王萍，李雪梅，吳正中，張華坤，雷釧

南方醫(yī)科大學附屬深圳市婦幼保健院生殖醫(yī)學中心，廣東 深圳 518028

多囊卵巢綜合征(polycystic ovary syndrome，PCOS)是育齡女性最常見的生殖內分泌疾病，其發(fā)病的具體機制尚不明確，普遍認為是遺傳基因與環(huán)境因素相互作用的結果，其中卵泡發(fā)育異常及卵巢顆粒細胞凋亡是其發(fā)病的重要因素[1]。研究表明許多人類疾病與長鏈非編碼RNA(long-chain non-coding RNA，lncRNA)的異常表達有關，其中多種lncRNA在PCOS患者的血清、卵泡液和顆粒細胞中表達量發(fā)生改變[2]，長鏈非編碼RNA GAS5 (LncRNA GAS5)在PCOS 患者中低表達，可能參與PCOS 疾病的發(fā)生與發(fā)展[3]。另外，微小RNA(miRNA)廣泛參與卵泡發(fā)育及胚胎發(fā)育等過程，研究表明，miR-222 參與細胞增殖與凋亡過程[4]。然而，目前GAS5 和miR-222 在PCOS 患者顆粒細胞中的表達情況及生物學功能相關研究較少。本研究檢測PCOS 患者顆粒細胞中GAS5 和miR-222 的表達水平，為揭示PCOS發(fā)病機制奠定理論基礎。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2019 年12 月至2020 年10月于深圳市婦幼保健院生殖醫(yī)學中心接受體外受精-胚胎移植(IVF-ET)治療的86例不孕癥患者，其中42例典型的PCOS 患者納入實驗組，其余44 例因男方因素不孕行IVF-ET 患者納入對照組。PCOS 診斷參照2018多囊卵巢綜合征中國診療指南育齡期PCOS的診斷標準[5]。納入標準：年齡20～35歲；初次IVF-ET治療患者；IVF-ET術前3個月無激素類藥物使用史。排除標準：罹患糖尿病、腫瘤、急性感染、明顯輸卵管積液者；其他因素引起的高雄激素血癥，如患庫欣綜合征、先天性腎上腺增生和藥物引起的高雄激素血癥患者。本研究經深圳市婦幼保健院倫理委員會批準實施，所有患者均簽署知情同意書。

1.2 實驗方法

1.2.1 人顆粒細胞收集 取卵日收集第一管無血的卵泡液標本，將收集到的卵泡液置于15 mL 離心管中，首先以1 000 r/min，離心10 min，小心將紅細胞層上方的白色絮狀物吸出，取試管底部紅細胞上層細胞，以1∶1 體積比移至45%的Percoll 細胞分離液上，2 700 r/min 離心20 min，回收位于兩液體中間的顆粒細胞層，將顆粒細胞置于1.5 mL 的離心管中，用磷酸緩沖鹽溶液(PBS)清洗一遍，離心后去掉PBS，于-80℃低溫冰箱凍存。

1.2.2 RNA 提取及熒光定量PCR 人顆粒細胞用TRIzol 法提取總RNA。1.5 mL 裝有顆粒細胞的離心管加入1 mL TRIzol 裂解15 min 后提取RNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的完整性。提取的總RNA用TaKaRa AMV反轉錄酶進行反轉錄合成cDNA，-80℃保存?zhèn)溆谩Ｒ镉缮虾Ｉ锕こ碳夹g服務公司合成(表1)。反轉錄得到的cDNA作為qRT-PCR反應模板，按照BIOMIGA 公司的SYBR Green 1 說明書進行cDNA合成。

表1 LncRNA-GAS5和miRNA-222反轉錄引物

1.3 臨床數據收集 收集患者臨床資料，如年齡、體質量指數(BMI)。所有入組患者均于月經來潮2～3 d空腹靜脈抽血，應用化學發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測性激素水平，包括促卵泡生成素(FSH)、黃體生成素(LH)、泌乳素(PRL)、雌激素(E2)、睪酮(T)、AMH、孕酮(P)。

1.4 統(tǒng)計學方法 應用SPSS22.0 軟件進行數據統(tǒng)計分析。計量資料符合正態(tài)分布，以均數±標準差(±s)表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗，GAS5 與miR-222 相關性檢驗采用Pearson 相關分析。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 兩組患者的臨床資料比較 實驗組患者的BMI、LH 及P 明顯高于對照組，差異均具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；但兩組患者的年齡、FSH、PRL、E2、T 和AMH比較差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，見表2。

表2 兩組患者的一般資料比較(±s)

表2 兩組患者的一般資料比較(±s)

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2.2 兩組患者卵巢顆粒細胞中的GAS5和miR-222表達量比較 采用qRT-PCR檢測卵巢顆粒細胞GAS5和miR-222表達水平，結果顯示，實驗組GAS5表達水平低于對照組，miR-222表達水平明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，見圖1。采用Pearson方法分析PCOS患者顆粒細胞中GAS5與miR-222的相關性，結果顯示GAS5與miR-222表達呈負相關(r=-0.545，P=0.0002)，見圖2。

圖1 PCOS患者顆粒細胞中GAS5及miRNA-222的表達水平

圖2 PCOS患者顆粒細胞中GAS5與miRNA-222的相關性

2.3 患者卵巢顆粒細胞中GAS5表達量與性激素相關性 經Pearson相關性分析結果顯示，PCOS患者顆粒細胞中GAS5 的表達與LH 呈負相關(r=-0.89，P=0.019)，而與其他性激素指標無相關性(P＞0.05)，見表3。

表3 LncRNA-GAS5表達水平與PCOS患者性激素的相關性

3 討論

PCOS 在育齡女性中發(fā)病率占5%～10%，占無排卵性不孕患者的比例達30%～60%，是無排卵性不孕的主要原因[6-7]。PCOS 的發(fā)病涉及多方面因素，如高雄激素血癥、胰島素抵抗和卵泡發(fā)育異常等[8]。研究表明許多人類疾病與lncRNA 的異常表達有關[9]，目前l(fā)ncRNA在PCOS中的作用及機制主要集中于PCOS外周血中的研究，關于lncRNA在顆粒細胞和卵泡液中的研究報道較少。HUANG等[10]通過高通量測序結果表明，PCOS患者顆粒細胞有623個lncRNAs表達發(fā)生≥2 倍改變，并且PCOS 患者miRNA 表達和正常女性不同，揭示miRNA可能在PCOS發(fā)生與發(fā)展中具有重要作用[11]。lncRNA 可以作用于miRNA 進而調控下游靶基因的表達，影響顆粒細胞的增殖與凋亡過程[12]。

UCSC 數據庫顯示GAS5 在卵巢中的表達最高，說明GAS5在卵泡發(fā)育過程中具有重要作用。研究表明：GAS5在PCOS患者血漿中低表達，與胰島素抵抗密切相關，GAS5 表達與HOMA-IR呈負相關[13]；PCOS患者血清LH及IR指數均高于正常女性，且LH與IR指數呈正相關[14]。劉琴等[15]研究表明，伴有IR的PCOS患者卵巢顆粒細胞中GAS5表達顯著降低。本研究結果與上述研究一致，結果顯示：與對照組比較，實驗組PCOS患者卵巢顆粒細胞GAS5表達下調，差異有統(tǒng)計學意義P＜0.05，且GAS5 表達量與LH 水平呈負相關。推斷，PCOS不孕癥患者胰島素抵抗與血清LH水平存在一定相關性，進而影響顆粒細胞中GAS5的表達。

研究表明，miR-222 在PCOS 組織中表達顯著上調，可能通過調控p27Kip1 表達促進PCOS 的發(fā)展[16]。本研究結果顯示，miR-222 在PCOS 患者卵巢顆粒細胞中表達上調，與GAS5表達呈負相關。腫瘤細胞中，GAS5 可以靶向結合miR-222 促進細胞生長，抑制細胞凋亡[17]。PCOS 患者顆粒細胞凋亡率降低、增殖率升高，導致顆粒細胞增長過度，更多的卵泡簇進入募集，大量竇卵泡發(fā)育，成為PCOS多個卵泡同時發(fā)育的病理基礎。因此，推斷PCOS 顆粒細胞中GAS5 參與PCOS 發(fā)生與發(fā)展的原因可能是GAS5 通過靶向miR-222促進顆粒細胞增殖，抑制細胞凋亡，但這仍需進一步實驗驗證得出更客觀準確的結論。