楊安納，龐德欽，周以斯，楊潔，楊東升，吳杰，孟勝利，王澤鋆，郭靖，申碩

武漢生物制品研究所有限責任公司，湖北 武漢 430060

2019年12月以來，由新型冠狀病毒引起的新型冠狀病毒肺炎迅速在全球蔓延，隨后出現(xiàn)多種突變株。從2021年11月9日在南非采集，并于2021年11月24日向WHO 報告的樣本中，首次確認了B.1.1.529 突變株［1-2］。WHO 于 2021年11月26日將該突變株列為第5 種“密切關注突變體”（variant of concern，VOC），以希臘字母命名法命名為Omicron（奧密克戎）［3］。截至2022年3月中旬，在全球范圍內(nèi)每日新增的140 多萬患者中，超過99%的感染均由Omicron 突變株引起，該毒株已成為全球超過150個國家或地區(qū)的絕對優(yōu)勢流行毒株；較以前的突變株更容易感染年輕人和中年人［4］，且具有更強的傳播能力［5］，在肺部的復制性低于Delta 突變株和原型株［6-7］。目前有研究表明，多種技術路線研制疫苗的免疫血清及多種突變株康復者血清，對Omicron 株新型冠狀病毒的中和作用均明顯下降［8-13］。

由于該突變株免疫逃逸嚴重，多款疫苗針對其保護效力下降［14-18］。因此研發(fā)針對該毒株的改良型疫苗是遏制其傳播的手段之一。

相比于原型株的刺突蛋白基因序列，Omicron株新型冠狀病毒的刺突蛋白至少存在30 個氨基酸改變，與以往的新型冠狀病毒變異株相比，該突變株具有更高的突變程度［19-20］。其中在69、70 位缺失6 個堿基 5′-ACATGT-3′，214 位增加 9 個堿基 5′-GCCAGAAGA-3′。因此針對這2 處位點設計2 對引物，可通過RT-PCR 區(qū)分Omicron 株與其他新型冠狀病毒。

本研究將RT-PCR 法應用于Omicron 株新型冠狀病毒滅活疫苗（Vero 細胞）原液的特異性鑒別試驗，并對其進行了驗證。

1 材料與方法

1.1 疫苗原液 原型株新型冠狀病毒滅活疫苗（Vero 細胞）原液（批號：S202103Y001，簡稱原型株原液）、Omicron 株新型冠狀病毒滅活疫苗（Vero 細胞）原液（批號：202201Y001、202201Y002、202201-Y003、202201Y004、202202Y005、202202Y006，簡 稱Omicron 株原液）、Beta 株新型冠狀病毒滅活疫苗（Vero 細胞）原液（批號：202112Y001B，簡稱 Beta 株原液）、Delta 株新型冠狀病毒滅活疫苗原液（Vero 細胞）（批號：202108Y001，簡稱 Delta 株原液）均由武漢生物制品研究所有限責任公司提供。

1.2 主要試劑及儀器 RNA 抽提試劑盒（QIAamp Viral RNA Mini Kit）購自德國 QIAGEN 公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（PrimeScriptⅣ1st strand cDNA Synthesis Mix）購自日本 TaKaRa 公司；Q5 High-Fidelity 2 ×Master Mix 購自美國 NEB 公司；DNA marker 購自美國 Thermo Fisher Scientific 公司；RNase free dH2O、Agarose G-10 購自上海碧云天生物技術有限公司；PCR 儀購自美國Applied Biosysteme 公司；凝膠成像系統(tǒng)購自英國Syngene 公司。

1.3 引物設計及合成 根據(jù)GIAIDS 數(shù)據(jù)庫中新型冠狀病毒Omicron 株基因組序列（EPI_ISL_402124），應用 Snapgene 軟件設計 6 條引物，OSTF1：5′-CTTGGTTCCATGTTATCTCTGG-3′；OS1R：5′-CCCTGAGGGAGATCTTCTGGC-3′；OSTF3：5′-ATAGTGCGTGAGCCAGAAGA-3′；S2R：5′-CCTGAAGAAGAATCACCAGGAGTC-3′；S1F：5′-CCACGCGAACAAATAGATGGTTATGTCATG-3′；OSTR1：5′-CCATTGGTCCCAGAGATAA-3′。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.4 樣本RNA 提取及逆轉(zhuǎn)錄 使用QIAamp Viral RNA Mini Kit 試劑盒提取供試品RNA。于1.5 mL離心管中加入 560 μL AVL 溶液，5.6 μL carrier RNA，140 μL 供試品，振蕩 15 s 混勻，室溫靜置 10 min；瞬時離心，加入 560 μL 無水乙醇，振蕩 15 s 混勻；瞬時離心，取上述溶液630 μL 加至吸附柱中（吸附柱放至收集管中），7 227 × g 離心 1 min；將吸附柱放至新的收集管中，吸取剩余溶液，加至試劑盒的吸附柱中（吸附柱放至收集管中），7 227 × g 離心 1 min；將吸附柱放至新的收集管中，加入500 μL AW1 溶液，7 227 × g 離心1 min；將吸附柱放至新的收集管中，加入 500 μL AW2 溶液，16 260 × g 離心 3 min；將吸附柱放至新的收集管中，16 260 × g 離心1 min；將吸附柱放至1.5 mL 離心管中，加入60 μL AVE溶液，室溫靜置 1 min；7 227 × g 離心 1 min；棄吸附柱，管中濾過液即為供試品RNA。用PrimeScriptⅣ1st strand cDNA Synthesis Mix 試劑盒將供試品RNA逆轉(zhuǎn)錄為 cDNA，冰上配制 20 μL 反應體系：4 μL 5 ×PrimeScriptⅣstrand cDNA Synthesis Mix，2 μL Random 6 mers（50 μmol／L），8 μL RNA，6 μL RNase Free dH2O，混勻。PCR 儀按以下條件反應：30 ℃ 10 min；42 ℃ 20 min；70 ℃ 15 min 使酶失活后，冰上冷卻，即得cDNA。

1.5 PCR 擴增及產(chǎn)物鑒定 以合成的cDNA 為模板，利用正、反向引物進行PCR 擴增。配制50 μL反應體系：Q5?High-Fidelity 2 × Master Mix 25 μL，正反向引物各 2 μL，模板 cDNA 1 μL，RNase Free dH2O 20 μL。PCR 反應條件：94 ℃預變性 2 min；94 ℃變性 30 s，63 ℃復性 30 s，72 ℃延伸 30 s，共35 個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，凝膠成像系統(tǒng)進行條帶分析。

1.6 引物篩選 根據(jù)Omicron 株S 基因序列中相比于其他突變株所特有的插入及缺失基因序列設計4對引物：OSTF1 ／ OS1R、OSTF3 ／ S2R、S1F ／ OSTR1和OSTF1 ／ S2R，分別利用這4 對引物對原型株及Omicron 株原液進行RT-PCR 檢測，觀察條帶特異性，篩選合適引物。

1.7 方法驗證

1.7.1 專屬性 取202201Y001 批Omicron 株原液、S202103Y001 批原型株原液、202112Y001B 批 Beta株原液、202108Y001 批 Delta 株原液，按照 1.4 項方法進行RNA 提取及逆轉(zhuǎn)錄，按照1.5 項方法進行PCR 及1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.7.2 重復性 取 202201Y0011 批 Omicron 株原液，按照1.4 項方法重復進行3 次RNA 提取及逆轉(zhuǎn)錄，按照1.5 項方法進行PCR 擴增及1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.7.3 中間精密度 取202201Y001 批Omicron 株原液，由2 名實驗人員按照1.4 項方法重復進行3 次RNA 提取及逆轉(zhuǎn)錄，按照1.5 項方法進行PCR 擴增及1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。重復檢測3 d。

1.7.4 耐用性 取202201Y001 批Omicron 株原液，按照1.4 項方法重復進行3 次RNA 提取及逆轉(zhuǎn)錄，以 cDNA 為模板，設置不同（53、55、58 ℃）PCR 反應退火溫度，其他條件不變，按照1.5 項方法進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.7.5 靈敏度 用PBS 對202201Y001 批Omicron株原液進行稀釋，使其蛋白濃度分別為25、5、1、0.2、0.04、0.008 μg ／ mL，按照 1.4 項方法進行 RNA 提取及逆轉(zhuǎn)錄，按照1.5 項方法進行PCR 擴增及1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。用PBS 對提取的病毒RNA進行梯度稀釋，使其核酸濃度分別為80、16、3.2、0.64、0.128、0.025 6 ng ／ μL，按照 1.4 項方法進行逆轉(zhuǎn)錄，按照1.5 項方法進行PCR 擴增及1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.8 方法的初步應用 取6 批Omicron 株原液，按照1.4 項方法進行RNA 提取及逆轉(zhuǎn)錄，按照1.5 項方法進行PCR 擴增及1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

2 結(jié) 果

2.1 方法的建立 使用引物 S1F ／ OSTR1、OSTF1 ／S2R 進行RT-PCR 檢測，原型株和Omicron 株均能擴增出相同大小的條帶，不具備區(qū)分兩者的能力；使用引物 OSTF1 ／ OS1R、OSTF3 ／ S2R 進行 RT-PCR 檢測，僅Omicron 株擴增出條帶，具備區(qū)分原型株與Omicron 株的能力，且引物 OSTF1 ／OS1R 中 2 條引物均包含了Omicron 株的特征突變位點序列：OSTF1包含了 69、70 位缺失的 6 個堿基 5′-ACATGT-3′，OS1R包含了214 位插入突變的9 個堿基5′-GCCAGAAGA-3′，特異性更強。因此選擇引物 OSTF1 ／ OS1R作為該方法的引物。見圖1。

圖1 RT-PCR 法引物篩選的凝膠電泳圖Fig.1 Electrophoretic profile for screening of primers for RT-PCR

2.2 方法的驗證

2.2.1 專屬性 Omicron 株原液經(jīng)RT-PCR 檢測可擴增出約 460 bp 的條帶，而原型株、Beta 株、Delta 株原液均無擴增條帶，見圖2。表明該方法專屬性良好，能有效區(qū)分Omicron 株與其他突變株。

圖2 RT-PCR 法專屬性驗證凝膠電泳圖Fig.2 Electrophoretic profile for validation of specificity of RT-PCR

2.2.2 重復性 3 次試驗Omicron 株原液經(jīng)RT-PCR檢測均能擴增出約460 bp 的條帶，見圖3。表明該方法重復性良好。

圖3 RT-PCR 法重復性驗證凝膠電泳圖Fig.3 Electrophoretic profile for validation for reproducibility of RT-PCR

2.2.3 中間精密度 2 名實驗人員重復3 次對Omicron 株原液進行RT-PCR 檢測，共檢測3 d，均能擴增出約460 bp 的條帶，見圖4。表明該方法中間精密度良好。

圖4 RT-PCR 法中間精密度驗證凝膠電泳圖Fig.4 Electrophoretic profile for validation for intermediate precision of RT-PCR

2.2.4 耐用性 Omicron 株原液在 53、55、58 ℃退火溫度下，經(jīng)RT-PCR 檢測均能擴增出約460 bp 的條帶，見圖5。表明在53 ~ 58 ℃范圍內(nèi)改變退火溫度，該方法均能得到較好的實驗結(jié)果。

圖5 RT-PCR 法耐用性驗證凝膠電泳圖Fig.5 Electrophoretic profile for validation for durability of RT-PCR

2.2.5 靈敏度 隨著Omicron 株原液蛋白和RNA濃度的降低，電泳條帶亮度逐漸降低，蛋白濃度在0.04 μg ／mL 以上、RNA 濃度在 0.128 ng ／ μL 以上，均能擴增出較亮的約460 bp 的條帶，見圖6。表明該方法具有較高的靈敏度。

圖6 RT-PCR 法靈敏度驗證凝膠電泳圖Fig.6 Electrophoretic profile for validation for sensitivity（RNA concentration）of RT-PCR

2.3 方法的初步應用 6 批Omicron 株原液經(jīng)RT-PCR檢測，均可見約460 bp 的條帶，見圖7。

圖7 Omicron 株原液RT-PCR 產(chǎn)物凝膠電泳圖Fig.7 Electrophoretic profile of RT-PCR products of bulk of inactivated vaccine against Omicron strain

3 討 論

滅活疫苗成品多通過抗體與抗原特異性結(jié)合的反應原理建立的方法來進行抗原鑒別試驗，如傷寒疫苗通過與相應的血清進行玻片凝集試驗，根據(jù)是否有明顯凝集反應進行鑒別；A 群C 群腦膜炎球菌多糖疫苗采用免疫雙向擴散法，根據(jù)是否能與相應抗體形成明顯沉淀線進行鑒別；吸附破傷風疫苗通過凝膠免疫沉淀試驗，根據(jù)是否出現(xiàn)免疫沉淀反應進行鑒別試驗［21］。目前《中國藥典》三部（2020 版）已有一些基于核酸序列特征建立的鑒別方法，如皮內(nèi)注射用卡介苗成品鑒別，采用多重PCR 法檢測卡介菌基因特異性的缺失區(qū)RD1［22］。雙價腎綜合征出血熱滅活疫苗成品鑒別，采用RT-PCR 法擴增Ⅰ型和Ⅱ型出血熱病毒特異性條帶［21-22］。

本研究根據(jù)Omicron 株S 蛋白基因序列特有的插入、缺失序列設計了僅針對該突變株具有擴增作用的引物，利用該引物建立了RT-PCR 檢測方法，該方法可區(qū)分Omicron 株與原型株、Beta 株及Delta株。驗證結(jié)果表明，該方法專屬性、重復性、日間精密度、耐用性和靈敏度良好，可用于Omicron 株新型冠狀病毒滅活疫苗原液鑒別。但由于未篩選到適宜的解吸附劑，因此目前還僅能應用于疫苗原液階段的鑒別。后續(xù)會繼續(xù)篩選合適的解吸附劑，以便將該方法用至成品階段的鑒別試驗。