 食品中生物胺的測定》[22]采用。國家標準方法需要進行多次提取、多次凈化、丹磺酰氯柱前衍生等步驟,操作較為繁瑣、耗時較長(約6 h),且對衍生條件要求比較苛刻,不適用大批量樣品分析。在此基礎(chǔ)上,本工作簡化了前處理條件,在保證結(jié)果準確的前提下大大提高了檢測效率,能較好地滿足實際檢測需要。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

Ultimate 3000型高效液相色譜儀,配二極管陣列檢測器;BP211D 型電子天平(感量0.01 mg);HZS-H 型水浴振蕩器;Milli-Q 型純水儀;e 5810 R型高速冷凍離心機;H H·S 1-Ni型電熱恒溫水浴鍋。

單標準儲備溶液:1 000 mg·L－1,取各生物胺標準品約10 mg,用0.1 mol·L－1鹽酸溶液溶解并稀釋至10.0 mL,搖勻備用。

混合標準溶液系列:取適量各生物胺標準儲備溶液,用0.1 mol·L－1鹽酸溶液逐級稀釋至質(zhì)量濃度分別為5.00,12.5,25.0,50.0,75.0,125,250 mg·L－1的混合標準溶液系列,搖勻備用。

內(nèi)標溶液:1 000 mg·L－1,取1,7-二氨基庚烷標準品約10 mg,用0.1 mol·L－1鹽酸溶液溶解并稀釋至10.0 mL,搖勻備用。

丹磺酰氯衍生溶液:10 g·L－1,取適量丹磺酰氯,以丙酮溶解并定容,置于4 ℃冰箱避光儲存。

色胺、尸胺標準品的純度為99.3%;β-苯乙胺、酪胺、亞精胺標準品的純度為99.9%;腐胺標準品的純度為99.8%;組胺標準品的純度為100.0%;精胺標準品的純度為99.6%;1,7-二氨基庚烷標準品的純度為98.7%。

甲醇、丙酮、正己烷均為色譜純;其他試劑為分析純;試驗用水為超純水。

1.2 儀器工作條件

Phenomenex Kinetex 色譜柱(100 mm ×4.6 mm,2.6μm);柱溫30 ℃;檢測波長254 nm;進樣體積10μL;流量1.5 mL·min－1;流動相A 為甲醇,B為水,梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序Tab.1 Gradient elution procedure

1.3 試驗方法

取絞碎樣品10 g,置于50 mL 具塞錐形瓶中,加入50 g·L－1三氯乙酸溶液20 mL、正己烷10 mL及內(nèi)標溶液1.0 mL,混勻,渦旋提取15 min,超聲提取15 min,以8 000 r·min－1轉(zhuǎn)速離心5 min。取0.5 mL 上清液置于10 mL 比色管中,依次加入2 mol·L－1氫氧化鈉溶液100μL、飽和碳酸氫鈉溶液300μL、丹磺酰氯衍生溶液2.0 mL,振蕩混勻,于60 ℃反應(yīng)15 min。取出比色管,加入100μL氨水,振蕩混勻,于60 ℃保溫15 min,以終止衍生反應(yīng)。加入乙腈稀釋至5 mL,振蕩混勻,用0.22μm 濾膜過濾,濾液按照儀器工作條件測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取方法的選擇

和國家標準GB 5009.208－2016相比:①本方法以一次性加入三氯乙酸溶液并用渦旋和超聲相結(jié)合方法提取樣品,避免了分次提取渦旋時間長、上清液渾濁導致過濾時間長等問題;②同時加入三氯乙酸溶液和正己烷即可得到澄清上清液,省去了單獨除脂步驟;③凈化操作對測定影響不大,省去了用體積比1∶1的正丁醇-三氯甲烷混合溶液萃取凈化的步驟。

2.2 衍生方法的選擇

和國家標準GB 5009.208－2016相比,本方法直接以氫氧化鈉溶液和碳酸氫鈉溶液調(diào)節(jié)溶液酸度,然后加入丹磺酰氯衍生溶液衍生,以氨水終止反應(yīng),所得色譜圖中,雜質(zhì)色譜峰對生物胺基本無干擾,且各生物胺的回收率均在80.0%以上,省去了吹氮除丙酮、乙醚萃取并氮吹至干等步驟。

2.3 色譜條件的優(yōu)化

與傳統(tǒng)C18色譜柱相比,Phenomenex Kinetex色譜柱(100 mm×4.6 mm,2.6μm)采用了新型核-殼技術(shù),極大縮短了溶質(zhì)傳質(zhì)過程和運行時間,提高了分離度,8種生物胺可在20 min內(nèi)完成分離,比常規(guī)檢測(約40 min)節(jié)約了近一半時間。

在最優(yōu)試驗條件下,可在約1.5 h內(nèi)完成樣品分析,所得50.0 mg·L－1混合標準溶液和加標樣品溶液(加標量50.0 mg·L－1)的色譜圖見圖1。

圖1 混合標準溶液和加標樣品溶液的色譜圖Fig.1 Chromatograms of the mixed standard solution and the spiked sample solution

2.4 標準曲線、檢出限和測定下限

取0.5 mL混合標準溶液系列,置于10 mL 比色管中,加入內(nèi)標溶液25μL,按照試驗方法衍生并測定,以各生物胺的質(zhì)量濃度為橫坐標,其對應(yīng)的峰面積與內(nèi)標物峰面積的比值為縱坐標進行線性回歸,所得標準曲線的線性范圍為5.00～250 mg·L－1,其他線性參數(shù)見表2。

分別以3倍、10倍信噪 比(S/N)計算檢出限(3S/N)和測定下限(10S/N),所得結(jié)果見表2。

表2 線性參數(shù)、檢出限和測定下限Tab.2 Linearity parameters，detection limits and lower limits of determination

由表2 可知,8 種生物胺的檢出限為4～21μg·kg－1,滿足GB/T 5009.208－2016 對檢出限的要求。

2.5 精密度和回收試驗

按照試驗方法分析6 份加標樣品(加標量為1 mg),1 d之內(nèi)完成測定,計算回收率和測定值的相對標準偏差(RSD),所得結(jié)果見表3。再連續(xù)測定4 d,所得測定值的RSD 見表3。

表3 精密度和回收試驗結(jié)果Tab.3 Results of tests for precision and recovery

由表3可知,8種生物胺的回收率為80.4%～95.6%,日 內(nèi)RSD 為1.9%～5.1%,日 間RSD 為2.3%～6.2%,滿足日常檢測要求。

2.6 樣品分析

按照試驗方法分析20 批畜禽肉樣品,結(jié)果見表4。

由表4可知,在20批樣品中,組胺均未檢出,精胺均有不同程度檢出,生物胺總量大于100 mg·kg－1的樣品有6批,說明該方法能用于檢測畜禽肉中8種生物胺。

表4 樣品分析結(jié)果Tab.4 Analytical results of the samples mg·kg-1

本工作在國家標準GB 5009.208－2016提供的高效液相色譜法基礎(chǔ)上,簡化了樣品提取、衍生化過程,省去了凈化操作,不僅使樣品分析時間從6 h縮短至1.5 h,而且還降低了樣品損失和試劑耗費成本,方法的檢出限、精密度和準確度均符合要求,可用于畜禽肉樣品的批量分析。