張銀杰, 張洪昌, 凌思源, 蔣玲玲, 彭程, 張衛(wèi),*

1. 國家環(huán)境保護化工過程環(huán)境風險評價與控制重點實驗室,華東理工大學資源與環(huán)境工程學院,上海 200237

2. 國家環(huán)境保護新型污染物環(huán)境健康影響評價重點實驗室,上海市環(huán)境科學研究院,上海 200233

壬基酚(nonylphenol, NP)作為一種典型的酚類內分泌干擾物,是重要的精細化工原料和中間體。水環(huán)境中的NP 主要來自于非離子表面活性劑壬基酚聚氧乙烯醚,其伴隨工業(yè)和城鎮(zhèn)污水處理后的出水和污泥進入環(huán)境并繼續(xù)降解成危害性更強的NP[1]。 研究表明,NP 具有較強的疏水性,化學性質穩(wěn)定,在水中的半衰期可長達1 ~2個月,并會在沉積物中吸附積累,即使水體不再受納NP 時也可以持續(xù)不斷地釋放到水中[1-2]。 NP 對水生動物的毒害影響包括生殖、免疫、內分泌及神經系統(tǒng)等[3-6],主要毒害方式除了在體內產生活性氧(reactive oxygen species, ROS)誘導氧化損傷外,還可以通過模擬內源性雌激素與相關受體結合,干擾動物體內的激素分泌、基因表達和信號傳遞等[7-8]。 更為重要的是,NP 可以在水生動物體內富集或經食物鏈放大,對水生動物和人類具有潛在的生態(tài)風險[9]。

水生環(huán)境中的NP 濃度往往是變化的,例如污水的集中排放,降雨導致的底泥攪動再釋放,或稀釋作用、自然降解等均可能導致NP 濃度的增大或減小[10-11],繼而引起生物體內的濃度變化。 此前的研究表明,NP 在水生動物體內的積累清除過程一般符合兩箱一階動力學模型,體內NP 的濃度會隨著暴露時間和濃度增加而增加,直至與水體平衡[12-13]。水生動物體內的抗氧化、解毒酶能夠抵抗外源性污染物生成的ROS 及其本身或代謝物的毒性,超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)和過氧化氫酶(catalase, CAT)能有效清除機體內的ROS;谷胱甘肽S-轉移酶(glutathione S-transferase, GST)能夠催化多類親電底物與還原型谷胱甘肽(glutathione, GSH)結合以抵抗毒性物質對機體的損害[14-15]。 這些抗氧化酶和調節(jié)物質的波動往往作為機體氧化應激的生物敏感指標,用于監(jiān)測污染物對生物的毒害效應[16],同時也可以作為污染物濃度變化的指示劑。 值得注意的是,由于水生動物不同組織承擔著各自的功能,其對于外源污染物的敏感性也不盡相同。 例如,貽貝的鰓組織對于外源污染物脅迫的敏感性總是高于消化腺,原因在于鰓部是吸收水體污染物的直接器官,而消化腺因為承擔重要的代謝功能而需要較高的承受閾值[17]。

目前,關于NP 對水生動物的毒性研究并不少見,但往往側重于觀察不同濃度水平下急性或慢性暴露后的直接變化,關于NP 對魚體內抗氧化酶的動態(tài)影響研究比較有限,缺乏對魚體NP 濃度變化與毒性效應之間聯系的認識。 本文以斑馬魚為供試生物,通過考察NP 在暴露和凈化過程中對不同組織(頭部、肌肉和內臟團)中抗氧化酶(SOD、CAT、GST 和GSH)活力影響的變化,進一步探究NP 對魚類的毒性效應和作用機制。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實驗生物

受試成年斑馬魚(Danio rerio)購自上海某熱帶魚市場,均為同期受精卵孵化而成,年齡相近,平均體長為2 ~3 cm。 運回實驗室后挑選健康且體型接近的個體繼續(xù)馴養(yǎng)2 周以上。 實驗用水采用曝氣48 h 的自來水,以孵化后的豐年蟲卵(天津豐年水產養(yǎng)殖有限公司)喂食,光照維持每天12 ~14 h。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗設計

急性毒性實驗采用半靜態(tài)實驗法,每隔24 h 更換實驗溶液。 設置溶劑對照組以及一系列濃度的NP 處理組,NP(異構體混合物,純度＞98%,Adamasbeta)的質量濃度設為 59.6、95.4、152、250、390、625、790 和 1 000 μg·L-1,乙醇助溶劑濃度為 0.1 mL·L-1。 每組投放15 尾斑馬魚,馴養(yǎng)期間充分飼喂,直至實驗前24 h 停止喂食。 96 h 內觀察并記錄斑馬魚的癥狀及死亡情況,觸碰尾部無反應即視為死亡,并及時移除。

酶活影響實驗根據急性毒性結果設置3個濃度的 NP 處理組,質量濃度分別為 5、50 和 100 μg·L-1,同時設置溶劑對照組,每個濃度水平設置3個平行。 實驗設置為14 d 暴露期和7 d 凈化期,每隔48 h 更換實驗溶液。 暴露14 d 后各自轉入潔凈的實驗用水,每天更換一半。 投喂飼料后將殘渣和糞便用虹吸法吸出。 實驗用水水質滿足斑馬魚的生存需求,水溫維持在(22±1) ℃。 以斑馬魚投入暴露溶液的時間為 0 d 計,于 1、7 和 14 d (暴露階段)以及15 d、21 d (凈化階段)取樣。

1.2.2 SOD、CAT、GST 活力和 TP、GSH 含量的測定

斑馬魚樣品在冰上麻醉后用蒸餾水沖洗,并用濾紙吸干水分,每個平行樣取3 尾合并處理。 用預冷的解剖刀等小心分離魚頭、魚身和內臟團,魚身剔除主骨,內臟團除去魚子。 稱得各組織質量,以1 ∶4(m∶V)的比例加入4 ℃的生理鹽水,冰水浴中勻漿處理后于 4 ℃、4 000 r·min-1離心 15 min,上清液用生理鹽水稀釋成各自的最佳濃度。

SOD、CAT、GST 活力和 GSH、總蛋白(total protein, TP)含量測定嚴格按照測試盒(南京建成生物工程研究所)說明書的方法進行;光密度(optical density, OD)用紫外可見分光光度計測定。

1.3 數據處理與分析

采用冦氏法用EXCEL 2019 計算NP 對斑馬魚的LC50和95%置信區(qū)間,具體計算方法參照李翠萍等[18]的冦氏法。 酶活實驗最后結果均表示為與溶劑對照組水平(100%)的比值,即相對活力(%)或相對含量(%),以平均值±標準差(Mean±SD)形式表示,測定數據采用SPSS 25.0 (IBM, USA)進行統(tǒng)計分析,采用單因素方差分析(one-way ANOVA)比較各NP 處理組與對照組之間的差異,顯著性水平P＜0.05、P＜0.01 時為差異顯著。

2 結果(Results)

2.1 NP 對斑馬魚的急性致死毒性

斑馬魚剛投入NP 的實驗溶液時,沒有發(fā)現異常現象。 急性毒性暴露過程中,對照組和59.6 μg·L-1組的斑馬魚沒有出現死亡且生活狀態(tài)良好,高濃度的 1 000 μg·L-1組在 24 h 內全部死亡。 NP 對斑馬魚的24 ~96 h 的LC50數據如表1 所示。 暴露1 h后發(fā)現 625、790 和 1 000 μg·L-1組的斑馬魚大部分聚集在水底,游動緩慢,向上游動仍會下沉,觸碰后反應正常;暴露5 h 后1 000 μg·L-1組的魚沉底情況沒有好轉,游泳遲緩,搖擺無力,部分在水底不游動,且呼吸急促。 死亡個體在死前的癥狀各組基本一致,逐漸喪失平衡能力,出現側翻、傾斜,在水底的個體腹部朝上,仍有微弱呼吸,但觸碰無反應。 當天死亡個體的魚鰓和頭下部常伴隨紅腫,而之后死亡的個體則較少出現這種情況,外表無明顯損傷,少部分魚身會發(fā)生彎折。

表1 壬基酚(NP)對斑馬魚的急性半致死濃度(LC50)Table 1 Acute medial lethal concentration (LC50) of nonylphenol (NP) on zebrafish

2.2 NP 對斑馬魚體內SOD 活力的影響

斑馬魚不同組織中的可溶性蛋白質含量的平均值分別為 33.5 g·L-1(魚頭)、36.0 g·L-1(肌肉)、93.5g·L-1(內臟團)。 對照組 SOD 活力在 3個組織的大小關系為內臟團(7.0 U·mg-1)＜頭部(21.3 U·mg-1)＜肌肉(41.5 U·mg-1)。 斑馬魚不同組織內 SOD 與對照組的相對活力變化(%)如圖1 所示,5 μg·L-1組頭部的SOD 活力在暴露1 d 時被顯著誘導(P＜0.01),表現出毒性興奮效應,50 μg·L-1組在脅迫14 d 時受到輕微抑制,此外各組在暴露期間無顯著變化。進入凈化階段,50 μg·L-1和 100 μg·L-1組的 SOD活力呈現顯著誘導效應(P＜0.05)后均有下降,100 μg·L-1組在凈化 7 d 時仍高于對照水平(P＜0.05)。 肌肉部分,50 μg·L-1和 100 μg·L-1組的 SOD 活力在暴露 7 d 時受到顯著誘導(P＜0.05),而 5 μg·L-1組在暴露14 d 受到顯著誘導(P＜0.05),此時其余2 組已恢復對照水平。 5 μg·L-1組在凈化初期受到的誘導作用顯著(P＜0.01),50 μg·L-1和 100 μg·L-1組的SOD 活力在凈化 7 d 時低于對照水平(P＜0.05)。 5 μg·L-1組內臟團中SOD 活力在前期低于對照水平,各組在暴露14 d 時均受到顯著誘導(P＜0.05),100 μg·L-1組在7 d 已較早出現誘導效應。 肌肉和內臟中SOD 活力在高濃度組出現轉變的時間要早于低濃度組。 凈化階段,內臟團的SOD 活力呈現不同程度的恢復。 各組織內SOD 的相對活力在暴露和凈化期的變化范圍為85.1% ~117.4%,整體而言,斑馬魚體內的SOD 活力變化對NP 不太敏感。

圖1 在暴露與凈化過程中NP 對斑馬魚頭部(a)、肌肉(b)和內臟團(c)中超氧化物歧化酶(SOD)相對活力的影響注:*表示P＜0.05,**表示P＜0.01;輔助線前后表示暴露期和凈化期,以對照組水平為100%。Fig.1 Effect of NP on relative superoxide dismutase (SOD) activities in head (a), muscle (b) and visceral mass (c) of zebrafish during exposure and purification stagesNote: *represents P＜0.05, **represents P＜0.01; auxiliary line separates exposure and purification stages; control treatment level is set at 100%.

2.3 NP 對斑馬魚體內CAT 活力的影響

斑馬魚不同組織內CAT 與對照水平的相對活力(%)變化如圖2 所示。 對照組的CAT 活力在3個部分的大小關系依次為肌肉(0.42 U·mg-1)＜頭部(0.54 U·mg-1)＜內臟團(5.8 U·mg-1)。 各組頭部的CAT 活力在初期均受到不同程度的抑制,在暴露7 d 時上升到對照水平(P＞0.05),在14 d 又受到顯著抑制。 進入凈化階段,5 μg·L-1和 50 μg·L-1組的CAT 活力均恢復上升到對照水平,而100 μg·L-1組在凈化7 d 時仍顯著低于對照水平(P＜0.05)。 50 μg·L-1和 100 μg·L-1組肌肉內的 CAT 活力在暴露 7 d時受到顯著誘導(P＜0.05),隨后恢復到對照水平(P＞0.05)。 從平均水平看,100 μg·L-1組的 CAT 活力下降到對照水平以下,而5 μg·L-1仍高于對照水平,不同NP 濃度組肌肉內的CAT 活力變化在時間上也存在差異。 在暴露1 d 和7 d 時,NP 對內臟部分的 CAT 活力造成不同程度的抑制(P＜0.01)。 100 μg·L-1組受到NP 的抑制程度明顯大于其他組,并且在14 d 時仍顯著低于對照水平,此時5 μg·L-1和50 μg·L-1組的 CAT 活力已基本恢復,5 μg·L-1組甚至超過了對照水平(P＜0.01)。 在凈化期內,100 μg·L-1組相較于低濃度組恢復較慢。 整體而言,內臟團CAT 活力對 NP 較為敏感,100 μg·L-1組的相對活力在暴露7 d 時低至15.5%。

圖2 在暴露與凈化過程中NP 對斑馬魚頭部(a)、肌肉(b)和內臟團(c)中過氧化氫酶(CAT)相對活力的影響注:*表示P＜0.05,**表示P＜0.01;輔助線前后表示暴露期和凈化期,以對照組水平為100%。Fig.2 Effect of NP on relative catalase (CAT) activities in head (a), muscle (b) and visceral mass (c) of zebrafish during exposure and purification stagesNote: *represents P＜0.05, **represents P＜0.01; auxiliary line separates exposure and purification stages; control treatment level is set at 100%.

2.4 NP 對斑馬魚體內GST 活力的影響

斑馬魚不同組織內GST 與對照水平的相對活力(%)受NP 影響的變化規(guī)律如圖3 所示。 對照組的GST 活力在3個部分的大小關系依次為內臟團(6.5 U·mg-1)＜肌肉(14.7 U·mg-1)＜頭部(18.7 U·mg-1)。 5 μg·L-1組頭部的 GST 活力在 14 d 暴露期內持續(xù)低于對照水平,而50 μg·L-1和100 μg·L-1組受到不同程度的誘導,并且在凈化1 d 后仍高于對照水平。 肌肉組織中,50 μg·L-1和 100 μg·L-1組在暴露和凈化初期均受到顯著誘導,其余時間變化不顯著(P＞0.05)。 除了 5 μg·L-1和 50 μg·L-1組在暴露期1 d 受到抑制,各組內臟團的GST 活力在NP脅迫下均受到誘導作用,且各組GST 活力均隨時間增長而增大。 5 μg·L-1組在 14 d 時達到平衡,為對照水平的 218.8% ~220.0%;50 μg·L-1的 GST 活力增速漸緩,而100 μg·L-1組未見趨于平衡,且相對活力在14 d 時已高達328.4%。 各組織內GST 活力進入凈化階段后逐漸恢復對照水平,低濃度組恢復較快。 在本研究的濃度范圍內,NP 對GST 沒有造成不可逆的影響。

圖3 在暴露與凈化過程中NP 對斑馬魚頭部(a)、肌肉(b)和內臟團(c)中谷胱甘肽S-轉移酶(GST)相對活力的影響注:*表示P＜0.05,**表示P＜0.01;輔助線前后表示暴露期和凈化期,以對照組水平為100%。Fig.3 Effect of NP on relative glutathione S-transferase (GST) activities in head (a), muscle (b) and visceral mass (c) of zebrafish during exposure and purification stagesNote: *represents P＜0.05, **represents P＜0.01; auxiliary line separates exposure and purification stages; control treatment level is set at 100%.

2.5 NP 對斑馬魚體內GSH 含量的影響

GSH 在斑馬魚頭部和肌肉中的相對含量(%)受NP 影響的變化情況如圖4 所示。 由圖4 可知,頭部對照水平的 GSH 含量(0.45 nmol·mg-1)小于肌肉(1.03 nmol·mg-1)。 由于 GSH 含量測定所需的樣品量較大,故樣品量較少的內臟團沒有進行測定。 50 μg·L-1組頭部的 GSH 含量在 NP 脅迫下高于對照水平,除此之外,各組在斑馬魚體內的GSH 含量在暴露7 d 前均顯著低于對照水平(P＜0.05),且隨時間增長而增加。 頭部的GSH 含量在凈化期內下降到對照水平;對于肌肉部分,50 μg·L-1和 100 μg·L-1組的GSH 含量在凈化7 d 時仍顯著高于對照水平(P＜0.05)。

圖4 在暴露與凈化過程中NP 對斑馬魚頭部(a)和肌肉(b)中還原型谷胱甘肽(GSH)相對含量的影響注:*表示P＜0.05,**表示P＜0.01;輔助線前后表示暴露期和凈化期,以對照組水平為100%。Fig.4 Effect of exposure to NP on relative glutathione (GSH) level in head (a) and muscle (b) of zebrafish during exposure and purification stagesNote: *represents P＜0.05, **represents P＜0.01; auxiliary line separates exposure and purification stages; control treatment level is set at 100%.

3 討論(Discussion)

對于需氧生物而言,在對外源污染物的代謝過程中,會產生副產物ROS,機體主要通過SOD、CAT等抗氧化酶消除ROS 以避免氧化損傷[14]。 GST 也有抗氧化和解毒的重要功能,催化GSH 與外源污染物以及代謝產生的親電試劑結合,避免其對機體DNA、蛋白質和酶等重要物質造成損傷[19]。

魚鰓是魚類與水接觸的直接組織,是攝取水中NP 的主要途徑[20]。 此前有研究表明 NP 可以引起玫瑰無須鲃的鰓和肝腎的結構病變,表現出上皮組織的增生和次級鰓片的融合,以及肝腎出血和細胞壞死,這可能要歸咎于疏水性的NP 與細胞膜結合改變其通透性,繼而造成細胞泄露和離子損失等[21]。NP 使斑馬魚魚鰓組織產生增生和紅腫,繼而影響其呼吸效率。 除此之外,NP 的暴露還可以破壞機體內促氧化劑與抗氧化系統(tǒng)之間的平衡,誘導氧化應激并造成細胞毒性。 引起斑馬魚急性死亡的主要原因可能是鰓部呼吸功能的嚴重受損導致缺氧,內部肝、腎等臟器的功能障礙以及生理機能下降加速死亡。NP 對斑馬魚24 h 和96 h 的LC50值與陳建華等[22]的研究結果(545 μg·L-1和 332 μg·L-1)相近,而張靜[23]報道的96 h LC50(雌、雄斑馬魚LC50分別為902 μg·L-1和 529 μg·L-1)明顯大于本研究結果,可能是因為其實驗水溫(28 ℃)對斑馬魚更為適宜以及采用對魚類毒性更小的二甲基亞砜(DMSO)作為助溶劑。NP 通過誘導氧化損傷和直接改變細胞結構等多種方式對斑馬魚造成了毒性作用。

NP 對幼年泥鰍SOD 和CAT 活力的誘導作用隨濃度增加而增強,到達最高后表現出隨NP 濃度增加而下降的趨勢[24]。 本研究中沒有發(fā)現SOD 和CAT 活力存在明顯的濃度依賴性。 在NP 對櫛孔扇貝的急性脅迫下,鰓組織和消化盲囊中SOD、CAT的活力在低、中濃度脅迫下先受到輕微誘導后被抑制,而高濃度下全程表現為抑制作用[25]。 Abd-Elkareem 和Mohamed 發(fā)現非洲鲇魚和尼羅河羅非魚經NP 暴露 21 d 后,SOD 和 CAT 活力顯著下降[3]。 本研究結果表明,斑馬魚頭部的SOD 活力在低濃度脅迫下受到誘導,雖然后期在頭部和肌肉中表現出的抑制效應與其他研究一致,但抑制程度較小。 肌肉中CAT 活力也表現出先被誘導后受到輕微抑制;頭部由于通過鰓部吸收水中NP,CAT 活力受到的抑制作用更強而始終低于對照水平。 波紋巴非蛤外套膜中SOD 活力在NP 脅迫下整體表現出先誘導后抑制,進入凈化階段僅1 μg·L-1低濃度組恢復至對照水平[26]。 NP 對波紋巴非蛤毒性效應的研究結果與本研究相似,由于鰓部是吸收水中NP 的主要途徑,而肌肉是繼頭部和內臟后最遲受NP 脅迫的組織[27],因此頭部和肌肉內SOD 的誘導效應產生的時間存在先后。 在NP 對波紋巴非蛤內臟團的脅迫過程中,1 μg·L-1和 10 μg·L-1組的 SOD 活力先被抑制后受到誘導[28]。 本研究結果中,SOD 和 CAT 在頭部和肌肉中的活力在暴露后期隨體內NP 積累濃度增加和脅迫時間持續(xù)均會出現下降趨勢。 內臟團中的SOD 和CAT 活力在前期受抑制后均表現出上升的趨勢。 由于不同組織內抗氧化酶的敏感性和賦存含量有差異,NP 對抗氧化酶的誘導/抑制效應及其影響程度、變化時間均有所不同。

進入機體的NP 濃度隨時間增加,在NP 脅迫下機體產生大量ROS 和其他中間產物,進而使得抗氧化酶、非酶類抗氧化物質被大量消耗[29]。 低濃度組斑馬魚頭部的GST 活力在暴露階段受到不同程度的抑制,而GSH 的含量并未被大量消耗而低于對照水平,這一結果符合GSH 在GST 的催化作用下與活性成分結合導致其含量變化。 波紋巴非蛤外套膜內GSH 含量在前中期基本低于對照組,15 d 時顯著高于對照組[26]。 本研究中斑馬魚頭部和肌肉中GST 的活力在暴露7 d 和14 d 呈現誘導作用或無顯著變化,可見GST 的催化反應并未受到抑制,而底物GSH 的含量卻保持增長并在14 d 高于對照水平,這表明GSH 的總量出現了延遲性的增長。 大嘴鱸魚體內GSH 生物合成在NP 暴露下表現出上升趨勢[30],斑馬魚體內的GSH 含量在NP 持續(xù)脅迫下也會通過合成使總量增加。

斑馬魚肌肉中的SOD 和CAT 活力隨暴露時間增加逐漸被誘導,隨后表現出活力的下降,尤其是高濃度組比低濃度組更早發(fā)生下降的轉變。 機體內NP 的積累濃度隨暴露時間增加,且在高濃度下積累速度更快[13],可見NP 對抗氧化酶的影響與體內的積累濃度存在相關性。 內臟團SOD 活力在100 μg·L-1中更早地從受抑制轉為被誘導,同樣與NP 的積累濃度有關。 NP 會對貽貝體內GST 的活力產生劑量依賴性的誘導,并且在凈化期持續(xù)作用[31]。 斑馬魚頭部GST 活力水平也表現出一定的濃度依賴性,但 50 μg·L-1和 100 μg·L-1組的差異并不顯著。內臟團GST 活力表現出時間依賴性,并且5 μg·L-1組的GST 活力在暴露期維持一定水平,同時50 μg·L-1組的GST 活力增速漸緩,表明內臟團的GST 活力會隨體內NP 濃度的平衡而維持在相應水平,該水平與暴露濃度呈正相關。 結合GST 活力與時間以及暴露濃度的關系,可知斑馬魚體內NP 的積累濃度是誘發(fā)GST 活力改變的主因,而不是體外的脅迫濃度,體內的GST 活力隨NP 暴露時間和暴露濃度變化而增強,其誘導作用表現出與體內NP 濃度相關的劑量效應[13]。 本研究中內臟團的GST 活力變化與野生貽貝的相同,表明內臟團中的GST 積極參與了NP 的代謝解毒過程,其活力變化對NP 的敏感性遠大于頭部和肌肉,證實了肝、腎作為代謝解毒的主要功能器官。 GST 活力受到抑制一般有2 種可能的原因:NP 與 GST 結合或 NP 使催化底物GSH 的含量減少。 頭部 GST 在 5 μg·L-1組的活力低于對照水平,同時GSH 的含量卻沒有明顯下降,表明頭部GST 活力下降的原因可能是低濃度水平的NP 通過結合GST 使其活力下降[32],高濃度NP使GST 活力上升可能是因為NP 在短期內達到一定水平后激活了相關代謝酶的活動。 抗氧化酶的活力變化依賴于體內NP 的積累濃度和一定濃度水平的維持時間。

綜上所述,NP 對斑馬魚表現出中等毒性,斑馬魚內臟團中的CAT 和GST 的活力變化能較好地反映體內NP 積累濃度的變化,頭部的抗氧化酶活力變化可作為NP 早期污染的敏感指標。