么欣彤 孫善月 劉雅晴 石樂明 鄭媛婷

（復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院人類遺傳學(xué)與人類學(xué)系 上海 200438）

生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)為疾病早期診斷、預(yù)后評估、治療方案選擇以及療效監(jiān)控［1-3］帶來新的希望，是實現(xiàn)精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的基石［4］。micro RNA（miRNA）是一種長度為21~23 個核苷酸的非編碼小RNA 分子，通過與Argonaute（AGO）蛋白形成miRNA 介導(dǎo)的沉默復(fù)合物（miRNA induced silencing complex，mISC）抑制基因表達(dá)［5］。血漿來源的miRNA 的表達(dá)水平與疾病生理狀態(tài)息息相關(guān)［5-9］，并具有易采樣、穩(wěn)定性高、可快速定量等優(yōu)點，已成為臨床生物標(biāo)志物的重要候選來源。例如，肝癌分子診斷試劑盒miRNA7?使用7 種血漿miRNA 作為標(biāo)志物，實現(xiàn)了肝癌的精確診斷［10］。

miRNA 測 序 技 術(shù)（microRNA sequencing，miRNA-seq）是一種基于高通量測序技術(shù)的miRNA序列分析方法，由于準(zhǔn)確度高、檢測范圍廣等優(yōu)勢已成為發(fā)現(xiàn)miRNA 生物標(biāo)志物的重要手段［11-12］。立足于大規(guī)模臨床隊列的血漿樣本，研究者可使用miRNA-seq 對患者組和對照組的血漿樣本中miRNA 進(jìn)行全面的定量，尋找組間差異miRNA 作為潛在的生物標(biāo)志物。因此，高質(zhì)量的miRNA-seq數(shù)據(jù)是生物標(biāo)志物挖掘的必要前提［13-14］。miRNAseq 質(zhì)量控制研究基于人工合成的小RNA 序列或單個生物樣本對不同建庫方法的檢出靈敏度、定量準(zhǔn)確性與可重復(fù)性進(jìn)行評估［13，15］。然而，目前尚缺乏對于miRNA-seq 技術(shù)批次內(nèi)性能的客觀評估及跨批次穩(wěn)定性的質(zhì)量控制研究。與RNA-seq 相似［16］，miRNA-seq 數(shù)據(jù)也面臨著批次間存在系統(tǒng)性差異的問題［11］，即批次效應(yīng)。而生物標(biāo)志物的研究和驗證往往依賴于超大型隊列［5］，樣本的文庫構(gòu)建需要分為多批次進(jìn)行，嚴(yán)重的批次效應(yīng)可能導(dǎo)致生物信號被覆蓋，因此跨批次定量穩(wěn)定性對于miRNA-seq 定量方法是十分必要的。但是miRNAseq 文庫構(gòu)建實驗流程復(fù)雜、文庫質(zhì)量極易受到操作細(xì)節(jié)的影響，傳統(tǒng)的人工操作由于通量低、易出現(xiàn)操作錯誤等限制，難以滿足大型隊列文庫構(gòu)建的需求。因此，亟需一種自動化建庫方法實現(xiàn)高效、跨批次穩(wěn)定的文庫構(gòu)建實驗。

本研究基于自動化工作站建立一種高通量、自動化的血漿文庫構(gòu)建方法，并使用自制的3 種血漿參考物質(zhì)，基于該自動化建庫方法分4 批次產(chǎn)生了32 個miRNAs-seq 文 庫，從miRNA 檢 出 種 類、絕 對定量、相對定量、差異表達(dá)分析等層面評估方法性能及跨批次穩(wěn)定性。

資料和方法

Sciclone?NGSx 自動化液體工作站Sciclone?NGSx 自動工作站（美國PerkinElmer 公司）是一臺可以實現(xiàn)溫度控制與精確移液的液體工作站。該工作站由樣品操作臺、機(jī)械工作臂、溫度控制等功能模塊及一臺計算機(jī)構(gòu)成，可通過編寫程序控制工作站運(yùn)行，模擬人工操作流程進(jìn)行文庫構(gòu)建。該工作站每批次可構(gòu)建96 個文庫。除實驗過程中涉及的試劑配制、部分樣品孵育環(huán)節(jié)需要在PCR 儀上進(jìn)行以外，其余步驟均可在Sciclone?中自動完成。

血漿參考物質(zhì)本研究制備了3 類血漿參考物質(zhì)，分別命名為P10、P11 和PM。其中P10、P11 分別為1 名健康男性志愿者和1 名健康女性志愿者血漿，均為本課題組成員；PM 為2 型糖尿病患者的血漿樣品混合物，來自于上海市市級重大專項 “國際人類表型組計劃（一期）” 項目（Grant No.2017 SHZDZX01）——伴隨西格列他鈉Ⅲ期臨床試驗的多組學(xué)研究［17］。本研究經(jīng)復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院倫理委員會批準(zhǔn)（批件號：BE2050），所有研究對象均志愿參加并簽署知情同意書。血漿制備方法為：使用真空采血管（EDTA-K2 抗凝）采集2 名志愿者靜脈血約50 mL。4 ℃下2 000×g離心10 min，收集上清液至50 mL 離心管；上清液在4 ℃下3 000×g離心10 min，收集上清液至一個新的50 mL 離心管中，獲得血漿。為避免樣本反復(fù)凍融，將血漿分裝至1.5 mL EP 管中（200 μL/管）。液氮速凍，于-80 ℃保存。

血漿miRNA 抽提取200 μL 血漿樣本于4℃下解凍。使用QIAcube 全自動核酸純化系統(tǒng)（凱杰生物科技有限公司）配合miRNeasy Serum/Plasma Advanced Kit 試劑盒（凱杰生物科技有限公司），根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)實驗流程完成miRNA 抽提。25 μL 無酶水洗脫，獲得約22 μL 血漿小RNA 溶液。分裝至2 個1.5 mL EP 管中（11 μL/管），于-80 ℃保存。

自動化miRNA 文庫構(gòu)建使用鉑金埃爾默股份有限公司（PerkinElmer?）的NEXTFLEX?small RNA-seq 試劑盒配合Sciclone?NGSx 自動工作站，以10.5 μL 抽提產(chǎn)物為起始物質(zhì)，使用優(yōu)化后小RNA 文庫構(gòu)建程序完成文庫構(gòu)建實驗。該實驗主要分為7 個環(huán)節(jié)：3′端接頭連接（3′-adapter ligation）、未連接的3′端接頭去除（excess 3′-adapter removel）、未連接的3′端接頭失活（excess 3′-adapter inactivation）、5′端接頭連接（5′-adapter ligation）、逆轉(zhuǎn)錄（reverse transcription）、磁珠純化（beads cleanup）、文庫擴(kuò)增（library amplification）和擴(kuò)增后磁珠純化（beads cleanup）。除以下操作外，均按照說明書操作：在3′端接頭連接和5′端接頭連接環(huán)節(jié)中，將3′端接頭與5′端接頭4 倍稀釋后加入到反應(yīng)體系中；在文庫擴(kuò)增環(huán)節(jié)進(jìn)行25 輪PCR 循環(huán)；在擴(kuò)增前后磁珠純化的環(huán)節(jié)中，取消片段篩選過程，使用磁珠法對逆轉(zhuǎn)錄或文庫擴(kuò)增產(chǎn)物中所有cDNA 分子進(jìn)行全回收。最終共得到12 μL 文庫產(chǎn)物，裝入0.5 mL EP 管中，于-20 ℃保存。

miRNA 文庫質(zhì)檢與測序使用賽默飛世爾科技（中 國）有 限 公 司 的Qubit 熒 光 計（Qubit?3.0 Fluorometer）配 合Qubit?dsDNA HS Assay Kit 試劑盒測量文庫濃度，并計算文庫產(chǎn)量。文庫測序由明碼（上海）生物科技有限公司完成，在Illumina Hiseq 平臺上進(jìn)行雙端150 bp 測序。測序結(jié)果為每條讀段的原始序列，以fastq 格式存儲。

序列比對、計數(shù)與標(biāo)準(zhǔn)化本研究使用exceRpt數(shù)據(jù)預(yù)處理流程［18］對每個文庫的測序數(shù)據(jù)進(jìn)行序列比對與計數(shù)；該流程可根據(jù)給定序列切除3’端接頭序列，過濾掉低質(zhì)量的讀段，去除樣本中比對到核糖體RNA 及外源污染物RNA（NCBI UniVec）的序列。然后將讀段比對到人類參考基因組（Human reference genome build Genome Reference Consortium GRCh38，UCSC hg38）和miRBase version 21，統(tǒng)計每個測序文件中的miRNA 讀段數(shù)目。

在原始讀段計數(shù)基礎(chǔ)上，本研究使用CPM（Count Per Million）法對每個文庫的原始表達(dá)量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化：CPM=（計數(shù)+1）/（總miRNA 讀段數(shù)），并進(jìn)行l(wèi)og2轉(zhuǎn)化。得到用于后續(xù)分析的log2CPM表達(dá)譜。

檢出可重復(fù)性計算方法使用并交比（Jaccard Index）衡量兩樣本之間（差異檢出）miRNA 檢出一致性。并交比是指兩個樣本miRNA 檢出集合的交集與兩樣本miRNA 檢出集合的并集大小之比，公式如下：

其中A 和B 分別代表兩樣本miRNA 檢出集合。并交比指數(shù)的取值范圍是0~1，越接近于1，說明兩樣本miRNA 檢出一致性越高；反之，越接近于0，則說明檢出一致性越低。

結(jié) 果

血漿miRNA 自動化文庫構(gòu)建方法的建立及其性能為了產(chǎn)生高質(zhì)量的血漿miRNA-seq 測序數(shù)據(jù)，便于評估跨批次穩(wěn)定性，本研究對廠商提供的原始商業(yè)化自動化建庫方法進(jìn)行了優(yōu)化。

首先，為了評估自動化建庫工作站產(chǎn)生的miRNA-seq 文庫質(zhì)量，本研究使用人工操作和自動化方法對3 類血漿參考物質(zhì)（P10、P11 和PM）純化得到的小RNA 進(jìn)行平行建庫，共產(chǎn)生87 個miRNAseq 文庫。我們將自動化工作站操作產(chǎn)生的74 個文庫和人工操作產(chǎn)生的13 個文庫分別稱為自動文庫和手動文庫，并從文庫產(chǎn)量（圖1）和對不同生物樣本區(qū)分程度（圖2）對兩類文庫進(jìn)行質(zhì)量評價。一方面，自動文庫的產(chǎn)量極低［（8.5±5.6）ng］，僅為手動建庫文庫產(chǎn)量［（105.6±66.2）ng］的8%。另一方面，對13 個手動文庫進(jìn)行主成分分析，可以觀察到來自相同血漿樣本的文庫聚集在一起，而來自不同樣本的文庫明顯分開（圖2A）。然而，自動文庫卻不能區(qū)分來自相同或不同血漿樣本的文庫（圖2B），這意味著使用自動化工作站得到的文庫測序數(shù)據(jù)噪音過大，甚至超過了不同樣本之間的固有生物學(xué)差異。以上證據(jù)共同表明，廠商提供的原始商業(yè)化自動化建庫程序不能很好地模擬miRNA-seq 手動建庫，所得到的miRNA 文庫質(zhì)量低下，無法滿足需求。

圖1 優(yōu)化前自動化文庫與手動文庫文庫產(chǎn)量對比圖Fig 1 Comparsion of yields between libraries constructed with manual protocol and vendor-provided automated protocols

為解決這一問題，我們對影響文庫質(zhì)量的關(guān)鍵因素進(jìn)行了優(yōu)化（表1），并使用優(yōu)化后的自動化建庫方法構(gòu)建了4 個批次（編號為a、b、c、d）的血漿參考物質(zhì)miRNA 文庫，每批次8 個樣本（3 個P10、3 個P11 和2 個PM 樣本）。與原始自動化程序（vendorprovided automated protocol）相比，優(yōu)化后的自動化程序（optimized automated protocol）文庫產(chǎn)量提升近4 倍（表2）；主成分分析和無監(jiān)督聚類結(jié)果顯示，優(yōu)化后來自相同血漿樣本的不同批次的技術(shù)重復(fù)優(yōu)先聚在一起（圖2C、圖3），而來自不同血漿樣本的文庫清晰地分開，說明優(yōu)化后自動化方法對不同生物樣本的miRNA 表達(dá)差異具有良好的區(qū)分能力，可用于跨批次穩(wěn)定性質(zhì)量評估。

圖3 采用優(yōu)化后自動化建庫方法在不同批次分析血漿參考物質(zhì)的miRNA 表達(dá)矩陣熱圖Fig 3 Heatmap of miRNA expression matrix of plasma reference materials profiled in multiple batches with the optimized automated library construction protocol

表2 優(yōu)化后自動化文庫質(zhì)量基本情況Tab 2 Quality overview of the libraries constructed with optimized automated protocol

圖2 優(yōu)化后自動化建庫方法對不同生物樣本具有更好的區(qū)分能力Fig 2 Optimized automated library construction method demonstrated improved power in discriminating biologically distinct groups of samples

表1 自動化建庫程序優(yōu)化參數(shù)總結(jié)表Tab 1 Parameter optimizations and their impacts on library quality

評估自動化方法miRNA 檢出的跨批次穩(wěn)定性同類樣本miRNA 檢出的穩(wěn)定性是定量結(jié)果可靠的前提。因此，我們從miRNA 檢出數(shù)目和檢出種類兩個層面對miRNA檢出的跨批次穩(wěn)定性進(jìn)行評估（圖4A）。

3類血漿樣本miRNA檢出種類基本情況如（圖4B）所示。不同批次的文庫中檢出的miRNA 數(shù)目基本穩(wěn)定，約 為300~400 種。P10、P11、PM 樣 本 檢 出 的miRNA 種類分別為337±44、380±54 和322± 25。

為評估m(xù)iRNA 檢出種類在批次間的一致性，我們使用并交比（Jaccard Index）定量描述兩次實驗中檢出的miRNA 種類的相似度。通過計算所有樣本任意兩兩配對（C232次比較）檢出種類的并交比，對跨批次的技術(shù)重復(fù)之間的并交比與同批次的不同技術(shù)重復(fù)之間的并交比進(jìn)行比較（圖4A）。首先，同類血漿樣本的不同技術(shù)重復(fù)之間的檢出一致性顯著高于不同血漿樣本之間檢出一致性（圖4C），說明不同血漿樣本中表達(dá)的miRNA 種類具有一定差異；對于同種血漿參考樣本而言，跨批次技術(shù)重復(fù)之間的并交比與同批次內(nèi)技術(shù)重復(fù)之間并交比無統(tǒng)計學(xué)差異（圖4D），表明本研究中產(chǎn)生的4 批文庫在miRNA 檢出層面無明顯的批次效應(yīng)。

圖4 評估m(xù)iRNA 檢出的跨批次穩(wěn)定性Fig 4 Cross-batch concordance of miRNA detection

評估m(xù)iRNA 絕對定量的跨批次穩(wěn)定性技術(shù)重復(fù)間絕對表達(dá)水平的一致性是定量可靠性的前提。為評估m(xù)iRNA 絕對定量的跨批次穩(wěn)定性，我們使用兩樣本miRNA 表達(dá)向量的皮爾森相關(guān)系數(shù)（Pearson correlation coefficient）作為衡量兩個樣本之間miRNA 檢出絕對定量一致性的指標(biāo)，對于每種血漿樣本，我們對跨批次樣本間與同批次樣本間的絕對定量相關(guān)系數(shù)進(jìn)行t檢驗（圖5A）。P10（P=0.26）和P11（P=0.24）樣本的批次間一致性與批次內(nèi)一致性差異無統(tǒng)計學(xué)意義，而對于PM（P=0.02），批次內(nèi)相關(guān)系數(shù)略高于批次間，可能與PM 樣本技術(shù)重復(fù)數(shù)目少有關(guān)。同一批次不同技術(shù)重復(fù)之間的一致性與不同批次技術(shù)重復(fù)之間的一致性差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.80），我們計算得到所有樣本兩兩間相關(guān)系數(shù)矩陣，并基于該相關(guān)系數(shù)矩陣進(jìn)行無監(jiān)督層次聚類。結(jié)果顯示：來自相同血漿的樣本優(yōu)先聚類（圖5B），而來自相同批次的樣本無明顯聚集。這表明批次定量差異具有隨機(jī)性，且小于不同生物學(xué)樣本間的固有差異。本研究中產(chǎn)生的4 批文庫在絕對定量層面具有良好的跨批次穩(wěn)定性。

圖5 評估m(xù)iRNA 絕對定量的跨批次一致性Fig 5 Cross-batch concordance of absolute-expression measurements

評估兩樣本間相對定量的跨批次穩(wěn)定性絕對定量一致性僅能表明一種方法對單類生物樣本具有良好的測量可重復(fù)性，而生物標(biāo)志物的篩選往往依賴于穩(wěn)定、可靠地檢測出不同生物樣本組間miRNA 表達(dá)水平差異。因此，我們對兩組生物樣本間miRNA 相對定量的可重復(fù)性進(jìn)行評估。

使用limma 軟件包分別對3 個批次文庫的P10樣本與P11 樣本（P10/P11）進(jìn)行差異表達(dá)分析：每個批次內(nèi)P10 樣本和P11 樣本的3 個技術(shù)重復(fù)進(jìn)行差異表達(dá)分析，共進(jìn)行3 次差異表達(dá)分析，得到的log2FC 向量表示該批次兩樣本間的相對表達(dá)水平。我們僅使用了a、c 和d 3 個批次的文庫，批次b 只有2 個P10 樣本而沒有被納入）。我們使用兩個批次log2FC 向量之間的皮爾森相關(guān)系數(shù)衡量批次間相對定一致性。3 個批次兩兩之間的相關(guān)系數(shù)的分別為0.69、0.75 和0.79（圖6），表明P10/P11 樣本的批次間相對定量一致性較好。

圖6 跨批次P10/P11 相對定量一致性Fig 6 Cross-batch concordance of relative-expression between P10 and P11 samples

評估兩樣本差異表達(dá)分析的跨批次穩(wěn)定性為評估檢測組間差異表達(dá)miRNA 的可靠性，我們評估了批次間差異表達(dá)結(jié)果的一致性。本研究使用limma 包分別鑒定了每個批次P10 樣本和P11 樣本之間的差異表達(dá)miRNA［P<0.05，且|log2FC|>log2（1.5）］。

每個批次分別檢測到63、68 和61 個差異表達(dá)miRNA（圖7A），共檢測到44 個上調(diào)miRNA，其中27 個（61.3%）可以在至少兩個批次中檢出；共檢出49 個下調(diào)miRNA，其中33 個（67.3%）可以在至少兩個批次中被檢出（圖7B），說明生物樣本之間跨批次差異表達(dá)分析結(jié)果具有較好的一致性。

圖7 跨批次P10/P11 差異表達(dá)miRNA 一致性評估Fig 7 Cross-batch concordance of differentially expressed miRNAs between P10 and P11 samples

討 論

miRNA-seq 技術(shù)可以不基于任何先驗知識而描繪樣本中miRNA 組學(xué)全貌，且測序成本不斷降低，從而為miRNA 生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)提供有力的工具。產(chǎn)生上千例樣本的大型隊列miRNA-seq 數(shù)據(jù)需要高效、性能可靠的文庫構(gòu)建方法。目前已有多種自動化液體工作站，可適配小RNA 文庫構(gòu)建試劑盒、實現(xiàn)自動化文庫構(gòu)建。但是，自動化建庫系統(tǒng)受到操作精細(xì)程度與靈活程度的限制，難以模擬人工建庫操作流程，而自動化平臺所構(gòu)建的文庫質(zhì)量是否與人工建庫可比又是自動化建庫方法必須回答的問題。綜上，在將自動化文庫構(gòu)建方法應(yīng)用于大規(guī)模臨床樣本測試之前，需要建立系統(tǒng)的質(zhì)量評估方法對其進(jìn)行性能驗證。

跨批次性能評估方法的建立目前對miRNA定量方法的質(zhì)量評估主要基于合成RNA 片段與單個生物樣本的miRNA 定量可重復(fù)性、準(zhǔn)確性、敏感性 和特異性［15，19］。miRQC 研 究［20］與SEQC 研究［13］使用兩類生物樣本參考物質(zhì)（sample A 和sample B），不僅評估了絕對定量的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性，而且對樣本間相對定量、差異表達(dá)的可靠性進(jìn)行評估，表明：（1）檢測不同生物樣本間差異的能力是評估一種定量方法的重要指標(biāo)［13，19］；（2）使用不同類型的參考樣本或從不同的評估角度出發(fā)，方法評估的結(jié)果與結(jié)論可能完全不同，因此需要基于與待測樣本種類相同的參考樣本，建立適合的質(zhì)量評估方法［13，20］。

本研究建立了一套基于3 類真實的血漿參考物質(zhì)的性能評估方法，以參考物質(zhì)之間miRNA 表達(dá)水平的相對差異作為主要質(zhì)控指標(biāo)來評估定量方法的性能。3 類樣本分別來自于一名健康男性、一名健康女性志愿者和糖尿病患者混合血漿，以模擬臨床隊列中不同性別和健康狀態(tài)的群體。基于該套參考樣本集，不僅可以考察單一樣本絕對定量可重復(fù)性、兩樣本之間相對定量和差異表達(dá)的可靠性，還可以考察定量方法對不同種類生物學(xué)差異的區(qū)分能力。圖2C 主成分分析結(jié)果顯示，PC1 可以區(qū)分不同性別的樣本，PC2 可以區(qū)分糖尿病和健康人的樣本，提示優(yōu)化后自動化建庫方法可能對miRNA表達(dá)的性別差異及疾病狀態(tài)差異具有良好的區(qū)分度。該思路對于miRNA 質(zhì)控領(lǐng)域具有參考價值。

此外，當(dāng)前miRNA 質(zhì)控研究主要關(guān)注跨平臺、跨實驗室的性能比較［15，19］，對跨批次穩(wěn)定性卻鮮有研究。本研究使用相同的參考樣本集連續(xù)進(jìn)行4 個批次的文庫構(gòu)建實驗，每個批次內(nèi)同類血漿樣本設(shè)計2~3 個技術(shù)重復(fù)。通過設(shè)計批次內(nèi)和批次間技術(shù)重復(fù)，并以批次內(nèi)技術(shù)重復(fù)一致性為基準(zhǔn)，從而客觀、有效地評估該定量方法的跨批次一致性。本研究提供了一種跨批次穩(wěn)定性的評估方法，對于大型隊列數(shù)據(jù)產(chǎn)生平臺的質(zhì)量評估具有參考價值。感興趣的讀者可以從作者處免費獲取基于三類參考物質(zhì)的miRNA 表達(dá)譜數(shù)據(jù)。

血漿miRNA 自動化文庫構(gòu)建方法的建立本研究通過上述基于3 類真實血漿參考物質(zhì)的跨批次一致性評估方法，以參考物質(zhì)之間miRNA 表達(dá)水平的相對差異作為主要質(zhì)控指標(biāo)和優(yōu)化目標(biāo)，有效地發(fā)現(xiàn)出商業(yè)產(chǎn)品中所存在的且之前不為廠商所認(rèn)識到的嚴(yán)重問題：在200 μL 血漿miRNA 文庫構(gòu)建實驗中，使用廠商提供的自動化程序建庫與人工操作的文庫質(zhì)量具有很大的差距（僅為手動建庫文庫產(chǎn)量的8%）；更為嚴(yán)重的是，由此導(dǎo)致該方法不能全面地刻畫出每種生物學(xué)樣本獨特的miRNA 表達(dá)特征，因而無法捕捉到不同類樣本間內(nèi)在的生物學(xué)差異。因此需要確定廠商提供的自動化流程中導(dǎo)致文庫質(zhì)量降低的關(guān)鍵因素并加以修正。

為此，本研究設(shè)計了一系列探索試驗，發(fā)現(xiàn)并確證了自動化建庫流程中影響文庫質(zhì)量的關(guān)鍵因素，主要涉及3 個方面：（1）在磁珠純化環(huán)節(jié)中，取消去除長片段的磁珠篩選步驟，可以使得文庫產(chǎn)量提高1.9 倍（表1）。這意味著對于缺乏長片段核酸分子的血漿樣本而言，多余的磁珠篩選環(huán)節(jié)不但不能通過棄掉長片段富集目標(biāo)產(chǎn)物（插入miRNA 序列的短片段），反而引起目標(biāo)產(chǎn)物（短片段）的丟失。然而，對于細(xì)胞樣本等富含長片段分子的樣本而言，磁珠篩選環(huán)節(jié)對于富集目標(biāo)產(chǎn)物又是非常必要的。因此針對特定樣本的特征動態(tài)調(diào)整實驗方案非常必要；（2）在未連接的3’端接頭去除環(huán)節(jié)，通過調(diào)整ADS、Isopropanol 試劑體積及Elution buffer 種類，使之與人工建庫實驗條件保持一致，可以使得文庫產(chǎn)量提升5 倍（表1）。表明在自動化方法的開發(fā)過程中，對于任何操作細(xì)節(jié)的變動都需要非常謹(jǐn)慎，一些細(xì)微的差異即有可能引起產(chǎn)物的隨機(jī)丟失，導(dǎo)致自動化文庫質(zhì)量大大降低，無法捕捉到樣本miRNA 轉(zhuǎn)錄組中的全面信息；（3）在未連接的3’端接頭失活、5’接頭連接及逆轉(zhuǎn)錄環(huán)節(jié)，將原自動化流程中的孵育條件（在工作站內(nèi)溫控模塊孵育）與人工實驗中的孵育條件（在PCR 儀中孵育）保持一致，可以使得文庫產(chǎn)量提高1.4 倍，RNA 檢出種類提高1.1 倍（表1）。表明建庫實驗中孵育過程的溫度控制對于反應(yīng)效率非常重要，在儀器開發(fā)過程中需要特別關(guān)注溫控裝置的性能驗證。本研究揭示了自動化建庫中影響文庫質(zhì)量的關(guān)鍵因素，對于自動化建庫方法的開發(fā)具有借鑒意義。盡管優(yōu)化后方法信噪比可以達(dá)到手動文庫的水平，但自動建庫文庫產(chǎn)量與手動文庫仍有約3 倍差距，說明該自動化操作方法的細(xì)節(jié)還有優(yōu)化的空間。

綜上所述，本研究以重要實際需求為導(dǎo)向，針對商業(yè)化的自動化血漿miRNA-seq 文庫構(gòu)建過程中所存在的嚴(yán)重質(zhì)量問題而展開。通過采用多類血漿參考物質(zhì)，并以參考物質(zhì)之間miRNA 表達(dá)水平的相對差異作為主要質(zhì)控指標(biāo)和優(yōu)化目標(biāo)，發(fā)現(xiàn)出商業(yè)產(chǎn)品中所存在的嚴(yán)重問題。為解決該問題，我們建立了一種高通量、自動化miRNA 文庫構(gòu)建方法，可跨批次穩(wěn)定地產(chǎn)生大批量血漿樣本的miRNA 數(shù)據(jù)，適用于大型臨床隊列血漿miRNA 文庫構(gòu)建試驗。目前復(fù)旦大學(xué)生科院人類表型組研究院已將本方法應(yīng)用于國際人類表型組計劃，產(chǎn)生了多個隊列共5 000 多個血漿樣本的miRNA 表達(dá)譜數(shù)據(jù)，為生物學(xué)和基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究提供了有力的技術(shù)支持。

作者貢獻(xiàn)聲明么欣彤 論文構(gòu)思、撰寫和修訂，數(shù)據(jù)產(chǎn)生和分析，繪制圖表。孫善月 數(shù)據(jù)產(chǎn)生，分析結(jié)果確認(rèn)。劉雅晴 論文修訂，分析結(jié)果確認(rèn)。石樂明，鄭媛婷 課題構(gòu)思和修訂。

利益沖突聲明所有作者均聲明不存在利益沖突。