曹茹冰, 鄭毅,2, 孫仕仙,* , 張坤, 鄧志華, 吳珂

1. 西南林業(yè)大學(xué)國家高原濕地研究中心/濕地學(xué)院,昆明 650224

2. 云南開放大學(xué)鄉(xiāng)村振興教育學(xué)院,昆明 650223

3. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護學(xué)院,昆明 650201

4. 西南林業(yè)大學(xué)生態(tài)與環(huán)境學(xué)院/云南省山地農(nóng)村生態(tài)環(huán)境演變與污染治理重點實驗室,昆明 650224

隨著我國城市化進程的加速以及工業(yè)、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的快速發(fā)展,重金屬、農(nóng)藥等有害污染物滲入土壤。 而土壤污染具有隱蔽性、潛伏性和長期性等特點,容易被人忽視,其造成的嚴(yán)重后果可通過不同暴露途徑給動物和人類健康帶來危害[1]。

2014年政府公布的土壤污染報告顯示,我國土壤被重金屬和農(nóng)藥污染總超標(biāo)率為16%,其中,鎘(cadmium, Cd)的點位超標(biāo)率高達7.0%[2]。 而對于我國設(shè)施農(nóng)田土壤Cd 污染,南方重于北方,西南、中南地區(qū)土壤重金屬超標(biāo)范圍較大[3],特別是西南高鎘地質(zhì)背景區(qū)的農(nóng)田土壤,由于其酸性土壤、環(huán)境因素和設(shè)施農(nóng)業(yè)發(fā)展等原因使土壤弱酸提取態(tài)Cd占比高,從而增加其生物可利用性,導(dǎo)致作物中更容易富集Cd,大大增加了農(nóng)作物Cd 污染風(fēng)險,對農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全構(gòu)成威脅[4-5]。 農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中,農(nóng)田雜草是引起農(nóng)作物減產(chǎn)的重要因素之一,除草劑在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的使用量呈上升趨勢,而三嗪類除草劑用量更是位居前五[6]。 撲草凈(prometryne),是一種三嗪類、低毒、高選擇的內(nèi)吸性除草劑,具有殺草譜廣、藥效長等優(yōu)點[7],被廣泛運用于多種作物、蔬菜、中草藥、茶園和果樹等雜草防除,甚至用于水產(chǎn)養(yǎng)殖[8]。 研究發(fā)現(xiàn),撲草凈在土壤中半衰期為1 ~3個月,其殘留長達13個月[9],在土壤中還可通過微型生物的降解作用產(chǎn)生一系列具有潛在毒理效應(yīng)的代謝產(chǎn)物,這些物質(zhì)的存在都有可能通過食物鏈及食物網(wǎng)的傳遞對生態(tài)環(huán)境中的各級生物造成急性、慢性或遺傳毒性,從而破壞生態(tài)平衡[10],對農(nóng)產(chǎn)品安全、生態(tài)環(huán)境造成巨大影響[11]。

近年來,復(fù)合污染引起人類的廣泛關(guān)注,同時也成為環(huán)境科學(xué)研究的重點和熱點[12-13]。 有研究表明,復(fù)合污染物會對諸如魚類[14]、蚯蚓[15]和哺乳類[16]等生物產(chǎn)生較為顯著的聯(lián)合毒性效應(yīng)[17]。 蚯蚓在土壤生態(tài)系統(tǒng)中較為常見,數(shù)量大、分布廣,在土壤中生存時與各類污染物均有密切接觸,并對污染物感知敏感[18]。 由于對外界環(huán)境因子敏感度較高,蚯蚓的生態(tài)毒性指標(biāo)又可反映化學(xué)污染物的毒性效應(yīng),因此成為土壤污染毒性效應(yīng)和土壤污染狀況的指示生物[19]。 當(dāng)蚯蚓遭到外源污染物脅迫后體內(nèi)會積累活性氧自由基(ROS),累積超過一定水平會造成機體氧化損傷,并且也會使蚯蚓機體內(nèi)的抗氧化酶活性發(fā)生變化[20]。 Huang 等[21]通過微塑料和Cd共同暴露實驗得出,隨著污染物含量的增加,28 d后微塑料(microplastics, MPs)和Cd 可顯著誘導(dǎo)蚯蚓產(chǎn)生更高的回避反應(yīng),蚯蚓體質(zhì)量減輕、繁殖減少。MPs 和 Cd 聯(lián)合抑制超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)和過氧化物酶(peroxidase, POD)活性,同時提高谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-Px)活性和丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量;并且微塑料改變了Cd 的有效性而加劇Cd 對蚯蚓的毒性。 宋欣媛等[22]發(fā)現(xiàn)在相同時間條件下,草甘膦和撲草凈作用下蚯蚓體內(nèi)蛋白質(zhì)含量變化趨勢為先升高后降低,同時撲草凈和草甘膦對蚯蚓體內(nèi)乙酰膽堿酯酶(acetyl cholinesterase, AChE)酶活性有抑制作用。

目前,混合污染物對蚯蚓的毒性已有報道,這些研究主要集中在金屬化合物上[23],其中關(guān)于Cd 對蚯蚓毒理學(xué)研究較多[24],撲草凈的研究多集中于水生動植物、浮游植物等方面[25],但沒有關(guān)于Cd-撲草凈復(fù)合污染方面的研究。 為探究Cd-撲草凈對蚯蚓的毒性效應(yīng),本研究采用濾紙接觸法、人工土壤法測定不同暴露時間和暴露濃度下蚯蚓的中毒狀況以及機體中抗氧化酶(SOD、CAT 和POD)活性、解毒酶谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)活性和MDA 含量等指標(biāo)的變化,旨在掌握Cd-撲草凈對蚯蚓抗氧化系統(tǒng)的劑量-效應(yīng)關(guān)系,為評價蚯蚓作為Cd-撲草凈復(fù)合污染的指示生物的指標(biāo)篩選提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實驗材料

1.1.1 供試動物

實驗動物為赤子愛勝蚓(Eisenia foetida),在山東棗莊蚯蚓養(yǎng)殖基地購買。 蚯蚓放在溫度為(20±2)℃、光暗比為12 h∶12 h 的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 周,選擇生殖環(huán)帶健康、體質(zhì)量250 ~400 mg 的成年蚯蚓測定不同酶活性指標(biāo)。

1.1.2 供試土壤

由15%苔蘚泥炭細土、25%高嶺黏土(高嶺土＞50%)[26]、60%工業(yè)石英砂粒(含50%以上0.05 ~0.2 mm 細小顆粒)等物質(zhì)均勻混合為人工土壤,對蚯蚓進行培養(yǎng)。 每一處理質(zhì)量為5 000 g,依次將各種成分加入到長49 cm×寬14 cm×高21 cm 的長方形塑料花盆中混勻,并在花盆底部打孔保持通風(fēng)。

1.1.3 藥品試劑及儀器

藥品試劑:供試藥品97%撲草凈標(biāo)準(zhǔn)品購買于濟南仁諾化工有限公司;Cd 選用 98% CdCl2·2.5H2O,購買于昆明盤龍華森有限公司。 SOD 試劑盒、POD 試劑盒、CAT 試劑盒、GST 試劑盒及MDA 試劑盒均由蘇州科銘生物技術(shù)有限公司(中國)提供。

主要儀器設(shè)備:萬分之一電子天平(ATX224,島津企業(yè)管理(中國)有限公司,中國);臺式高速冷凍離心機(3-15K,德國SIGMA 公司);酶標(biāo)儀(MD SpectraMax Plus 384,美谷分子儀器(上海)有限公司,中國);智能人工氣候箱(RQX-400H,上海躍進醫(yī)療器械有限公司,中國);樣品分樣、粉碎、篩分系統(tǒng)(MM400+AS200,德國 RETSCH(萊馳)公司)。

1.2 染毒濃度及染毒方式

1.2.1 濾紙接觸法

將撲草凈溶于甲醇(分析純),并用甲醇由高濃度向低濃度逐級稀釋;Cd 溶于去離子水,用去離子水進行逐級稀釋。 分別配成系列濃度梯度的溶液。單一污染物 Cd 濃度設(shè)定為 0、50、100、150、200 和250 mg·L-1;撲草凈濃度設(shè)定為 0、5、50、100、150 和200 mg·L-1。 每一處理組3個平行,每個平行分別加入15 條體質(zhì)量、大小相近的蚯蚓(約350 mg)。 在玻璃培養(yǎng)皿內(nèi)鋪襯1 層濾紙,吸取1 mL 配制好的溶液分別均勻灑在濾紙上;其中撲草凈空白對照組將1 mL 甲醇均勻地灑在濾紙上,待甲醇揮發(fā)干后加入蒸餾水2 mL 潤濕濾紙;同時將培養(yǎng)好的蚯蚓取出、洗凈,用新濾紙吸干蚯蚓體表水分,放入培養(yǎng)皿中,扎孔保鮮膜封口。 在試驗開始后第24、48 小時進行觀察,記錄蚯蚓死亡率、中毒癥狀,實驗過程用鑷子觸碰蚯蚓頭部、尾部,無反應(yīng)視為已死亡。

1.2.2 人工土壤法

為進一步探索Cd 和撲草凈對赤子愛勝蚓的氧化脅迫效應(yīng),采用人工土壤法進行研究。 據(jù)文獻確定預(yù)期毒性中值,以該值為中間劑量組,以3 倍之差上、下各推一個劑量組做預(yù)試驗,找出Cd 和撲草凈的最大致死濃度(LC100) 以及最小致死濃度(MLC)[2,9,27]。 根據(jù)預(yù)試驗結(jié)果在 MLC 和 LC100區(qū)間內(nèi)設(shè)置各污染物溶液濃度:設(shè)置Cd 毒性濃度為0、30、60 和90 mg·kg-1;除草劑撲草凈的實驗濃度設(shè)置成0 mg·kg-1和10 mg·kg-1。 毒性處理時,每個處理組稱取5 000 g 土壤,其中撲草凈處理組先將甲醇與其中1 000 g 的土壤混合均勻,放入通風(fēng)廚將甲醇揮發(fā)后和剩余4 000 g 土壤混合均勻,同時將人工土壤含水率大致保持在40%,對照組同上述操作。 染毒濃度操作時從對照組開始,由低到高依次處理。 每一處理均設(shè)有3個平行組,以及CK 對照組。 復(fù)合污染物濃度依照單一污染物的土壤毒性而設(shè)定,設(shè)置對照組,分別在7、14、21 和28 d 各處理組中選擇蚯蚓20 條,放置在玻璃培養(yǎng)皿中用于酶活性測定。

蚯蚓酶液的制備:蚯蚓放置于墊有干凈濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中,將清腸后的蚯蚓用去離子水洗凈,將身體表面水漬用濾紙擦干,置入預(yù)冷的2 mL EP 管中,然后加入1 mL 勻漿緩沖液(250 mmol·L-1蔗糖、50 mmol·L-1Tris、1 mmol·L-1EDTA、1 mmol·L-1DTT,混合,定容至1 L,pH=7.5)[28],冰浴勻漿制成組織勻漿液。 將勻漿液放入2 mL 離心管,8 500 r·min-1、4 ℃離心 10 min,測定。

CAT 活性的測定采用徐鏡波等[29]的方法,每毫克組織蛋白每分鐘催化1 nmol H2O2降解定義為一個酶活性單位。 SOD 活性測定采用氮蘭四唑比色法[30]。 POD 活性采用愈創(chuàng)木酚比色法[31]測定,以每分鐘吸光度變化值表示酶活性的大小。 GST 活性參照Habig 等[32]所用方法進行測定,通過測定25℃、340 nm 條件下反應(yīng)液的吸光度值來確定GST活性的大小。 MDA 含量測定采用硫代巴比妥酸比色法[33]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS 26.0 軟件進行計算和分析,并利用單因素方差分析方法中的LSD 檢驗進行差異顯著性分析。

2 結(jié)果(Results)

2.1 Cd、撲草凈單一暴露下赤子愛勝蚓中毒癥狀

單一重金屬污染對蚯蚓產(chǎn)生潛在的毒性效應(yīng)如圖 1 所示,在 0 mg·L-1和 5 mg·L-1Cd 暴露下,蚯蚓未出現(xiàn)斷裂或死亡;當(dāng)Cd 濃度達100 mg·L-1、暴露時間達12 h 時,蚯蚓開始出現(xiàn)環(huán)帶腫大和自溶;Cd濃度增加到150 mg·L-1、暴露48 h 時蚯蚓便出現(xiàn)出血和尾部呈串珠狀現(xiàn)象。 在濃度達200 mg·L-1和250 mg·L-1時,蚯蚓暴露 12 h 后出現(xiàn)死亡狀況,暴露時間到24 h 時250 mg·L-1Cd 處理組蚯蚓死亡率大幅度提高,但有蚯蚓存活,說明250 mg·L-1的Cd對蚯蚓機體損傷程度較200 mg·L-1嚴(yán)重。 蚯蚓的中毒癥狀可概括為:蚯蚓更加柔軟,易腐爛,有自溶現(xiàn)象;環(huán)帶腫漲,出血并滲出黃色體液,周圍濾紙有明顯紅色染跡;身體有斷裂現(xiàn)象,活動能力減弱;有抱團現(xiàn)象。 蚯蚓的死亡率隨染毒時間延長呈上升趨勢。

圖1 鎘暴露對蚯蚓(Eisenia foetida)形態(tài)學(xué)的影響注:(a) 空白對照組正常蚯蚓;(b) 黃色體液滲出;(c) 生殖環(huán)帶腫大;(d) 體色變黑;(e) 尾部串珠狀;(f) 身體腫大。Fig.1 The effect of cadmium on the morphology of Eisenia foetidaNote: (a) Normal healthy earthworms in control group; (b) Yellow fluid exudation; (c) Enlargement of the genital girdle;(d) The body color turns black; (e) Beaded tail; (f) The body became swollen.

如圖2 所示,撲草凈暴露下蚯蚓的中毒癥狀與Cd 相似,在 0 mg·L-1和 50 mg·L-1暴露組,蚯蚓未出現(xiàn)斷裂或死亡;當(dāng)濃度達50 mg·L-1、暴露時間達12 h 時,蚯蚓開始出現(xiàn)環(huán)帶紅腫變大和黃色體液滲出;撲草凈濃度增加到100 mg·L-1、暴露48 h 時蚯蚓便出現(xiàn)出血和尾部串珠狀現(xiàn)象。 當(dāng)濃度達150 mg·L-1和200 mg·L-1時,蚯蚓暴露12 h 后開始出現(xiàn)死亡狀況,24 h 時200 mg·L-1暴露組蚯蚓死亡率較高,而150 mg·L-1暴露組蚯蚓有存活跡象,說明200 mg·L-1的撲草凈對蚯蚓機體損傷程度較150 mg·L-1嚴(yán)重。 蚯蚓中毒癥狀表現(xiàn)為:身體松軟,外界觸碰下略有反應(yīng),置于陽光下反應(yīng)變慢,有黃色體液滲出,蚯蚓身體顏色發(fā)黑、濾紙有血色暈染痕跡,生殖環(huán)帶腫大,尾部有串珠現(xiàn)象,有斷尾現(xiàn)象。

圖2 撲草凈暴露對蚯蚓(Eisenia foetida)形態(tài)學(xué)的影響注:(a) 空白對照組正常蚯蚓;(b) 黃色體液滲出;(c) 生殖環(huán)帶腫大;(d) 體色變黑;(e) 尾部串珠狀;(f) 身體腫大并出血。Fig.2 The effect of prometryne on the morphology of Eisenia foetidaNote: (a) Normal healthy earthworms in control group;(b) Yellow fluid exudation; (c) Enlargement of the genital girdle;(d) The body color turns black; (e) Beaded tail; (f) The body became swollen and bled.

2.2 Cd、撲草凈暴露對赤子愛勝蚓的急性毒性效應(yīng)

如表1 所示,蚯蚓的死亡率與Cd 和撲草凈暴露濃度呈一定的線性關(guān)系。 染毒24 h 時,Cd 24 h-LC50值為 163.821 mg·L-1,撲草凈 24 h-LC50值為46.469 mg·L-1。 染毒 48 h 時,Cd 和撲草凈 48 h-LC50分別為 96.336 mg·L-1和 18.149 mg·L-1,毒性分別增強1.7 倍和2.6 倍。

表1 鎘、撲草凈暴露對蚯蚓的急性毒性效應(yīng)Table 1 The acute toxic effect of cadmium and prometryne on Eisenia foetida

2.3 Cd、撲草凈暴露對蚯蚓抗氧化酶活性的影響

2.3.1 Cd 單一及與撲草凈復(fù)合作用對蚯蚓SOD活性的影響

Cd 在不同暴露濃度和暴露時間對蚯蚓體內(nèi)SOD酶活性的影響如圖3 所示。 暴露7 d 時,各濃度處理組SOD 活性較對照組低,各處理組與對照組無顯著性差異(P＞0.05);暴露14 d 時,不同濃度組SOD活性激活,與對照組差異顯著(P＜0.05),其中60 mg·kg-1組活性最大;在21 ~28 d 不同濃度處理組SOD活性存在不同程度的降低趨勢。 在7 ~28 d 蚯蚓體內(nèi)SOD 活性整體表現(xiàn)為抑制-激活-抑制,隨時間變化蚯蚓機體組織受到外界影響損傷增大,使蚯蚓體內(nèi)SOD 活性降低。 7 ~28 d 復(fù)合組蚯蚓SOD 活性表現(xiàn)為升高-降低走勢。 暴露 7 d 時,(Cd 90 mg·kg-1+P 10 mg·kg-1)處理組蚯蚓SOD 活性被激活并且活性高于對照組,復(fù)合組SOD 活性總體上與對照組、撲草凈單一組相比無顯著差異(P＞0.05);暴露14 d 時,各復(fù)合處理組SOD 活性均被激活,其中(Cd 60 mg·kg-1+P 10 mg·kg-1)處理組 SOD 活性達到最大值;21 d 時,(Cd 30 mg·kg-1+P 10 mg·kg-1)處理組蚯蚓SOD 活性達到最大,在28 d 其他各復(fù)合處理組活性均降低;撲草凈單一組在7 ~28 d 時SOD 活性均被激活。

圖3 鎘單一染毒(a)及鎘-撲草凈復(fù)合染毒(b)對蚯蚓超氧化物歧化酶(SOD)活性的影響注:不同小寫字母表示處理間差異顯著(P＜0.05)。Fig.3 Effects of cadmium single exposure (a) and cadmium-prometryne compound exposure (b)on superoxide dismutase (SOD) activity of earthwormsNote: The different lowercase letters indicate significant differences among treatments (P＜0.05).

2.3.2 Cd 單一及與撲草凈復(fù)合作用對CAT 活性的影響

Cd 在不同暴露濃度和暴露時間對蚯蚓體內(nèi)CAT 酶活性的影響如圖4 所示。 蚯蚓在Cd 單一染毒后,不同濃度處理組CAT 活性有不同趨勢。 對照組CAT 活性比較穩(wěn)定,波動較小。 暴露7 d 時,不同處理組CAT 活性均被抑制,說明在染毒初期不同濃度Cd 對蚯蚓機體造成氧化損傷,阻礙CAT 發(fā)揮作用,使得蚯蚓體內(nèi)CAT 活性降低;暴露14 d 時,除高濃度處理組外,其他組CAT 活性均被誘導(dǎo)上升,這可能是蚯蚓機體為應(yīng)對氧化脅迫所產(chǎn)生過量的H2O2,進而激活CAT 活性,而高濃度處理組中蚯蚓受到較大的氧化脅迫影響,使CAT 受到抑制;暴露21 d 時,60 mg·kg-1處理組 CAT 活性顯著高于對照組(P＜0.05);暴露 28 d 時,60 mg·kg-1和 90 mg·kg-1處理組與對照組相比無顯著差異(P＞0.05)。

圖4 鎘單一染毒(a)及鎘-撲草凈復(fù)合染毒(b)對蚯蚓過氧化氫酶(CAT)活性的影響Fig.4 Effects of cadmium single exposure (a) and cadmium-prometryne compound exposure (b)on catalase (CAT) activity of earthworms

在暴露7 ~28 d 時,不同濃度組CAT 活性隨暴露時間延長和暴露濃度增大呈升高趨勢,且活性高于Cd 單一作用組;單一撲草凈暴露組CAT 活性在試驗期內(nèi)隨暴露時間延長呈升高趨勢。 暴露7 d時,各復(fù)合處理組CAT 活性未被激活;在14 ~28 d時,各組CAT 活性有所激活,其中(Cd 60 mg·kg-1+P 10 mg·kg-1)處理組CAT 活性在第28 天達到最大值。

2.3.3 Cd 單一及與撲草凈復(fù)合作用對蚯蚓POD活性的影響

Cd 在不同暴露濃度和暴露時間對蚯蚓體內(nèi)POD 酶活性的影響如圖5 所示。 暴露第7 ~14 天時,各處理組POD 活性被激活呈上升趨勢;90 mg·kg-1處理組POD 在第14 天達到最大值;暴露21 ~28 d 時,各處理組POD 活性降低受到抑制,在染毒第28 天,各處理組POD 活性仍被抑制,活性降至最低。 總體來看蚯蚓POD 活性表現(xiàn)為先升高后降低。

圖5 鎘單一染毒(a)及鎘-撲草凈復(fù)合染毒(b)對蚯蚓過氧化物酶(POD)活性的影響Fig.5 Effects of cadmium single exposure (a) and cadmium-prometryne compound exposure (b)on peroxidase (POD) activity of earthworms

第7 ~28 天時,復(fù)合處理組蚯蚓體內(nèi)POD 的活性先升高后降低,在7 ~21 d 高于撲草凈單一組;撲草凈單一作用組POD 活性隨暴露時間延長逐漸降低。 在暴露14 d 時,(Cd 60 mg·kg-1+P 10 mg·kg-1)處理組POD 活性升高并達到最大值;暴露28 d 時,各處理組POD 活性受到抑制并降到最低。

2.4 Cd 單一及與撲草凈復(fù)合作用對蚯蚓GST 活性的影響

Cd 在不同暴露濃度和暴露時間對蚯蚓體內(nèi)GST 酶活性的影響如圖6 所示。 暴露7 d 時,各處理組GST 活性處于激活狀態(tài);第14 天活性下降,在21 d 各處理組 GST 活性上升、28 d 下降。 在整個試驗期內(nèi)各處理組隨暴露濃度增加和暴露時間延長GST 活性呈升高-降低-升高-降低的趨勢。

圖6 鎘單一染毒(a)及鎘-撲草凈復(fù)合染毒(b)對蚯蚓谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)活性的影響Fig.6 Effects of cadmium single exposure (a) and cadmium-prometryne compound exposure (b)on glutathione S-transferase (GST) activity of earthworms

除(Cd 30 mg·kg-1+P 10 mg·kg-1)、(Cd 60 mg·kg-1+P 10 mg·kg-1)復(fù)合處理組蚯蚓體內(nèi)GST 活性在7 ~14 d 未被激活外,其他處理組GST 活性呈現(xiàn)激活狀態(tài)。 暴露7 d 時,相較于對照組,(Cd 30 mg·kg-1+P 10 mg·kg-1)、(Cd 60 mg·kg-1+P 10 mg·kg-1)處理組GST 活性明顯低于對照組(P＜0.05);在暴露21 d,(Cd 90 mg·kg-1+P 10 mg·kg-1)處理組 GST 活性升高,顯著高于對照組(P＜0.05)。 撲草凈單一組在整個試驗周期一直處于被激活狀態(tài)。

2.5 Cd 單一及與撲草凈復(fù)合作用對蚯蚓MDA 含量的影響

Cd 不同暴露濃度和暴露時間對蚯蚓體內(nèi)MDA含量的影響如圖7 所示。 在整個暴露期各組蚯蚓體內(nèi)MDA 含量變化和空白對照組相比變化趨勢較小,低濃度處理組MDA 含量在第14 天被激活且達到最大值;高濃度處理組MDA 含量在試驗周期內(nèi)呈升高-降低-升高趨勢,在第28 天達到最大值。 總體來說,蚯蚓體內(nèi)MDA 含量為升高后降低至對照水平的走勢。

圖7 鎘單一染毒(a)及鎘-撲草凈復(fù)合染毒(b)對蚯蚓丙二醛(MDA)含量的影響Fig.7 Effects of cadmium single exposure (a) and cadmium-prometryne compound exposure (b)on malondialdehyde (MDA) content of earthworms

在暴露7 ~28 d,復(fù)合處理組MDA 含量隨染毒濃度的增加和時間延長含量升高。 暴露14 d 時,(Cd 60 mg·kg-1+P 10 mg·kg-1)處理組 MDA 含量升高且達到最大值;高濃度復(fù)合組在整個周期內(nèi)呈現(xiàn)升高-降低趨勢,隨時間延長恢復(fù)至對照組水平,與對照組無顯著性差異(P＞0.05)。 在第28 天,各復(fù)合處理組MDA 含量逐漸降低并達到最低值。 撲草凈單一作用組MDA 含量隨時間延長整體呈升高-降低-升高趨勢。

3 討論(Discussion)

本研究以不同濃度的Cd 和撲草凈對蚯蚓進行急性毒性染毒試驗,觀測2 種污染物脅迫下蚯蚓中毒癥狀。 濾紙接觸法試驗結(jié)果表明,污染物濃度與蚯蚓死亡率之間存在劑量-效應(yīng)關(guān)系,濃度越高死亡率隨之上升;撲草凈對蚯蚓毒性大于Cd;重金屬的水溶性較強,有機污染物脂溶性較強,污染物在進入蚯蚓體內(nèi)后,毒性存在差異[34-36],造成蚯蚓中毒癥狀、個體形態(tài)不同(如在撲草凈染毒狀態(tài)下蚯蚓體色發(fā)黑、生殖環(huán)帶明顯紅腫變大)。

急性毒性試驗在生態(tài)毒理學(xué)研究中占據(jù)重要地位,濾紙接觸法具有便捷快速、易操作等特點,并通過接觸生物皮膚獲取污染物對其產(chǎn)生的毒性信息[37-38]。 不過此方法存在一定弊端,現(xiàn)實生態(tài)環(huán)境與濾紙接觸法所處環(huán)境有較大差異,生態(tài)環(huán)境中污染物對生物產(chǎn)生的毒性一方面取決于污染物本身毒性,另一方面受污染物所處環(huán)境(土壤、水等)的影響[39]。 因此,使用濾紙接觸法評估污染物對生物及生態(tài)環(huán)境產(chǎn)生的影響具有一定的局限性。 而人工土壤法可通過模擬蚯蚓生存環(huán)境反映污染物在生態(tài)環(huán)境中造成的影響[38-40],因此采用人工土壤法測定蚯蚓酶活性相關(guān)指標(biāo)。

3.1 Cd 單一及與撲草凈復(fù)合作用對蚯蚓抗氧化酶系的影響

SOD 是在生物體內(nèi)廣泛存在的金屬酶類[41],可消除氧化過程產(chǎn)生的超氧陰離子自由基[42],并將其生成過氧化氫(H2O2)和氧氣(O2),維持生物體內(nèi)自由基動態(tài)平衡,是生物體重要的抗氧化酶之一[43]。 細胞SOD 活性的變化反映了生物細胞中氧化應(yīng)激的變化,通常這種變化被認(rèn)為是環(huán)境污染的早期生物標(biāo)志[44]。 在Cd 單一暴露時,蚯蚓SOD 活性表現(xiàn)為抑制-激活,在第14 天蚯蚓體內(nèi)SOD 活性較空白對照組增強,Cd 脅迫使蚯蚓機體受損,ROS積累較多,破壞蚯蚓體內(nèi)自由基的動態(tài)平衡。 在Cd與撲草凈復(fù)合作用時,SOD 在前、中期被誘導(dǎo)上升,后期降低。 初期階段,單一組及復(fù)合組SOD 活性較對照組有所降低,因為,在受到外界污染物脅迫時蚯蚓機體進行自我保護,當(dāng)蚯蚓體內(nèi)原有的SOD 被消耗殆盡時,活性降低。 蚯蚓在接觸有毒物質(zhì)一段時間后,對當(dāng)下環(huán)境有所適應(yīng),SOD 也隨之被激活。而在有毒物質(zhì)的長期影響下,蚯蚓機體受損無法對抗積累過多的ROS,因此復(fù)合組SOD 活性與對照組相比有所降低,受到抑制。 王艷等[39]在研究鄰苯二甲酸酯類(PAEs)對蚯蚓體內(nèi)SOD 活性的影響時發(fā)現(xiàn),蚯蚓遭受逆境影響時SOD 活性被誘導(dǎo),隨著暴露濃度升高和暴露時間的延長生物體內(nèi)細胞膜受損氧化,酶活性降低。 劉嫦娥等[45]研究丁草胺和乙草胺對蚯蚓SOD 活性的影響時也發(fā)現(xiàn)酶活性表現(xiàn)為誘導(dǎo)-抑制。 Cd 與撲草凈復(fù)合組SOD 活性較Cd單一組活性高,原因可能是土壤具有一定的吸附能力并帶有負(fù)電荷,Cd 離子帶正電荷,Cd 離子被吸附,在一定程度上使SOD 活性升高[42,46]。

CAT 在抗氧化機制中發(fā)揮著重要作用,清除機體H2O2,避免細胞受到 H2O2的侵害[47]。 Cd 單一染毒時,蚯蚓CAT 活性總體表現(xiàn)為上升-下降。 染毒初期CAT 活性未被激活;在中期時CAT 被激活,抗氧化酶系統(tǒng)發(fā)揮作用;染毒后期,隨Cd 濃度升高、時間延長,CAT 活性降低,可能是受到長時間Cd暴露,體內(nèi)污染物大量富集使得機體細胞受損嚴(yán)重,無法處理過量H2O2,最終CAT 活性降低。 與平令文等[48]的研究結(jié)果相似,其研究發(fā)現(xiàn)蚯蚓在受鄰苯二甲酸二乙酯(DEP)暴露的前期、后期CAT 活性受到抑制,與對照組無顯著差異,而在受DEP 暴露的中期蚯蚓機體為對抗過量的H2O2,體內(nèi)CAT 酶活性發(fā)揮作用由此被激活而升高。 Cd 與撲草凈復(fù)合暴露時,CAT 活性為逐漸升高趨勢,且活性較Cd、撲草凈單一作用時有所上升。 在第7 天復(fù)合組蚯蚓體內(nèi)CAT 活性低于Cd 單一處理組,也低于空白對照組,在復(fù)合作用下其毒性大于單一Cd 污染毒性,使蚯蚓體內(nèi)ROS 含量升高。 伴隨染毒時間的延長蚯蚓受到氧化脅迫影響,同時在SOD 共同作用下蚯蚓體內(nèi)CAT 活性升高;蔡文貴等[49]研究鄰苯二甲酸二乙基己酯(DEHP)對翡翠貽貝(Perna viridis)內(nèi)臟中的酶活性影響時,也發(fā)現(xiàn)CAT 有相同的變化現(xiàn)象。

POD 也屬于氧化還原酶,且是抗氧化酶系統(tǒng)中不可缺少的成員,對生物體代謝起一定的防御作用[47]。 在Cd 單一及與撲草凈復(fù)合暴露時,蚯蚓體內(nèi)POD 活性的變化趨勢是上升-下降并與對照組無較大差異。 在復(fù)合暴露初期,Cd 與撲草凈復(fù)合作用對蚯蚓產(chǎn)生的氧化脅迫使得POD 被激活,H2O2有一定程度消除;在復(fù)合暴露28 d 時,污染物的毒性增強使蚯蚓機體受損,因而各濃度組POD 活性降低,與對照組無顯著性差異。 Cd 與撲草凈復(fù)合污染時,POD 活性較Cd 單一作用時高,復(fù)合污染使蚯蚓機體對外界環(huán)境產(chǎn)生更大反應(yīng),由此生成較多的POD。 王飛菲等[38]在研究草甘膦對蚯蚓的氧化脅迫時發(fā)現(xiàn)低濃度草甘膦的暴露下,CAT 在清除H2O2時起首要作用,當(dāng) H2O2過量時 POD 協(xié)同發(fā)揮作用。

3.2 Cd 單一及與撲草凈復(fù)合作用對蚯蚓GST 活性的影響

GST 在生物體遭遇環(huán)境污染等逆境脅迫時可有效排除入侵機體的有毒污染物、細胞毒素和基因毒素等,維持生物體動態(tài)平衡[50]。 本實驗中,在Cd單一作用下隨著GST 活性升高有毒物質(zhì)有所清除,后期GST 活性降低。 在復(fù)合暴露期間,撲草凈的影響作用下,蚯蚓機體中GST 的活性單一Cd 污染組,說明生物體有一定的自我修復(fù)能力,但由于長時間受逆環(huán)境脅迫GST 活性下降與對照組無顯著差異。三氯卡班和Cd 的復(fù)合作用對蚯蚓GST 活性影響的試驗結(jié)果顯示,復(fù)合組在長時間污染暴露下機體有毒物質(zhì)積累過量,GST 合成受到影響,導(dǎo)致GST 活性下降[51]。 這與本試驗中經(jīng)過Cd 和撲草凈處理后,蚯蚓體內(nèi)GST 活性變化趨勢相一致。 在整個復(fù)合作用期間GST 活性高于Cd 單一作用的GST 活性,同時在此期間SOD 和CAT 活性被激活,說明蚯蚓體內(nèi)GST 起到排除有毒物質(zhì)的作用。

3.3 Cd 單一及與撲草凈復(fù)合作用對蚯蚓MDA 含量的影響

MDA 是膜脂過氧化最重要的產(chǎn)物并且會造成膜的損傷加劇、細胞的代謝功能無法正常發(fā)揮作用,學(xué)者采用MDA 含量來判斷細胞代謝以及其他功能損傷狀況[52]。 不論Cd 單一作用還是與撲草凈復(fù)合污染時,蚯蚓體內(nèi)MDA 含量可歸納為先升高后降低。 暴露初期蚯蚓在污染環(huán)境的脅迫下抗氧化酶系統(tǒng)未能及時發(fā)揮作用,ROS 增多細胞代謝功能減弱,蚯蚓體腔細胞受到損傷,MDA 含量升高。 鐘碧瑾等[53]發(fā)現(xiàn)有機磷農(nóng)藥隨著時間與濃度的增加沼水蛙蝌蚪(Hylarana guentheritadpole)機體 MDA 含量也增加。 在暴露后期,抗氧化酶活性系統(tǒng)有所恢復(fù)并發(fā)揮作用,同時土壤也具有一定的吸附能力,能吸收一部分有毒污染物含量,使MDA 含量有所降低。

通過人工土壤法對蚯蚓進行染毒研究,結(jié)果表明Cd 單一及與撲草凈復(fù)合暴露均能引起蚯蚓體內(nèi)抗氧化酶活性變化,機體內(nèi)自由基累積最終造成過氧化損傷。 實驗中所設(shè)定的污染物濃度較高,污染物在低劑量水平下對蚯蚓所造成的生態(tài)毒理效應(yīng)在本研究中沒有深入研究,因此有待進一步結(jié)合細胞、組織和基因表達來探索復(fù)合污染對蚯蚓所造成的生態(tài)毒性效應(yīng),為土壤風(fēng)險評估及早期預(yù)警提供理論依據(jù)。