石 林 翟長文 袁存存 王紓宜

（復(fù)旦大學(xué)附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院病理科 上海 200031）

鼻腔鼻竇黏膜黑色素瘤（sinonasal mucosal melanoma，SNM）是一種非常少見的神經(jīng)外胚層來源的腫瘤，在鼻腔鼻竇惡性腫瘤中的占比不到10%［1］。由于解剖部位隱匿，且以鼻塞和鼻出血等非特異性癥狀為主，SNM 患者確診時多在晚期，5年生存率為20%~40%［2］，并且約有半數(shù)的病例病情復(fù)發(fā)［3-4］。完整的手術(shù)切除仍是最佳治療方式，近幾年靶向治療和免疫治療取得一定的效果，然而獲得性耐藥不可避免地發(fā)生，一部分患者仍然忍受著腫瘤進(jìn)展所帶來的痛苦和生命威脅，因此尋找新的治療靶點(diǎn)和預(yù)后判斷指標(biāo)仍是非常必要的。

β-連環(huán)蛋白（β-catenin）是WNT/β-catenin 信號通路的核心成分，已在骨肉瘤、乳腺癌等多種腫瘤中證實該通路的異常激活促進(jìn)了腫瘤的發(fā)生發(fā)展［5］。C-MYC是β-catenin 的下游靶基因［6］，研究表明，皮膚黑色素瘤中c-myc 蛋白的過表達(dá)可促進(jìn)血管生成擬態(tài)和線性程序性壞死，加速腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移［7］，然而在黏膜黑色素瘤中c-myc 的表達(dá)是否與預(yù)后相關(guān)仍未可知。p16 蛋白由CDKN2A基因編碼，作為細(xì)胞周期通路的負(fù)調(diào)控子使細(xì)胞周期停滯，抑制細(xì)胞增殖，其表達(dá)缺失通常被認(rèn)為具有促進(jìn)腫瘤形成與發(fā)展的作用，但在神經(jīng)母細(xì)胞瘤、卵巢癌、前列腺癌等腫瘤中p16 過表達(dá)卻與不良預(yù)后相 關(guān)［8］。有 研 究［9］發(fā) 現(xiàn) 活 化 的β-catenin 可 以 抑 制p16 的表達(dá)，但在人類二倍體成纖維細(xì)胞中過表達(dá)的c-myc 可誘導(dǎo)p16 的表達(dá)［10］。目前關(guān)于β-catenin、c-myc 表達(dá)臨床意義的研究主要集中在皮膚黑色素瘤，在SNM 的表達(dá)情況及臨床意義尚不明確，同時在SNM 中β-catenin、c-myc 與p16 的 表 達(dá) 是 否 具 有相關(guān)性仍需探討。本研究旨在探討β-catenin、c-myc和p16 蛋白在SNM 中的表達(dá)情況、臨床意義以及三者間的相關(guān)性，以期對SNM 可能的病因機(jī)制以及預(yù)后判斷提供參考，并通過回顧相關(guān)文獻(xiàn)探討cmyc 作為治療靶向位點(diǎn)的前景。

資料和方法

研究對象收集復(fù)旦大學(xué)附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院病理科2006 年1—12 月間確診的具有完整資料的原發(fā)性SNM 石蠟組織標(biāo)本85 例。所有患者均未接受放化療和分子靶向治療。同時收集患者年齡、性別、原發(fā)部位、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況等臨床病理資料。

隨訪患者的隨訪資料通過電話咨詢獲取，總生存期（overall survival，OS）的計算從患者首診日至死亡日或隨訪終止，無病生存期（disease-free survival，DFS）的計算從患者手術(shù)日至出現(xiàn)復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移、患者死亡或隨訪終止。隨訪至2020 年10 月31日，最短隨訪時間2 個月，最長99 個月，中位隨訪時間30 個月。經(jīng)本院倫理委員會批準(zhǔn)，免除患者知情同意。

免疫組化組織經(jīng)3.7%中性甲醛液固定，石蠟包埋，以3 μm 厚度進(jìn)行連續(xù)切片，常規(guī)脫蠟。用BenchMark Ultra 羅氏免疫組織化學(xué)儀進(jìn)行染色，采用Multimer 法進(jìn)行檢測。所有抗體包括兔抗人βcatenin 單克隆抗體（克隆號E247，上海基因科技公司，稀釋度1∶100）、兔抗人c-myc 多克隆抗體（克隆號EP121，福州邁新生物技術(shù)公司，稀釋度1∶100）、鼠抗人p16 單克隆抗體（克隆號MX007，福州邁新生物技術(shù)公司，稀釋度1∶100）。所有指標(biāo)同時設(shè)置陽性、陰性對照組織。β-catenin、c-myc、p16 均使用二氨基聯(lián)苯胺（DAB）對比顯色，部分樣本由于黑色素過多干擾染色結(jié)果的判定而采用Red 對比顯色。

染色結(jié)果判定由兩位資深的病理醫(yī)師在光學(xué)顯微鏡下分別評估各免疫組織化學(xué)指標(biāo)的染色強(qiáng)度和范圍后取中值應(yīng)用于以下判定方法。βcatenin、c-myc 表達(dá)情況判定方法［11］：分別對染色強(qiáng)度和染色范圍進(jìn)行評分，染色強(qiáng)度評分為：0（未染色）；1（弱）；2（中等）；3（強(qiáng)）；陽性細(xì)胞范圍評分為：1（<10%）；2（11%~50%）；3（51%~75%）和4（>75%）。按染色強(qiáng)度×陽性細(xì)胞范圍評分，分?jǐn)?shù)≥4計為陽性。參考相關(guān)文獻(xiàn)［12-13］，p16 染色結(jié)果判讀：將染色范圍<20% 計為陰性，20%≤染色范圍≤70%計為弱陽性，染色范圍>70%計為強(qiáng)陽性。

統(tǒng)計學(xué)分析計量資料采用±s表示，所有數(shù)據(jù)采用SPSS 26.0 統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行分析，顯著水平設(shè)定為P<0.05。分類變量間的相關(guān)性分析采用χ2檢驗、Pearson 檢驗，二分類觀察結(jié)果的分析采用Logistic 回歸模型，生存分析采用多因素Cox 回歸分析和Kaplan-Meier 生存曲線法。

結(jié) 果

一般情況男性41 例，女性44 例，年齡26~86歲，中位年齡62 歲，平均年齡61.8 歲。臨床主要癥狀為鼻塞、鼻出血。原發(fā)部位為鼻腔的39 例（45.9%）、鼻竇的9 例（10.6%），同時累及鼻腔和鼻竇的37 例（43.5%）。依據(jù)AJCC 的TNM 分期［14］，Ⅲ、ⅣA、ⅣB、ⅣC 期患者分別占35.3%（30/85）、47.0%（40/85）、15.3%（13/85）和2.4%（2/85）。85例患者中發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的有54 例，占63.5%。85例SNM 患者中單純接受手術(shù)治療的有35 例（41.2%），術(shù)后聯(lián)合放療的有21 例（24.7%），術(shù)后聯(lián)合化療的有6 例（7.0%），術(shù)后聯(lián)合放化療的有23 例（27.1%）。

SNM 中β-catenin、c-myc 和p16 的表達(dá)情況βcatenin 染色主要定位于腫瘤細(xì)胞胞膜和/或胞漿（圖1A），個別病例可見細(xì)胞核染色（圖1B）。βcatenin 的陽性率為77.6%（66/85），其中3 例（4.5%，3/66）出現(xiàn)胞核定位。c-myc 染色定位于腫瘤細(xì)胞胞核（圖1C），c-myc 的陽性率為68.2%（58/85）。p16 染色定位于腫瘤細(xì)胞胞核和/或細(xì)胞質(zhì)（圖1D），p16 的 陽 性 率 為64.7%（55/85），強(qiáng) 陽 性 占49.4%（42/85），弱陽性占15.3%（13/85），陰性率為（視為表達(dá)缺失）35.3%（30/85）。對比p16 在黏膜內(nèi)痣的表達(dá)為不規(guī)則或局灶染色，我們研究中的強(qiáng)陽性病例均表現(xiàn)為彌漫性強(qiáng)細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)染色。

圖1 SNM 中免疫組織化學(xué)的表達(dá)情況（×200，Multimer 法）Fig 1 Expression of immunohistochemistry in SNM（×200，Multimer）

SNM 中β-catenin、c-myc 和p16 的 表 達(dá) 與 臨 床病理學(xué)特征的關(guān)系統(tǒng)計分析顯示β-catenin 和p16陽性與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)（P=0.028，P=0.001），與患者年齡、性別、腫瘤部位、臨床分期等其他臨床病理學(xué)指標(biāo)無相關(guān)性。c-myc 陽性組的女性患者多于男性患者（P=0.014），淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率高于低表達(dá)組（P=0.003），c-myc 的表達(dá)與年齡、腫瘤原發(fā)灶累及部位、TNM 分期無明顯相關(guān)性。詳見表1。

表1 SNM 患者的臨床病理特征及其與β-catenin、c-myc、p16 表達(dá)的關(guān)系Tab 1 Clinicopathological parameter and the relationship with β-catenin，c-myc，p16 expression of SNM patients

SNM 中β-catenin、c-myc 和p16 的 表 達(dá) 與 生 存預(yù)后的關(guān)系β-catenin 陽性組的中位OS 和中位DFS 分 別 為28 個 月 和16 個 月，3 年、5 年 生 存 率 為37.9%和19.7%，生存分析顯示β-catenin 表達(dá)與生存率未見明顯相關(guān)性（P=0.367，圖2A），但在βcatenin 陽性組中β-catenin 胞核表達(dá)患者的5 年生存率要顯著低于β-catenin 胞漿胞膜表達(dá)的患者（P=0.007，圖2B）。c-myc 陽性組的中位OS 和中位DFS分別為27 個月和12 個月，均低于c-myc 陰性組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P均<0.05）。c-myc 陽性組的3 年和5 年生存率分別為26.9%和15.4%，低于c-myc 陰性組的54.5%和33.3%（P=0.047，P=0.015；圖2C）。p16 強(qiáng)陽性組的中位OS 和中位DFS 分別為24.5 個月和11 個月，3 年、5 年生存率為23.8%和9.5%，顯著高于陰性組和弱陽性組（P=0.024、0.006，圖2D）。p16 陰性組與弱陽性組的生存率有差異，但無統(tǒng)計學(xué)意義。

β-catenin、c-myc、p16 三者表達(dá)的相關(guān)關(guān)系βcatenin 的表達(dá)與c-myc 的表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.234，P=0.027，表2）。p16 的表達(dá)與β-catenin、c-myc 的表達(dá)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.211、0.091）。

表2 β-catenin 與c-myc 表達(dá)的相關(guān)關(guān)系Tab 2 Correlation between β-catenin and c-myc expression

討 論

SNM 占所有黏膜黑色素瘤（mucosal melanoma，MM）的31%~55%［15-16］。已知皮膚惡性黑色素瘤（以下簡稱 “皮膚惡黑” ）和紫外線暴露的強(qiáng)度相關(guān)，而黏膜惡黑相關(guān)的環(huán)境危險因素尚不明確［17-18］。國內(nèi)關(guān)于β-catenin、c-myc、p16 的臨床病理相關(guān)性報道主要聚焦于皮膚惡黑，在SNM 中有待進(jìn)一步研究。我們通過對β-catenin、c-myc、p16 在85 例SNM 表達(dá)情況分析，探討其與臨床病理的相關(guān)性以及可能的預(yù)后意義，并通過回顧相關(guān)文獻(xiàn)簡要討論c-myc 作為SNM 的靶向治療位點(diǎn)的可能。

在我們的研究中，β-catenin 在66 例（77.6%）SNM 患者中表達(dá)，這與Xu 等［11］在肢端黑色素瘤中檢出率（72%）相近［11］。我們還觀察到β-catenin 的陽性表達(dá)與患者的生存率無統(tǒng)計學(xué)相關(guān)（P=0.367，圖2A），但與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)（P=0.028）。在肢端黑色素瘤觀察到β-catenin 的陽性表達(dá)與生存率降低和預(yù)后不良相關(guān)［11］。由于β-catenin 的胞核表達(dá)通常被認(rèn)為與WNT 通路的激活有關(guān)［9］，因此我們在陽性組分別統(tǒng)計了β-catenin 不同定位下的表達(dá)情況，并利用Kaplan-Meier 生存曲線法進(jìn)一步對β-catenin 胞核表達(dá)和β-catenin 胞膜及胞漿表達(dá)的生存率進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)β-catenin 胞核表達(dá)的生存率要顯著低于胞膜和胞漿表達(dá)組（P=0.007，圖2B），然而在皮膚惡黑中，Chien 等［19］發(fā)現(xiàn)β-catenin 胞核表達(dá)水平的增高與生存率提高有關(guān)。這種差異是發(fā)病部位使然還是因樣本量小所致，尚需要收集樣本進(jìn)一步探討。

圖2 β-catenin、c-myc、p16 的表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系Fig 2 Relationship between the expression of β-catenin，c-myc，p16 and prognosis

早在2001 年就有研究發(fā)現(xiàn)在晚期和轉(zhuǎn)移性皮膚惡黑中出現(xiàn)c-myc 擴(kuò)增［20］，Lin 等［21］發(fā)現(xiàn)c-myc 過表達(dá)導(dǎo)致黑色素瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力顯著增強(qiáng)并與不良預(yù)后相關(guān)。在我們的研究中c-myc 均表達(dá)于細(xì)胞核，呈陽性或強(qiáng)陽性染色。c-myc 陽性組的患者生存率低于c-myc 陰性組（P值均<0.05），且陽性組的無病生存期較陰性組顯著縮短，腫瘤的淋巴轉(zhuǎn)移率顯著增加，與既往研究結(jié)果相符［7，21］，提示cmyc 表達(dá)可以作為預(yù)測SNM 預(yù)后和轉(zhuǎn)移的生物學(xué)指標(biāo)。鑒于之前提到c-myc 是β-catenin 的下游分子，我們進(jìn)一步分析了兩者的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)c-myc 的表達(dá)與β-catenin 的表達(dá)的確呈正相關(guān)（P=0.027），這意味著在SNM 中c-myc 的過表達(dá)可能是通過βcatenin 調(diào)節(jié)，當(dāng)然這仍需進(jìn)一步的研究證明。

一項對p16 免疫組化在黑色素細(xì)胞病變應(yīng)用的Meta 分析［22］顯示原發(fā)性皮膚浸潤性黑色素瘤中p16免疫組化陽性病例為12%~93%，本研究中p16 的表達(dá)的陽性率為64.7%，表達(dá)缺失（陰性）率為35.3%，且p16 陽性組患者腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率更高（P=0.001）。p16 在腫瘤中的表達(dá)受腫瘤類型、遺傳異常、癌基因激活和相關(guān)腫瘤抑制因子變化等諸多因素的影響。在皮膚黑色素瘤中p16 表達(dá)缺失被視為預(yù)后不良的標(biāo)志物［22］，然而我們的研究中p16強(qiáng)陽性患者的5 年生存率高于弱陽性組和陰性組（P=0.024 和0.006，圖2D），這與皮膚黑色素瘤中的結(jié)果截然相反。對此我們認(rèn)為有兩種可能：首先，p16表達(dá)缺失通常由p16 失活的遺傳改變（如啟動子甲基化、純合丟失）造成，但如果是點(diǎn)突變引起的p16基因失活，有可能不會導(dǎo)致p16 表達(dá)缺失，甚至可能反饋性地增加p16 的表達(dá)水平［24］，因此SNM 中p16蛋白部分強(qiáng)表達(dá)可能是由于p16 蛋白功能失活的反饋性調(diào)節(jié)所致。其次，在宮頸癌和口咽鱗癌中p16過表達(dá)往往與人乳頭狀病毒（human papilloma virus，HPV）感染相關(guān)，且往往預(yù)示著更好的預(yù)后［25］，而在HPV 陰性腫瘤［26］中p16 的過表達(dá)可能由環(huán)境危險因素通過未知的反饋回路誘導(dǎo)，但其對細(xì)胞增殖的抑制作用被其他分子事件（如c-myc、細(xì)胞周期蛋白1 的過表達(dá)）所抵消。在本研究中c-myc的過表達(dá)與預(yù)后不良強(qiáng)相關(guān)，所以我們推測盡管p16 在SNM 中過表達(dá)，但其細(xì)胞周期抑制功能被cmyc 強(qiáng)大的致癌功能所抵消，雖然本研究中p16 與c-myc 的表達(dá)之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.091），但鑒于P值比較接近0.05，因而我們認(rèn)為不能完全否定這種可能?？傊?，SNM 中p16 表達(dá)失調(diào)是由癌基因介導(dǎo)還是遺傳異常導(dǎo)致仍需進(jìn)一步的分子實驗探索。

現(xiàn)有的靶向藥物如c-Kit 抑制劑和免疫藥物如PD-1/PD-L1 抑制劑對SNM 的治療效果較為有限［26-27］，實驗表明針對c-myc 靶點(diǎn)治療腫瘤具有較好的效果［29］。最近，溴結(jié)構(gòu)域和額外末端結(jié)構(gòu)域（bromodomain and extrater minal domain，BET）家族蛋白已成為不同腫瘤中c-myc 表達(dá)的有效調(diào)節(jié)劑。用藥物樣分子抑制多發(fā)性骨髓瘤中的BET 會導(dǎo)致c-myc 表達(dá)和細(xì)胞死亡顯著下降［30］。Struntz等［31］證明使用小分子KI-MS2-008 穩(wěn)定MAX：MAX同型二聚體會導(dǎo)致myc 降解，并在體外和體內(nèi)導(dǎo)致MYC 轉(zhuǎn)錄基因程序的減弱。另外在過表達(dá)myc 的癌細(xì)胞中用谷氨酰胺酶抑制劑治療觀察到細(xì)胞增殖下降［32］，這表明c-myc 靶向治療可以使某些惡性腫瘤患者獲益。

綜上所述，我們的研究結(jié)果表明β-catenin、cmyc、p16 陽性表達(dá)是SNM 患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的重要預(yù)測因子，c-myc 陽性、p16 強(qiáng)陽性表達(dá)可以作為判斷SNM 生存率低的重要參考標(biāo)志物，c-myc 靶向治療是未來SNM 治療中的一個選擇。

作者貢獻(xiàn)聲明石林 論文構(gòu)思和撰寫，實驗實施，數(shù)據(jù)采集和統(tǒng)計分析。翟長文，袁存存 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析，論文修訂。王紓宜 研究指導(dǎo)，論文修訂。

利益沖突聲明所有作者均聲明不存在利益沖突。