吳佳欣，樊芳蕾，趙若晴，王報(bào)貴

(濱州學(xué)院 生物與環(huán)境工程學(xué)院，山東 濱州 256600)

1 引言

檸檬(Citruslimon(L.) Burm. f.)，蕓香科柑橘屬植物，又稱檸果、洋檸檬等。果皮厚，通常粗糙，其性喜溫暖，耐陰，不耐寒，也怕熱。檸檬原產(chǎn)東南亞，美洲也有分布，在我國, 檸檬的主要種植區(qū)域?yàn)殚L江以南，四川、福建、臺(tái)灣省等地都有栽培,而以四川省安岳縣種植量最大[1]。檸檬果實(shí)汁多肉脆，有濃郁的芳香氣，富含維生素、檸檬酸、檸檬精油、檸檬黃酮、微量元素等成分,具有極高的藥用價(jià)值[2,3]。檸檬果皮富含芳香揮發(fā)成分，可以生津解暑，開胃醒脾，長期食用有益身體健康。檸檬用途廣泛，在烹飪、航空、醫(yī)藥、香料、美容等領(lǐng)域均有涉及，產(chǎn)生大量的檸檬皮成為必然，需要將這些廢棄物充分利用起來，這樣既不造成資源的浪費(fèi)，同時(shí)也可以保護(hù)環(huán)境[4]。

黃酮是廣泛存在于自然界的某些植物和漿果中的天然酚類物質(zhì)，是一種具有強(qiáng)氧化作用的生理活性物質(zhì)，具有多方面的功效，可有效清除體內(nèi)的氧自由基，阻止細(xì)胞的退化衰老，能夠改善人體血液循環(huán)，也可降低膽固醇水平等，適量攝入對(duì)人體有一定益處[5,6]，因此加大對(duì)檸檬皮中黃酮類物質(zhì)的提取具有很大的現(xiàn)實(shí)意義?，F(xiàn)研究黃酮提取方法有熱水提取法、有機(jī)溶劑提取法、微波提取法、超聲波提取法、酶解提取法、超臨界流體萃取法、連續(xù)逆流提取法等[7～9]。超聲波在液體中具有空化作用加速植物有效成分的浸出提取，因此超聲波提取法提取黃酮類物質(zhì)被廣泛應(yīng)用，是目前比較新的、提取得率相對(duì)較高的一種方法，具有設(shè)備簡單、操作方便、提取時(shí)間短、溶劑用量少、產(chǎn)率高等優(yōu)點(diǎn)[10,11]。

檸檬的皮、果肉、種子中含有豐富的黃酮類化合物，通常皮中含量較多，故黃酮類化合物廣泛存在于檸檬皮中[12]，從檸檬皮中提取到的黃酮化合物可應(yīng)用到多個(gè)領(lǐng)域，具有很大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。本試驗(yàn)旨在研究用超聲波輔助乙醇提取的工藝提取檸檬皮中的黃酮類物質(zhì)，通過改變乙醇濃度、超聲時(shí)間、超聲溫度、超聲功率和液固比5個(gè)因素[13,14]，對(duì)最終黃酮得率進(jìn)行比較，選出適合且高效的最佳提取方式，進(jìn)而為檸檬皮中黃酮的提取提供一種切實(shí)可行的工藝，同時(shí)也可以作為其他天然物質(zhì)中黃酮提取的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

2 材料與方法

2.1 材料與試劑

檸檬(四川檸盟)；無水乙醇(煙臺(tái)遠(yuǎn)東精細(xì)化工有限公司)；蘆丁標(biāo)品(合肥博美生物科技有限責(zé)任公司)；硝酸鋁(天津市福晨化學(xué)試劑廠)；亞硝酸鈉(天津市福晨化學(xué)試劑廠)；氫氧化鈉(天津市福晨化學(xué)試劑廠)。

2.2 儀器與設(shè)備

托盤，離心管(50 mL)，40目篩，移液槍(1000 μL)，燒杯(250 mL)，量筒(100 mL，50 mL)，容量瓶，剪刀，膠頭滴管，試管(25 mL)，移液管(5 mL，10 mL)。

組織搗碎機(jī)(上海左樂儀器有限公司)；電子天平(上海菁海儀器有限公司)；紅外干燥箱(上海景邁儀器設(shè)備有限公司)；冰箱(山東海信公司)；超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；紫外分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)；高速冷凍離心機(jī)(賽默飛世爾科技中國有限公司)。

2.3 實(shí)驗(yàn)方法

2.3.1 樣品預(yù)處理

將新鮮檸檬洗凈去皮，用剪刀將檸檬皮剪成小條狀，平鋪在潔凈且干燥的托盤上，溫度維持在45 ℃于紅外干燥箱中烘干直至恒重，然后取出用組織搗碎機(jī)進(jìn)行粉碎處理，之后過40目篩，將篩出粉末裝入密封袋放入冰箱冷凍室中保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3.2 繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

用電子天平準(zhǔn)確稱取20.00 mg蘆丁標(biāo)準(zhǔn)樣品，于45 ℃恒溫水浴下使用無水乙醇溶解，在室溫下定容于燒杯(50 mL)中、震蕩搖勻，備用。準(zhǔn)備6個(gè)25 mL具塞試管，將蘆丁標(biāo)準(zhǔn)母液用移液管(5 mL)分別吸取1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL至25 mL具塞試管中，同時(shí)做空白試驗(yàn)。首先向各試管加入1.5 mL 5%的亞硝酸鈉溶液，震蕩搖勻，靜置6 min，之后加入等量10%的硝酸鋁溶液，重復(fù)上述操作，最后加入7.5 mL 4%的氫氧化鈉溶液，再用相同濃度的乙醇定容至25 mL，震蕩搖勻，靜置15 min[15]。以空白對(duì)照組為參照，在紫外分光光度計(jì)的510 nm處測定各試管樣品的吸光值，每組樣品做3個(gè)平行試驗(yàn)，結(jié)果取平均值，以各組樣品計(jì)算得到的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)母液濃度為橫坐標(biāo)(x)，OD值為縱坐標(biāo)(y)繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.3.3 黃酮提取

準(zhǔn)確稱取1.000 g檸檬皮粉末于50 mL離心管中，向其中加入不同濃度或體積的乙醇浸取液，震蕩搖勻，在不同的超聲功率或超聲溫度下提取相應(yīng)時(shí)間的黃酮。之后再放入高速冷凍離心機(jī)，于4200 r/min離心20 min后取上清液，靜置備用。

2.3.4 黃酮含量測定

采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH光度法檢測樣品總黃酮含量[16]。用移液槍(1000 L)分別吸取2 mL備用樣品液于50 mL離心管中，并依次添加NaNO2溶液、Al(NO3)3溶液和NaOH溶液各0.8 mL，靜置時(shí)間分別為6 min、6 min和15 min，每次添加后均需將混合液搖勻。最后于510 nm處測定其OD值，依照上步繪制的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線得出各樣品的對(duì)應(yīng)濃度，按照公式(1)計(jì)算出總黃酮總量：

(1)

式(1)中：c為由蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線得出待測樣液中對(duì)應(yīng)的總黃酮濃度，mg/mL；n為稀釋倍數(shù)；v樣液的總體積，mL；m為檸檬皮粉末質(zhì)量，mg；w為總黃酮含量。

2.3.5 單因素試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取檸檬皮粉末1.000 g，按照不同的乙醇濃度與液固比分別添加乙醇浸取液(均呈等差遞增)，在不同的超聲功率和超聲溫度下浸取不同的時(shí)間，在高速冷凍離心機(jī)中于4200 r/min離心20 min，之后吸取上清液測其510 nm處的OD值，利用蘆丁標(biāo)曲得出對(duì)應(yīng)濃度，進(jìn)而求得總黃酮提取率。單因素各水平詳見表1。

2.3.6 正交試驗(yàn)

單因素試驗(yàn)后，對(duì)各因素的吸光值進(jìn)行比較分析，選出其中4個(gè)影響較大的因素進(jìn)行后續(xù)正交試驗(yàn)，通過對(duì)總黃酮得率的分析得出最優(yōu)的提取工藝。正交因素各水平詳見表2。

表1 單因素試驗(yàn)水平選擇

表2 正交試驗(yàn)因素水平

2.3.7 數(shù)據(jù)處理

繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線，查閱相關(guān)資料確定單因素試驗(yàn)條件選取范圍，記錄單因素實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，制定單因素水平表，利用Excel繪制標(biāo)曲并用Prism軟件繪制折線圖觀察趨勢；依據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果確定正交試驗(yàn)因素并制定因素水平表、正交表；通過對(duì)正交表的分析進(jìn)而得到總黃酮得率最高的黃酮提取最佳組合，由此確定最佳的黃酮提取工藝。

3 結(jié)果與分析

3.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

由圖1可以得出，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=11.486x+0.0003，R2=0.9997，線性關(guān)系較好，可用于下面實(shí)驗(yàn)。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

3.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

3.2.1 超聲溫度對(duì)總黃酮得率的影響

在相同前提下改變超聲提取的溫度，得到不同超聲溫度與總黃酮得率的關(guān)系如圖2所示。在20～40 ℃時(shí)黃酮提取率與提取時(shí)的溫度成正比，超聲溫度越高，總黃酮得率越大。這種情況的出現(xiàn)可能是因?yàn)殡S著溫度的升高，檸檬皮粉末中的分子運(yùn)動(dòng)速度加快，使得黃酮更易于從細(xì)胞中向溶液中轉(zhuǎn)移。在超聲溫度達(dá)到40 ℃時(shí)總黃酮提取率為0.652%，溫度高于40 ℃則隨著超聲溫度的升高黃酮得率迅速降低，這可能是由于溫度過高加快了乙醇的揮發(fā)程度，同時(shí)破壞了檸檬皮粉末中的部分黃酮類物質(zhì)，導(dǎo)致提取率降低。綜合考慮后確定40 ℃為最佳的提取溫度，并以此作為后續(xù)試驗(yàn)的固定條件之一。

圖2 超聲溫度對(duì)總黃酮得率的影響

3.2.2 乙醇濃度對(duì)總黃酮得率的影響

在相同前提下改變乙醇體積濃度，得到不同乙醇濃度與總黃酮得率的關(guān)系如圖3所示。通過圖3得知：在40%乙醇濃度時(shí)黃酮提取率為0.622%，在乙醇濃度為40%～70%時(shí)隨著濃度的升高總黃酮得率呈增大的趨勢，這可能是由于黃酮類物質(zhì)在乙醇濃度過低時(shí)難以浸出完全，當(dāng)乙醇濃度為70%時(shí)提取率達(dá)到了0.763%，原因可能是檸檬皮中黃酮類物質(zhì)的極性與濃度為70%的乙醇溶液極性相似，當(dāng)乙醇濃度超過70%時(shí)黃酮得率出現(xiàn)下降的趨勢，超過80%則降低幅度增大，可能是隨著乙醇濃度的升高，檸檬皮粉末中溶出的脂溶性物質(zhì)增多從而影響了黃酮的相對(duì)浸出量，且乙醇濃度過高導(dǎo)致溶液中滲透壓過大，降低了黃酮的提取率。因此可以確定:提取黃酮最佳的乙醇濃度為70%，并以此作為后續(xù)試驗(yàn)的固定條件之一。

圖3 乙醇濃度對(duì)總黃酮得率的影響

3.2.3 液固比對(duì)總黃酮得率的影響

在相同前提下改變乙醇的用量，得到不同液固比與總黃酮得率的關(guān)系如圖4所示。通過圖4可以了解到，從整體上看，當(dāng)液固比為15∶1時(shí)黃酮提取率最低為1.226%，液固比為30∶1時(shí)總黃酮得率達(dá)到1.318%，液固比大于30∶1時(shí)總黃酮得率開始降低。這是因?yàn)槿軇┻^少時(shí)黃酮無法充分浸出，隨著溶劑倍數(shù)的增大使得溶劑與檸檬皮粉末的接觸面積增多，促進(jìn)了黃酮化合物的提取，而溶劑過多時(shí)由于雜質(zhì)的浸出量增多以及溶液的稀釋效應(yīng)而導(dǎo)致提取率下降。在固液比為20∶1時(shí)出現(xiàn)了一個(gè)小高峰，之后出現(xiàn)短暫下降又升高的現(xiàn)象，難以得出液固比顯著的最佳條件，因此將固液比舍去，不進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

3.2.4 超聲功率對(duì)總黃酮得率的影響

在相同前提下改變超聲提取的功率，得到不同超聲功率與總黃酮得率的關(guān)系如圖5所示。通過圖5可以了解到，超聲功率在500 W時(shí)黃酮得率達(dá)到1.175%，低于500 W時(shí)黃酮得率隨超聲功率的升高而增加，這是因?yàn)槌暪β十a(chǎn)生的空化效應(yīng)得到了增強(qiáng)，加快了黃酮從細(xì)胞中向溶液中滲透的速度，所以得率逐漸增大，在500～700 W的超聲功率范圍內(nèi)黃酮得率逐漸降低，在700 W時(shí)為1.127%，可能是由于較大的超聲功率破壞了黃酮化合物的穩(wěn)定性從而使提取量降低，而當(dāng)超聲功率大于700 W時(shí)，黃酮總得率又隨著超聲功率的增大而增加，這種情況的出現(xiàn)可能是由于超聲功率過大使得提取溫度明顯升高，導(dǎo)致黃酮提取率隨之增加。綜合考慮后確定500 W為最佳黃酮提取功率，并以此作為后續(xù)試驗(yàn)的固定條件之一。

圖4 液固比對(duì)總黃酮得率的影響

圖5 超聲功率對(duì)總黃酮得率的影響

3.2.5 超聲時(shí)間對(duì)總黃酮得率的影響

在相同前提下改變超聲提取的時(shí)間，得到不同超聲時(shí)間與總黃酮得率的關(guān)系如圖6所示。通過圖6可以了解到，超聲時(shí)間為10 min時(shí)黃酮提取率為1.034%，在超聲時(shí)間為10～50 min范圍內(nèi)總黃酮得率隨著超聲時(shí)間的延長而增加，在50 min提取率達(dá)到1.178%，這可能是由于在黃酮提取初期隨著超聲時(shí)間的增加，檸檬皮粉末受到的氣蝕作用促使細(xì)胞破裂徹底，進(jìn)而使得更多的黃酮化合物溶于乙醇溶劑中，從而提高了黃酮得率，當(dāng)超聲提取時(shí)間超過50 min后，總黃酮得率開始降低，原因可能是超聲時(shí)間過長使得更多的雜質(zhì)浸出細(xì)胞而影響了黃酮的浸出量，且時(shí)間過長會(huì)破壞細(xì)胞中黃酮物質(zhì)的活性也會(huì)使黃酮得率降低。因此可以確定黃酮提取的最佳超聲時(shí)間為50 min，并以此作為后續(xù)試驗(yàn)的固定條件之一。

圖6 超聲時(shí)間對(duì)總黃酮得率的影響

3.3 正交試驗(yàn)結(jié)果

通過對(duì)單因素試驗(yàn)的數(shù)據(jù)分析，選取對(duì)檸檬皮中黃酮提取影響較顯著的4個(gè)因素進(jìn)行后續(xù)正交試驗(yàn)，分別為超聲溫度、乙醇濃度、超聲功率和超聲時(shí)間，以此來優(yōu)化黃酮提取工藝，得出最優(yōu)提取條件。由于液固比對(duì)黃酮提取率的影響趨勢不明確，綜合考慮后選擇總黃酮得率最高的30∶1為固定液固比，得到正交試驗(yàn)結(jié)果見表3。

正交試驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果表明，提取檸檬皮粉末中黃酮的最優(yōu)組合為A3B3C3D1，總黃酮得率達(dá)到了1.300%。通過R值可以看出，超聲功率對(duì)黃酮提取的影響最為顯著，其余依次為超聲時(shí)間、乙醇濃度，超聲溫度的影響最弱，因此得出最佳的提取條件為超聲溫度45 ℃；乙醇濃度75%；超聲功率600 W；超聲時(shí)間45 min；液固比30∶1 (mL/g)。

4 結(jié)論和討論

4.1 結(jié)論

本試驗(yàn)利用單因素試驗(yàn)和四因素三水平正交試驗(yàn)提取檸檬皮中的黃酮類物質(zhì)，通過對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的研究分析，最終確定了超聲波輔助提取檸檬皮中總黃酮的最佳提取工藝為超聲溫度45 ℃；乙醇濃度75%；超聲功率600 W；超聲時(shí)間45 min；液固比30∶1 (mL/g)，此時(shí)總黃酮得率最高，為1.300%。該研究具有一定的實(shí)用意義，既證明了檸檬皮中具有豐富的黃酮化合物，也為之后天然產(chǎn)物中提取黃酮提供了參考價(jià)值。

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果

4.2 討論

研究表明，光照、溫度、水分、營養(yǎng)等環(huán)境因素會(huì)影響植物中黃酮類化合物的合成[17]，檸檬適宜于在冬無嚴(yán)寒、夏無酷熱的地方種植，以土層深厚、含有機(jī)質(zhì)豐富、保濕保肥力強(qiáng)的緩坡地為最佳，要求雨水分布均勻，氣溫平穩(wěn)，光照充足[18]，這些可能是使得檸檬中黃酮含量較多的原因。檸檬皮粉末應(yīng)儲(chǔ)存在冰箱中以保持低溫干燥的狀態(tài)，確保黃酮的損失降低到最小程度，由于檸檬中總黃酮含量會(huì)隨著儲(chǔ)存時(shí)間的延長而降低[19]，所以備用的檸檬皮粉末不宜放置過長時(shí)間，應(yīng)盡快進(jìn)行試驗(yàn)。

由于實(shí)驗(yàn)條件的關(guān)系，本文未對(duì)檸檬皮中黃酮類物質(zhì)進(jìn)行進(jìn)一步的分析與研究，之后有機(jī)會(huì)將深入研究黃酮類物質(zhì)的生理特性與理化性質(zhì)，以挖掘黃酮化合物更多的使用價(jià)值。